基于黑質-紋狀體多巴胺通路研究多發性抽動癥“肝風”發生發展機制及瀉青丸干預作用

周姍　謝靜　姚冰　陳佳　劉思佳　梁旋

〔摘要〕 目的 探討瀉青丸對多發性抽動癥（Tourette syndrome， TS）模型大鼠行為學及黑質-紋狀體多巴胺（dopamine， DA）通路的干預作用及TS“肝風”可能的微觀實質。方法 從50只大鼠中隨機抽取40只，均采用亞氨基二丙腈造模。造模成功后，將模型大鼠隨機分為模型組、硫必利組、瀉青丸高劑量組、瀉青丸低劑量組，未造模處理的大鼠作為空白組，每組10只。硫必利組予以鹽酸硫必利片混懸液30 mg/kg灌胃，空白組、模型組予以蒸餾水灌胃。瀉青丸低、高劑量組分別予以0.45、0.90 g/mL瀉青丸煎劑灌胃。各組均連續灌胃14 d。于造模7 d和灌胃7、14 d，記錄大鼠體質量、行為（包括刻板行為及運動行為）評分。灌胃14 d后，脫頸處死，斷頭取腦，采用ELISA法檢測紋狀體中DA、高香草酸（homovanillic acid， HVA）含量。結果 造模7 d和灌胃7、14 d，模型組運動和刻板行為評分均明顯高于空白組（P<0.05）。灌胃14 d，瀉青丸低、高劑量組運動和刻板行為評分均明顯低于模型組（P<0.01），且瀉青丸低、高劑量組運動和刻板行為評分均明顯低于硫必利組（P<0.05）。造模7 d、灌胃14 d，模型組體質量均明顯小于空白組（P<0.05）。灌胃14 d，瀉青丸低、高劑量組體質量均明顯大于模型組及硫必利組（P<0.05，P<0.01）。模型組DA、HVA含量均明顯高于空白組（P<0.05，P<0.01）。硫必利組、瀉青丸低劑量組、瀉青丸高劑量組DA、HVA含量均明顯低于模型組（P<0.01）。結論 瀉青丸能夠明顯改善TS模型大鼠刻板行為及異常運動行為，調節大鼠黑質-紋狀體DA通路中DA、HVA的代謝。DA的代謝紊亂可能是TS肝風失衡的內在微觀實質。

〔關鍵詞〕 多發性抽動癥;瀉青丸;亞氨基二丙腈;單胺類神經遞質;肝風

〔中圖分類號〕R272.3? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.05.012

Study on the occurrence and development mechanism of "liver wind" in multiple tic syndrome and the intervention effect of Xieqing Pill based on substantia-nigra striatum dopamine pathway

ZHOU Shan XIE Jing YAO Bing CHEN Jia LIU Sijia LIANG Xuan

（1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of Xieqing Pill on the behavior and substantia-nigra striatum dopamine （DA） pathway in Tourette syndrome （TS） model rats and the possible microsubstance of TS "liver wind". Methods 40 rats were randomly selected from 50 rats and were modeled with iminodipropyl nitrile. After modeling， the model rats were randomly divided into model group， tiapride group， Xieqing Pill high-dose group and Xieqing Pill low-dose group， the rats without modeling treatment were used as blank group， with 10 rats in each group. Tiapride group was given tiapride hydrochloride tablet suspension 30 mg/kg intragastric administration， and blank group and model group were given distilled water intragastric administration. Xieqing Pill high-dose group and Xieqing Pill low-dose group were given 0.45 and 0.90 g/mL， respectively. All groups were given continuous gavage for 14 days. Body weight and behavioral scores （including stereotyped behavior and motor behavior） of rats were recorded at 7 d of modeling， 7 d of intragastric administration and 14 d of intragastric administration. All groups were given continuous gavage for 14 days. Body weight and behavior （including stereotyped behavior and motor behavior） scores of rats were recorded at 7 d after modeling， 7 d and 14 d after intragastric administration. After 14 days of intragastric administration， the rats were killed by neck removal， and the brains were cut off. The content levels of DA and homovanillic acid （HVA） in striatum were determined by ELISA. Results The scores of motor and stereotyped behavior in model group were significantly higher than those in blank group at 7 d after modeling， 7 d and 14 d after intragastric administration （P<0.05）. After 14 days of intragastric administration， the scores of motor and stereotyped behavior in Xieqing Pill low-dose group and Xieqing Pill high-dose group were significantly lower than those in model group （P<0.01）， and the scores of motor and stereotyped behavior in Xieqing Pill low-dose group and Xieqing Pill high-dose group were significantly lower than those in tiapride group （P<0.05）. The body weight of model group was significantly lower than that of blank group at 7 d after modeling and 14 d after intragastric administration （P<0.05）. After 14 days of intragastric administration， the body weight of Xieqing Pill low-dose group and Xieqing Pill high-dose group was significantly higher than that of model group and tiapride group （P<0.05， P<0.01）. DA and HVA content levels in model group were significantly higher than those in blank group （P<0.05， P<0.01）. The content levels of DA and HVA in tiapride group， Xieqing Pill low-dose group and Xieqing Pill high-dose group were significantly lower than those in model group （P<0.01）. Conclusion Xieqing Pill can improve the stereotyped behavior and abnormal motor behavior of TS model rats， regulate the metabolism of DA and HVA in substantia-nigra striatum DA pathway. The metabolic disorder of DA may be the internal micro essence of the imbalance of liver wind in TS.0D79B62C-9DB2-4857-A4C1-F7BF93609B3A

〔Keywords〕 multiple tic syndrome; Xieqing Pill; iminodipropyl nitrile; monoamine neurotransmitters; liver wind

多發性抽動癥（Tourette syndrome， TS）又稱為抽動穢語綜合征，是臨床常見的精神心理行為疾病。其以慢性頻繁發作的不自主的運動性抽動和（或）發聲抽動為特征，臨床癥狀多種多樣，缺少特異性，病情反復難愈，是抽動障礙分型中病情較復雜、病情嚴重的一種分型[1]。該病反復發作對于患兒的學習、社交、日常生活、心理健康都會造成嚴重的影響，并且對家庭物質及精神壓力、社會管理均有諸多不利影響[2-3]。目前，本病的發病機制尚未明確[4]，“神經遞質失衡”，特別是以多巴胺（dopamine， DA）為主的功能紊亂導致TS發病得到眾多學者認可。DA是一種單胺類神經遞質，高香草酸（homovanillic acid， HVA）是DA的代謝產物，是反映DA活性的主要指標。DA具有廣泛的調節作用，其與多種生理活動尤其是運動、情感、應激行為等關系密切。DA的代謝失常被認為是TS發病的基礎。目前，認為合成DA的腦區及其纖維投射組成4條通路，其中黑質-紋狀體通路是一個被認為參與控制運動、調節行為活動的基本結構。DA能纖維的主要富集區在黑質-紋狀體部，DA由黑質神經元合成釋放，釋放的DA可與紋狀體中DA受體相結合，產生興奮作用，導致抽動發生[5-6]。

中醫學通過辨證施治，可以明顯減輕患兒抽動癥狀，不良反應較少，改善癥狀后不易復發，與西藥相比具有獨到的優勢[7]?！缎核幾C直訣·卷下》載：“瀉青丸……治肝熱搐搦，脈洪實。當歸、龍腦、川芎、山梔子仁、川大黃、羌活、防風……等分為末，煉蜜和丸，雞頭大。每服半丸或一丸，煎竹葉湯同沙糖溫水化下?！睘樘骄繛a青丸治療TS的作用靶點及作用機制，以亞氨基二丙腈（iminodipropionitrile， IDPN）誘導的TS模型大鼠為研究對象，探討瀉青丸對TS大鼠行為學及黑質-紋狀體DA通路的影響。

1 材料

1.1? 實驗動物

幼年（3周齡）SPF級SD大鼠50只，雌雄各半，體質量（60±10） g，由湖南中醫藥大學中心實驗室提供，實驗大鼠購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-004、SYXK（湘）2020-0010。將50只實驗大鼠分籠飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院SPF級實驗室，動物實驗倫理審批號：ZYFY20200825，飼養溫度為23～26 ℃，濕度為50%～60%，日照時間從8∶00至18∶00，嚴格按照實驗室要求，每2 d更換1次墊料，厚度3～5 cm，保持清潔干燥。

1.2? 主要儀器

超低溫冷凍儲存箱（海爾集團電器有限公司，型號：DW-86L338A）;電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司，型號：DK-98-I）;臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號：H1650R）;全自動酶標洗板機（深圳市匯松科技發展有限公司，型號：PW-812）;多功能酶標分析儀（深圳市匯松科技發展有限公司，型號：MB-530）;電熱恒溫培養箱（北京市永光明醫療儀器有限公司，型號：DHP-500）。

1.3? 主要試劑

HVA試劑盒（武漢華美試劑公司，批號：CSB-EQ027785RA）;DA試劑盒（武漢華美試劑公司，批號：CSB-E08660r）;IDPN（湖南海星生物科技有限公司，批號：1829733）。

1.4? 主要藥物

瀉青丸組成：當歸、川芎、龍膽、梔子、大黃、羌活、防風、淡竹葉、沙糖各5 g（處方為3～8歲兒童臨床用藥劑量），同一批次中藥飲片均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房;鹽酸硫必利片（江蘇恩華醫藥業股份有限公司，0.1 g/片，批號：LY210507）。

2 方法

2.1? 藥物配制

2.1.1? 中藥制備方法? 生藥用10倍蒸餾水浸泡0.5 h后加蒸餾水分次煎煮，共2次，第1次0.5 h，第2次1∶8比例加入蒸餾水3600 mL煎煮0.5 h，合并2次濾液，過濾后的藥液共4500 mL，將煎煮好的藥液倒入旋轉蒸發儀中，調試好儀器，加速蒸發后獲得藥液約800 mL，將藥液放置水浴鍋恒溫加熱，濃縮至400 mL，4 ℃冰箱保存待用。按照人與大鼠體表面積比值計算大鼠給藥劑量，用蒸餾水配制成低、高劑量的瀉青丸藥液，生藥濃度為分別為0.45、0.90 g/mL。配制后立即置于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.1.2? 西藥制備? 將鹽酸硫必利片碾碎成藥粉，加入適量蒸餾水后使用超聲波清洗機進行快速溶解，按照人與大鼠體表面積比值計算大鼠給藥劑量，配制成3.194 mg/mL的混懸液。配制后立即置于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.2? 動物分組和藥物干預

2.2.1? 動物分組及造模? 50只大鼠適應性喂養4 d后稱質量，隨機取40只，根據車立純、柯鐘靈等[8-9]采用IDPN造模，據李亞群等[10]的報道，本課題選用所用IDPN藥物劑量為300 mg/kg，配制成30 mg/mL的IDPN溶液，每天1次，連續腹腔注射7 d。余下10只為空白組，使用腹腔注射的方法注射等體積生理鹽水，每天1次，連續腹腔注射7 d。參照文獻[10-11]的判定方法，全部大鼠都出現刻板行為及運動行為表明造模成功，再隨機分為模型組、硫必利組、瀉青丸低劑量組、瀉青丸高劑量組，每組10只。

2.2.2? 藥物干預? 自造模成功之日起進行?？瞻捉M：等體積蒸餾水每天1次灌胃連續2周。模型組：等體積蒸餾水每天1次灌胃連續2周。硫必利組：鹽酸硫必利片混懸液每次30 mg/kg，每天1次，連續灌胃2周。瀉青丸低劑量組：瀉青丸藥液每次1 mL/100 g，每天1次，連續灌胃2周。瀉青丸高劑量組：瀉青丸藥液每次1 mL/100 g，每天1次，連續灌胃2周。0D79B62C-9DB2-4857-A4C1-F7BF93609B3A

2.3? 觀察指標

2.3.1? 行為評分? 參照文獻[11]的判定方法，于造模7 d和灌胃7、14 d，將大鼠放入實驗觀察籠內適應5 min后，進行雙盲觀察1 h，記錄大鼠行為，包括刻板行為及運動行為。（1）刻板行為：無刻板行為計0分;有旋轉行為計1分;頭和頸部的上下運動過多計2分;頭和頸部的上下運動過多加旋轉行為計3分;頭向側擺合并頭和頸部的上下運動過多計4分。（2）運動型為：安靜或正?；顒佑?分;過度興奮計1分;探究行為增加，不連續吸鼻計2分;不停跑動計3分;不停跑動伴有驚跳計4分。

2.3.2? 體質量? 于造模7 d和灌胃7、14 d，測量大鼠體質量，并記錄。

2.3.3? 紋狀體中DA及HVA含量? 在末次給藥24 h后用脫椎法處死所有大鼠，在冷凍臺上快速斷頭取腦組織，剝離紋狀體并將其放入離心管內，將離心管放置于-80 ℃冰箱保存待測。在湖南中醫藥大學第一附屬醫院中心實驗室采用ELISA法檢測大鼠紋狀體中DA及HVA含量，主要步驟：（1）將試劑在室溫（18～25 ℃）下平衡40 min，按說明書配制試劑，備用。（2）分空白孔、標準孔和待測樣本孔，空白孔不加任何溶液，其余每孔分別加標準品或待測樣本50 μL，立即加入抗體工作液50 μL（空白孔不加），混勻后覆上板貼，置37 ℃溫育40 min。棄去孔內液體后甩干、洗板。每孔酶結合物工作液100 μL（空白孔不加）再進行溫育、甩干、洗板等步驟。最后按照順序每孔加底物溶液避光顯色20 min后再加終止液50 μL，終止反應后用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度值。

2.4? 統計學方法

采用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析及處理。計量資料以“x±s”表示，若同時滿足正態性分布及方差齊性，則采用單因素方差分析;若方差齊，則采用t檢驗;若數據不滿足正態性分布或方差不齊，則采用非參數檢驗中的H檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1? 各組大鼠運動行為評分比較

造模7 d和灌胃7、14 d，模型組運動行為評分均明顯高于空白組（P<0.05）。造模7 d、灌胃7 d，模型組、硫必利組、瀉青丸低高劑量、瀉青丸高劑量組間運動行為評分比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。灌胃14 d，硫必利組運動行為評分與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）;瀉青丸低、高劑量組運動行為評分均明顯低于模型組（P<0.01）;瀉青丸低、高劑量組運動行為評分均明顯低于硫必利組（P<0.05）;瀉青丸低劑量組運動行為評分與瀉青丸高劑量組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。詳見表1。

3.2? 各組大鼠刻板行為評分比較

造模7 d和灌胃7、14 d，模型組刻板行為評分均明顯高于空白組（P<0.05）。造模7 d、灌胃7 d，模型組、硫必利組、瀉青丸低劑量組、瀉青丸高劑量組間刻板行為評分比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。灌胃14 d，硫必利組刻板行為評分與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）;瀉青丸低、高劑量組刻板行為評分均明顯低于模型組（P<0.01）;瀉青丸低、高劑量組刻板行為評分均明顯低于硫必利組（P<0.05）;瀉青丸低劑量組刻板行為評分與瀉青丸高劑量組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。詳見表2。

3.3? 各組大鼠體質量比較

造模7 d、灌胃14 d，模型組體質量均明顯小于空白組（P<0.05）。造模7 d、灌胃7 d，模型組、硫必利組、瀉青丸低劑量組、瀉青丸高劑量組間體質量比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。灌胃14 d，瀉青丸低、高劑量組體質量均明顯大于模型組（P<0.01）;瀉青丸低、高劑量組體質量均明顯大于硫必利組（P<0.05）。詳見表3。

3.4? 各組大鼠紋狀體中DA和HVA含量比較

模型組DA、HVA含量均明顯高于空白組（P<0.05，P<0.01）。硫必利組、瀉青丸低高劑量、瀉青丸高劑量組DA、HVA含量均明顯低于模型組（P<0.01）。硫必利組、瀉青丸低高劑量、瀉青丸高劑量組間DA、HVA含量比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。詳見表4。

4 討論

除了行為學的改變，實驗中大鼠造模后體質量有明顯減輕的一個過程，但是實驗過程中無大鼠死亡。IDPN造模后大鼠從易激惹逐漸變為安靜、活動減少，毛色變黯淡，尾巴及耳朵顏色由粉紅轉為紫紅，顏色轉暗?？贪逍袨榕c異常運動行為改變越明顯，上述表現越典型。另外，藥物干預后大鼠并未出現大鼠腹瀉的情況，但糞便顏色由淺轉深，瀉青丸低、高劑量組較明顯。瀉青丸原方為丸劑，本研究采用煎劑，大黃劑量為5 g，且經熬煮、濃縮，煎煮時間較長。研究表明，大黃久煎、制用、小量時瀉下作用較緩和[12-13]，故本研究大鼠大便無明顯改變，未出現腹瀉的情況可能與大黃的用量、煎服法及配伍有關。本研究結果表明，瀉青丸低、高劑量組大鼠體質量增長較明顯，瀉青丸可以柔肝、瀉肝，肝木不乘土，則脾土健運，飲食正常。

研究證實，單胺類神經遞質如DA、去甲腎上腺素（norepinephrine， NE）與TS相關，而DA系統對TS的發生尤為重要[14-15]。腦內DA能神經元及其纖維的分布有以下4條通路：（1）新邊緣系統DA通路;（2）結節漏斗DA通路;（3）黑質-紋狀體DA通路，其中黑質-紋狀體DA通路可易化大腦皮質，產生興奮作用，且DA能纖維的主要富集區在黑質-紋狀體部;（4）中腦-皮質DA通路[16]。大腦皮質邊緣系統及下丘腦等結構與情緒關系密切。神經遞質中DA、NE、5-羥色胺、谷氨酸及乙酰膽堿等神經遞質與情緒的關系密切[17-18]。TS肝風證候表現主要為搖頭、仰頸、扭肩等。本研究結果表明，灌胃14 d，瀉青丸低、高劑量組運動和刻板行為評分均明顯低于模型組（P<0.01）;瀉青丸低、高劑量組體質量均明顯大于模型組（P<0.01）。瀉青丸低、高劑量組DA、HVA含量均明顯低于模型組（P<0.01）;瀉青丸可以通過調節黑質-紋狀體DA通路中單胺類神經遞質代謝來改善TS模型大鼠異常運動行為及刻板行為。瀉青丸這一瀉肝經典方劑可以通過肝的疏泄作用于黑質-紋狀體DA通路以調控DA及其代謝物HVA來暢達腦內氣機，從而平息肝風。神經遞質按功能區分有抑制性神經遞質及興奮性神經遞質兩種，DA與情緒、感覺、認知認為及運動行為關系密切[19]。DA受體分為興奮性的D1和抑制性的D2[20]。這與中醫學陰陽的概念類似，依據中醫學陰陽理論，動者、亢奮者屬于陽，靜者、抑制者屬于陰。綜上，DA的代謝紊亂可能是TS肝風陰陽失衡的內在微觀實質。0D79B62C-9DB2-4857-A4C1-F7BF93609B3A

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（本文編輯? 黎志清）0D79B62C-9DB2-4857-A4C1-F7BF93609B3A