利用表面增強拉曼光譜定量檢測植物激素脫落酸

張燕燕 李燦 蘇睿 李林澤 位文濤 李保磊 胡建東

摘要：植物激素脫落酸（Abscisic Acid ，ABA ）在調控植物生長和發育方面具有重要作用。然而，ABA 在植物組織中含量較低，迫切需要快速靈敏的檢測方法。本研究建立了一種基于適配體識別和表面增強拉曼光譜（ Surface-Enhanced Raman Spectroscopy ，SERS ）檢測的 ABA 快速、定量檢測方法。ABA 適配體修飾的納米金顆粒兼具 SERS信號增強和選擇性識別等特點，實現了復雜植物樣品基質中痕量 ABA 的快速、靈敏檢測。當 ABA 分子出現時，適配體將與 ABA 分子特異性結合，結合后的適配體折疊成 G-四聚體結構，將 ABA 分子包裹在四聚體結構內，拉近 ABA 分子與金納米顆粒之間的距離，獲得增強并穩定的 ABA 分子 SERS 信號。在適配體濃度優化的條件下，該方法檢測限為0.1?mol/L ，線性相關系數 R2=0.9855，重復性相對標準偏差（Relative Standard Deviation ，RSD ）≤6.71%，且 SERS 增強基底的穩定性良好（>6個月）。特別是，該方法用于小麥葉片中 ABA 的檢測，檢測結果與酶聯免疫吸附劑測定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay， ELISA ）具有良好的吻合度（相對誤差≤9.13%）。該研究為植物激素快速檢測提供了有效的解決方案。

關鍵詞：脫落酸;適配體識別;表面增強拉曼光譜;金納米顆粒;生物傳感器

中圖分類號：Q946.885;O657.37?????? 文獻標志碼：A?????????????? 文章編號：SA202202001

引用格式：張燕燕， 李燦， 蘇睿， 李林澤， 位文濤， 李保磊， 胡建東.利用表面增強拉曼光譜定量檢測植物激素脫落酸[J].智慧農業（中英文）， 2022， 4（1）：121-129.

ZHANG Yanyan， LI Can， SU Rui， LI Linze， WEI Wentao， LI Baolei， HU Jiandong. Quantitative determination of plant hormone abscisic acid using surface enhanced Raman spectroscopy[J]. Smart Agriculture， 2022， 4（1）：121-129.（in Chinese with English abstract）

1 引言

脫落酸（ Abscisic Acid ，ABA ）是小麥體內的一種內源激素，是小麥生長發育代謝產生的一種有機信號小分子，在極低濃度下，對小麥的生長具有顯著的生理效應，在小麥生長過程中起著至關重要的作用[1]。小麥生長的不同階段不同部位 ABA 的濃度含量不同，這直接關系到小麥種子的活力、抗倒伏能力、光合性能和抗旱性[2]。由于小麥的 ABA 濃度較低，大概在0.038～13.2 nmol/L [3]，因此為了定量或監測不同發育期的 ABA 濃度，實時監測小麥的生長發育狀況，惡劣環境對小麥生長的影響，靈敏快速的 ABA檢測方法非常重要。

截至目前，用于 ABA 的檢測技術主要有比色法（ Colorimetric Method ）[4]、局部表面等離子體共振 （ Local? Surface? Plasmon? Resonance， LSPR ）[5]、高效液相色譜儀（High Performance Liquid? Chromatography ， HPLC ）[6]、電化學法（ Electrochemical Method ）等[7]。這些方法雖然具有足夠的準確性，但仍存在樣品前處理繁瑣、檢測成本高、時間長、需要專業操作人員等缺點[8]。因此，有必要建立一種簡單、高靈敏度的植物樣品中 ABA的微量檢測方法。

表面增強拉曼光譜（ Surface-Enhanced Ra‐ man Spectroscopy ， SERS ）是一種強大的分子振動光譜技術，它可以提供目標分子的特定指紋信息[9-12]。隨著傳感技術與激光技術的發展，SERS 技術已廣泛應用于化學分析[13-15]、生物醫學成像[16]、環境和食品檢測[17]等領域。然而，由于 SERS 產生“熱點”的波動，定量的 SERS 仍面臨一些挑戰。產生均勻熱點的關鍵在于利用納米金或銀基底盡可能穩定地增強 SERS信號，除了可以通過合成高質量的貴金屬納米顆粒以外，借助于對分析物分子有特殊捕獲能力的抗體或者適配體來增強拉曼信號的方法也越發常見[18]。Man 等[19]構建了一個通用的生物分子檢測平臺，將Schizotype適配體與光誘導增強拉曼光譜效應相結合，用于超靈敏檢測三磷酸腺苷、可卡因和凝血酶。該研究表明適配體在生物傳感方面可以代替抗體來捕獲目標分子，適配體結合 SERS方法具有較高的靈敏度。Hu等[5]利用適配體結合局域表面等離子共振 （ Localized Surface Plasmon Resonance ，LSPR ）的方法對 ABA進行了定量研究，結果證明，ABA 的適配體對 ABA 分子有較好的識別能力，可以作為構建 ABA 生物傳感器的識別單元。另外，利用 SERS法對 ABA的定量研究還處于起步階段，目前還未發現 SERS方法結合適配體的相關文獻。

當檢測體系中有脫落酸存在時，適配體與脫落酸分子特異性結合，適配體的構象轉變為 G四聚體樣結構，將 ABA 分子包裹在四聚體結構之間，拉近并固定脫落酸分子與納米金顆粒之間的距離，使得脫落酸分子的拉曼信號強度穩定且增加?；谶@一原理，本研究主要以基于 SERS的植物激素 ABA定量檢測生物傳感器為研究對象，以納米金粒子作為拉曼探針，適配體作為捕獲探針修飾在納米金顆粒上，構建了一種靈敏、快速的適配體傳感器并實現對植物激素 ABA 定量檢測。

2 材料與試驗方法

2.1材料和儀器

本試驗所用的四氯金酸四水合物（ HAuCl4·4H2O ）、硝酸銀（AgNO3）、 L-抗壞血酸（ AA ）購買于阿拉丁試劑有公司（中國上海）;脫落酸粉末（ ABA ）、檸檬酸二水合鈉 （ C6H5Na3O7·2H2O ）、聚乙二醇山梨糖單月金酸酯（ Tween20）購自 Sigma-Aldrich （美國）。試驗中 ABA溶液的配置需要注意，分析天平取0.264 g的 ABA 粉末用0.5 mL 的無水乙醇完全融化，加水定容至10 mL作為母液，密封冷藏;定容后 ABA溶液的濃度為100 mmol/L ，試驗中使用的 ABA 溶液采用母液加水稀釋到使用濃度。脫落酸適配體購買于生工生物工程（上海）股份有限公司，序列號為： HS-5'-ATG GGT TAG GTG GAG GTG GTT ATT? CCG? GGA ATT? CGC? CCT AAA TAC GAG CAA C-3'[20]。所有溶液制劑均采用超純水，使用的玻璃器皿均采用王水[ HCl：HNO3=3：1（v/v）] 清洗，試驗前用超純水多次沖洗。

合成納米金顆粒的紫外-可見光譜用紫外可見分光光度計（南京菲勒儀器有限公司，南京，中國）記錄。利用透射電子顯微鏡（ JEOL JEM-1400 Plus ，Tokyo ，Japan）在120 kV加速電壓下獲得納米金顆粒的透射電子顯微鏡（ Transmis‐sion Electron Microscope ， TEM ）圖像。離心前用0.05% TWeen20溶液沖洗所有離心管，以防止納米顆粒吸附在管壁上。SERS 信號由共焦拉曼顯微系統（先鋒科技有限公司，北京，中國）采集。

2.2納米金顆粒合成

將裝有100 mL 、0.01%氯金酸溶液的錐形燒杯置于磁力加熱攪拌器上，輕輕攪拌，加熱溫度設置為120°C 。溶液煮沸后，調節攪拌器為劇烈攪拌模式，同時快速加入1 mL 、1%的檸檬酸三鈉溶液，10 s 后溶液的顏色依次變色為灰、黑、藍，最后逐漸穩定在紫紅色， 10 min 后關閉熱源，繼續攪拌溶液至室溫，冰箱冷藏待進一步利用。

2.3適配體修飾納米金顆粒

將 ABA 適配體包裹在納米金顆粒表面制備捕獲探針。將濃度為0.12μmol/L ，3μL 活化后的巰基適配體 SH-Apt 加入到3 mL Au NPs 溶液中，室溫（25℃）孵育12 h 。以10，000 r/m離心10 min 去除未結合的適配體，將沉淀物分散在3 mL的超純水中備用。

2.4適配體濃度優化

核酸適配體濃度的大小與捕捉到 ABA 分子的多少以及檢測靈敏度、檢測限密切相關，因此，研究了適配體濃度分別在0.04、0.08、0.12和0.16μmol/L ， ABA 的濃度分別在1、5 和10 mmol/L 的條件下， ABA 拉曼光譜強度的變化，從而優化出最佳的適配體濃度。

2.5 ABA 檢測

以適配體修飾的納米金顆粒為表面增強拉曼的活性捕獲基底檢測來 ABA ，將50μL不同濃度的 ABA 溶液（1×10?7～1×10?4 mol/L ）與50μL 的適配體修飾的納米金顆粒溶液混勻靜置30 min 后，將10μL的混合物滴在干凈的硅片上，室溫干燥后進行 SERS檢測。拉曼儀器入射激光的功率設置為65 mW，曝光時間為10 s 。SERS 信號由共焦拉曼顯微系統（先鋒科技有限公司，北京，中國）采集。拉曼系統包括一個高穩定的暗場顯微鏡（ BX41，奧林巴斯，美國），一個共焦拉曼模塊和一個配備 CCD （1024×256像素傳感器，德國）的高分辨率光譜儀（安道爾科技，英國）。本研究中所有的拉曼光譜均在532nm激光輻射的10倍物鏡下采集。

2.6方法驗證

使用適配體 SERS傳感器檢測 ABA的真實樣品并與 ELISA 檢測結果做對比。ABA 的真實樣品提取方法為：取新鮮凍干的小麥葉片1.0 g ，液氮研磨后，用2 mL甲醇-水-甲酸（15：4：1，v/v/v）超聲提取20 min 后放入冰箱冷凍避光24 h ，在4℃條件下10，000 r/min離心10 min ，取上清液于4 mL 棕色瓶中避光;再次用1 mL 甲醇-水-甲酸重復提取2次，合并上清液，30℃條件下減壓蒸發致干，用 500μL 甲醇-水-乙酸（1800：200：1，v/v/v）復溶，4℃條件下10，000 r/min離心10 min后取上清液，待用。

3 結果與討論

3.1檢測原理

利用 SERS結合適配體修飾的納米金顆粒檢測植物激素脫落酸的原理如圖1所示，將納米金顆粒上修飾植物激素脫落酸的巰基適配體（ SH-Apt），巰基適配體與納米金顆粒之間形成Au-S 共價鍵結合。結合在納米金顆粒外部的適配體隨意自然伸長。當體系中有脫落酸存在時，任意分布的脫落酸適配體與 ABA 結合，伸長的適配體隨即折疊為 G 四聚體，將 ABA 分子包圍在 G 四聚體中間，這時 ABA 與納米金顆粒之間的距離拉近并且距離固定，ABA 分子不會隨意從納米金顆粒上脫落下來。離心后，將含有ABA 分子的納米金顆粒溶液進行拉曼檢測，由于 ABA 分子與納米金顆粒之間距離固定，那么ABA分子所產生的 SERS信號也將穩定，從而建立 ABA的濃度與 SERS強度之間的定量關系。

3.2納米金顆粒的表征

合成的納米金顆粒的 TEM 圖像如圖2（a）所示，從 TEM 圖中可知，合成的納米金顆粒大小一致，分布均勻，且紫外可見峰位于525 nm 左右，峰曲線窄而光滑，說明納米金顆粒的大小均勻。結合圖2（b）可知納米金顆粒的平均粒徑在60nm左右。

3.3適配體修飾納米金顆粒表征

將合成的納米金顆粒做 zeta 電勢表征，如圖3所示。檸檬酸三鈉還原的氯金酸溶液生成的納米金顆粒中含有帶負電的檸檬酸根離子，所以納米金顆粒帶負電。Zeta電勢表征納米金顆粒的電勢為-26 mW，帶巰基的適配體帶正電，將適配體修飾在納米金顆粒上之后，電勢為-10.7 mW，說明適配體成功修飾在納米金顆粒之上。

3.4適配體濃度優化

當 ABA溶液的濃度分別為1、5和10 mmol/L時，未結合適配體的裸金作為增強基底測得的 ABA溶液的 SERS強度平均值分別為1000、1400和2500。當 ABA 的濃度為1 mmol/L時，不同濃度的適配體修飾金納米顆粒后作為增強基底測得的 SERS強度的平均值分別為1400、2000、4500和2800;當 ABA 的濃度為5 mmol/L時，不同濃度適配體修飾納米金顆粒后作為增強基底測得的SERS強度的平均值分別為2030、3500、6020和4480;當 ABA的濃度為10 mmol/L時，不同濃度適配體修飾納米金顆粒后作為增強基底測得的SERS強度的平均值分別為2520、4680、6120和6300。將不同濃度的核酸適配體修飾納米金顆粒后結合 ABA分子所得的 SERS強度與未修飾適配體的納米金顆粒作為增強基底所得的 SERS強度比值做圖（圖4）。

由圖4可見，含有適配體的增強基底所測 SERS 值與不含適配體的裸金基底所測 SERS 值的比值逐漸增大，說明隨著適配體濃度的增大，捕獲的 ABA 分子增多，相應的 SERS 信號增強。當適配體濃度達到0.12?mol/L 時，含有適配體的增強基底所測 SERS值與不含適配體裸金基底所測 SERS值的比值達到最大。當適配體濃度達到0.16?mol/L 時，比值卻減小，說明隨著適配體濃度的進一步增大，捕獲的 ABA 分子卻沒有增多，相應的 SERS信號也沒有增強。這是因為當適配體的濃度大于0.12?mol/L 時，體系中存在多余的適配體會競爭系統中的 ABA 分子，導致結合在納米金顆粒上的 ABA 分子減少，從而 SERS 強度降低。因此，本試驗需用最佳的核酸適配體濃度為0.12?mol/L。

3.5 ABA 的檢測

為確認 ABA 拉曼峰的位置，取購買的 ABA 粉末在沒有增強的情況下的直接采集其拉曼光譜，圖5為 ABA 粉末的拉曼光譜及 ABA 的分子結構?？梢?ABA分子信號較強的拉曼峰有4個，分別是1637、1237、1050、615 cm-1，分別對應于 ABA 分子結構中碳碳雙鍵的伸縮振動、碳碳單鍵的伸縮振動、甲基的非平面擺動、碳碳單鍵的外扭式振動[21]。 1637 cm-1相對于其他特征峰相對較強，結合 ABA 分子的結構，1637 cm-1主要來自于碳碳雙鍵和碳碳單鍵的運動[22]，其中碳碳雙鍵的伸縮振動引起的拉曼散射最為劇烈，所以1637 cm-1可以作為 ABA 的拉曼特征峰用于植物激素 ABA的定性和定量檢測。

將不同濃度的 ABA 標準溶液與適配體修飾的納米金顆?；旌虾?，滴在硅片上干燥后進行SERS檢測，檢測光譜結果如圖6（a）所示。此檢測方法可以用來檢測 ABA的濃度，當 ABA的濃度為0.1μmol/L 時，也可以很清楚得看到1637 cm-1的特征峰，說明適配體修飾的納米金顆粒具有很好的檢測靈敏度。將 ABA 的濃度與1637 cm-1特征峰處的 SERS強度作出線性關系如圖6（b）所示，在0.1～100μmol/L 范圍內，R2=0.9855。

3.6重復性試驗

增強基底的重現性是 SERS檢測的關鍵，因此，研究了 SERS信號的重復性。在 ABA濃度為60μmol/L 條件下，隨機在基底上取20個點的SERS強度作為研究對象。在1637 cm-1處的20個隨機點的拉曼強度在1575到1608之間波動，拉曼光譜圖如圖7（a）所示，相應的柱狀圖如圖7（b）所示，相對標準偏差（ Relative Stan-dard Deviation ， RSD ）值為6.71%。一般認為，一個新的或現有的 SERS定量測量體系的重現性 RSD 應小于20%[23]。說明該適配體修飾的納米金顆粒 SERS生物傳感器可作為定量測量脫落酸含量的一種分析方法，且為后期研發更為靈敏的、特異性更強的 SERS生物傳感器奠定基礎。

3.7增強基底穩定性試驗

納米顆粒增強基底的穩定性是適配體 SERS 傳感器能夠用于實際檢測的關鍵，因此，對納米顆粒的穩定性進行試驗。制備好的適配體修飾的納米金顆粒在冰箱里4℃保存，分別在1、3、6和8個月后檢測其紫外可見光譜。如圖8（a）可知，適配體修飾的納米金顆粒在放置1個月和3個月時，LSPR 峰的位置幾乎不變，只是吸光度相應降低。在放置6個月之后，LSPR 峰發生紅移，但是移動量很小，且吸光度值也發生減小。

但是放置8個月之后，適配體修飾的納米金顆粒的 LSPR峰繼續紅移，紫外可見光譜變寬，說明納米金顆?？赡苡幸欢ǔ潭染奂?。

將放置不同時間的適配體修飾的納米金顆粒作為增強基底檢測10 mmol/L的脫落酸溶液，檢測結果如8（b）所示。在放置1個月時，ABA的SERS 強度幾乎不變;放置3個月時， ABA 的SERS 強度減小很小，大約為初始值的96%;放置6個月時，所測得的 ABA 強度的平均值為5000，大約是初始值的70%;放置8個月時，ABA的 SERS強度跟沒有修飾適配體的納米金顆粒的增強性差不多，大約為初始值的50%。由此可知，適配體修飾的納米金顆粒作為增強基底檢測脫落酸具有較長的保質期，其穩定性超過6個月。

3.8真實樣品檢測

為驗證所構建的 SERS傳感器對真實樣品的檢測能力，提取成熟期小麥葉片中的 ABA ，對提取液中 ABA 含量進行檢測，并將其檢測結果與酶聯免疫吸附測定（Enzyme Linked Immuno‐ sorbent Assay ，ELISA ）檢測結果進行對比分析，對比結果如表1所示。將 ELISA 法與 SERS 法進行比較，ABA含量的最大相對誤差為9.16%，說明兩種方法測試的結果具有一致性。

4 結論

合成高質量的納米金顆粒，對納米金顆粒進行紫外和 TEM 表征。在納米金顆粒上修飾 ABA 的巰基適配體作為 SERS 基底對 ABA 進行檢測，適配體與納米金顆粒之間形成 Au-S共價鍵結合。

優化適配體的濃度為0.12?mol/L ，在優化的條件下，該生物傳感器對 ABA 的檢測濃度可達0.1μmol/L ，在0.1～100μmol/L 范圍內，R2=0.9925，說明該方法的靈敏度較好。對基底上隨機選取的20個點進行基底的重現性分析，其RSD 值為6.71%，說明該基底的信號重現性較好。另外，該適配體修飾的納米金顆粒具有良好的穩定性，其壽命超過6個月。最后，提取 ABA的真樣樣品，利用該方法對 ABA真實樣品試驗，并與 ELISA檢測結果相對比，檢測結果最大相對誤差為9.16%。

該生物傳感器是利用 SERS對植物激素檢測的探索性研究，研究的結果將對 ABA 的后續定量和現場檢測，以及其他植物激素的檢測具有重要的參考價值。

參考文獻：

[1] ZHOU Q， ZHANG F， JI S， et al. Abscisic acid acceler‐ates postharvest blueberry fruit softening by promotingcell? wall? metabolism[J]. Hortic-Amsterdam， 2021，288： ID 110325.

[2] SHIBATA M， COELHO C， GARIGHAN D， et al. Seeddevelopment of Araucaria angustifolia： Plant hormonesand? germin? ability? in 2 years? of seeds production[J].New Forests， 2021， 52（5）：759-775.

[3] SIRKO A， WAWRZYNSKA A， BRZYWCZY J， et al.Control of ABA signaling and crosstalk with other hor‐mones by the selective degradation of pathway compo‐nents[J]. International? Journal? of Molecular? Sciences，2021， 22（9）： ID 4638.

[4] ZHOU G， LUO Y， XU Q， et al. Peptide-capped goldnanoparticle for colorimetric immunoassay of conjugat‐ed? abscisic? acid[J]. Acs Applied Materials? Interfaces，2021， 4（9）：5010-5015.

[5] WANG S， ZHANG H， ZEPHANIA B， et al. A multi-channel? localized? surface? plasmon? resonance? system for? absorptiometric? determination? of abscisic? acid by using gold nanoparticles functionalized with a polyade‐ nine-tailed? aptamer[J]. Microchimica Acta， 2020， 187（1）： ID 20.

[6] YAN S， GUO L， WU C， et al. Simultaneous determina‐tion of three kinds of endogenous hormones content in seeds? of post-harvest Yali? pear? by? high? performance liquid chromatography[J]. Chinese Journal of Analyti‐cal Chemistry， 2010， 38（6）：843-847.

[7] LI Y， XIA K， WANG R， et al. An impedance immuno‐sensor for the detection of the phytohormone abscisic acid[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry， 2008， 391（8）：2869-2874.

[8] FU J， SUN X， WANG J， et al. Progress in quantitativeanalysis of plant hormones[J]. Chinese Science Bulle‐ tin， 2011， 56（4-5）：355-366.

[9] WANG P， SUN Y， LI X， et al. Recent advances in met‐al organic frameworks based surface enhanced Raman scattering? substrates： Synthesis? and? applications[J]. Molecules， 3021， 26（1）： ID 209.

[10] DE? SOUZA M， OTERO J， LOPEZ-TOCON I. Com ‐parative performance of citrate， borohydride， hydroxyl‐ amine? and? beta-cyclodextrin? silver? sols? for? detecting ibuprofen and caffeine pollutants by means of surface- enhanced? Raman? spectroscopy[J]. Nanoterials， 2020， 10（12）： ID 2339.

[11] MOSKOVITS M. Surface roughness and the enhancedintensity? of Raman? scattering by? molecules? adsorbed on metals[J]. Journal of Physics and Chemistry of Sol‐ ids， 1978， 69（4）：4159-4162.

[12] MOSKOVITS M. How the localized surface plasmonbecame linked with surface-enhanced Raman spectros‐ copy[J]. Notes and Records of the Royal Society， 2012， 66（2）：195-203.

[13] PETTINGER B， WENNING U， WETZEL H. Surfaceplasmon enhanced Raman scattering frequency and an‐ gular resonance of Raman scattered light from Pyridine on? Au，? Ag? and? Cu? electrodes[J]. Surface? Science， 1980， 101（1-3）：409-416.

[14] BOYACK R， LE RU E. Investigation of particle shapeand? size? effects? in? SERS? using? T-matrix? calcula‐tions[J]. Physical? Chemistry? Chemical Physics， 2009，11（34）：7395-7405.

[15] QU L， GENG Y， BAO Z， et al. Silver nanoparticles oncotton? swabs? for? improved? surface-enhanced? Ramanscattering， and its application to the detection of carba‐ryl [J]. Microchimica Acta， 2016， 183（4）：1307-1313.

[16] LIU J， WHITE I， DEVOE D. Nanoparticle-functional‐ized porous polymer monolith? detection? elements? forsurface-enhanced? Raman? scattering[J].? AnalyticalChemistry， 2011， 83（6）：2119-2124.

[17] MAKAM P，? SHILPA R， KANDJANI A， et al. SERSand fluorescence-based ultrasensitive detection of mer‐cury in water[J]. Biosensors Bioelectronics， 2018， 100：556-564.

[18] LI J， ZHANG Y， DING S， et al. Core-shell nanoparti‐cle-enhanced? Raman? spectroscopy[J]. Chemical? Re‐views， 2017， 117（7）：5002-5069.

[19] MAN T， LAI W， XIAO M， et al. A versatile biomolecu‐lar? detection? platform? based? on? photo-induced? en‐hanced? Raman? spectroscopy[J]. Biosensors? Bioelec‐tronics， 2019， 147： ID 111742.

[20] GROZIO A， GONZALEZ V， MILLO E， et al. Selec‐tion? and characterization? of single? stranded DNA ap‐tamers for the hormone abscisic acid[J]. Nucleic AcidTherapeutics， 2012， 23（5）：322-331.

[21]張燕燕， 李冬賢， 馬劉正， 等.植物激素脫落酸分子的光譜與結構研究：理論與實驗[J].光譜學與光譜分析， 2021， 41（9）：2859-2865.

ZHANG Y， LI D， MA L， et al. Spectroscopic and struc‐tural studies of plant hormone abscisic acid molecules：Theory? and? experiment[J]. Spectroscopy? and? SpectralAnalysis， 2021， 41（9）：2859-2865.

[22] ZHANG Y， ZHANG H， LI D， et al. Surface-enhancedRaman? spectroscopy? for the? quantitative? detection? ofabscisic acid in wheat leaves using silver coated goldnanocomposites[J]. Spectroscopy? Letters， 2021， 54（10）：732-741.

[23] ZHOU? Z，? XIAO? R，? CHENG? S，? et? al. A? universalSERS-label immunoassay for pathogen bacteria detec‐tion based on Fe3O4@Au-aptamer separation and anti‐body-protein? a? orientation? recognition[J]. AnalyticalChimica Acta， 2021， 1160： ID 338421.

Quantitative Determination of Plant Hormone Abscisic Acid Using Surface Enhanced Raman Spectroscopy

ZHANG Yanyan1，2 ， LI Can1，2 ， SU Rui1，2 ， LI Linze1，2 ， WEI Wentao1，2 ，LI Baolei1，2 ， HU Jiandong1，2，3*

（1. College of Mechanical and Electrical Engineering， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China;

2. Henan International Joint Laboratory of Agricultural Laser Technology， Zhengzhou 450002， China;

3. State Key Laboratory of Wheat and Corn Crop Science， Zhengzhou 450002， China ）

Abstract： Plant hormone Abscisic Acid （ABA） plays an important role in regulating plant growth. However， the content of ABA in plant tissues is very low， and rapid and sensitive detection methods are urgently needed. In this study， a rapid and quantitative ABA detection method was established based on aptamer recognition and surface-enhanced Raman spectroscop （SERS）. The gold nanoparticles modified by ABA aptamer had the characteristics of SERS signal enhancement and selective recognition， re‐alizing the rapid and sensitive detection of trace ABA in complex plant sample matrix. When ABA molecules appeared in detect system， the aptamer would specifically bind with ABA molecules， and the aptamer folded into G-tetrad structure at same time， which wrapped ABA molecules in the tetrad structure， shortened the distance between ABA molecules and gold nanoparticles， and the enhanced and stable ABA molecules SERS signal were obtained. Under the condition of optimized aptamer concentra‐tion at 0.12?mol/L， different concentrations of ABA solutions in the detection system were detected. Within the concentration range of 0.1-100?mol/L， the SERS intensity of ABA presented a good linear relationship with the concentration. The detec‐tion limit of this method was 0.1?mol/L and the linear correlation coefficient R2 was 0.9855. The repeatability test of 20 points randomly on SERS substrate showed that the relative standard deviation （RSD） was 6.71%， indicating the stability of SERS sub‐strate was well. Furthermore， the substrate of gold nanoparticles modified by the ABA aptamer terminal with sulfhydryl group （SH-Apt） could be stored in the refrigerator for more than half a year， indicating that the substrate has good stability. Once the preparation of the synthesized SH-Apt modified gold nanoparticles was completed. It could be used on demand without the need to prepare SERS substrate for every detection. In this sense， the constructed aptamer SERS biosensor could realize the rap‐ id and quantitative detection of ABA. The method was used for the determination of ABA in wheat leaves， and the result was in good agreement with the Enzyme Linked Immunosorbent Assay （ELISA）（The max relative error was 9.13%）. This biosensor is an exploratory study on the detection of plant hormones by SERS， and the results of the study will have important reference val‐ue for the subsequent quantitative and on-site detection of ABA， as well as the detection of other plant hormones.

Key words： abscisic acid; aptamer recognition; surface-enhanced Raman spectroscopy; gold nanoparticles; biosensor