五靈膠囊HPLC指紋圖譜研究*

蘇永健 杜鑫 劉紅娜 張小華 張仙娟

(1.清華德人西安幸福制藥有限公司，陜西 西安 710043;2.陜西省創新生物技術研究院有限公司,陜西 西安 710075)

五靈膠囊由原第四軍醫大學西京醫院研制，清華德人西安幸福制藥有限公司獨家生產。五靈膠囊由柴胡、靈芝、丹參、五味子4味藥材制成。功能主治為疏肝健脾活血。用于慢性乙型肝炎肝郁脾虛挾瘀證，癥見納呆，腹脹噯氣、脅肋脹痛、疲乏無力等。本方中柴胡辛行苦泄、善條達肝氣、疏肝解郁、理氣止痛為君藥；靈芝味甘性平，益氣健脾、補中益脾，丹參活血化瘀、通經止痛，共為臣藥；五味子酸甘性溫、補氣養陰、佐助靈芝益氣補中、安定心神、防柴胡疏泄升散而耗氣傷陰為佐藥?，F代醫學研究證明五靈膠囊對脂肪肝，肝纖維化有特殊療效[1]。

目前關于五靈膠囊質量控制研究的文獻報道較少，主要以柴胡、靈芝、丹參、五味子中化學成分含量檢測為主。據文獻報道,柴胡主要成分為皂苷類、揮發油類、黃酮類、多糖類及甾醇類等，其主要藥理作用為：解熱、鎮靜、鎮痛、鎮咳、抗炎、抗病毒、保肝、調節免疫、抗腫瘤等[2-3]。靈芝主要成分為多糖類、三萜及甾醇類、核苷類、生物堿類、氨基酸類、脂肪酸類及微量元素類，其主要藥理作用為：抗腫瘤、免疫調節、抗衰老、保肝、中樞抑制、調節血脂等[4]。丹參主要成分為水溶性的丹酚酸類、脂溶性的丹參酮類及多糖類、黃酮類、甾體類、菲醌類等成分，其主要藥理作用為：心肌保護、抗凝血及抗血小板聚集、抗動脈粥樣硬化(AS)、調血脂、降血壓、改善腦損傷、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、免疫調節、抗纖維化等[5-10]。五味子主要含有木脂素類、多糖類、揮發油類、有機酸類等成分，其主要藥理作用為：保護心血管、保護中樞神經、鎮靜催眠、抗氧化、保肝、降血糖、抑菌、抗炎、抗腫瘤等[11-13]。

與化學制劑相比，中醫的整體觀決定了需要對中藥中多種成分進行綜合評價，但中藥及其制劑中化學成分的多樣性、復雜性以及相互間的協同作用，導致用單一成分或幾個成分很難準確、全面地表達中藥的質量和療效。指紋圖譜技術是近年逐漸發展起來的一項質量控制技術，它具有信息量大，特征性強，能整體控制多種組分的特點[14-15]。本實驗參照2020年版《中國藥典》(一部)及相關文獻[16-19]，建立了以柴胡、丹參、五味子中化學成分為主要指標的HPLC指紋圖譜方法，通過對共有峰進行歸屬及確認來控制五靈膠囊的質量。

1 材料

1.1儀器 Agilent1260 infinityⅡ型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；AG285型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；

1.2試劑與試藥 對照品：丹酚酸B(批號111562-201917，純度96.6%)，丹參酮ⅡA(批號110766-202022，純度98.9%)，柴胡皂苷a(批號110777-201912，純度94.8%)，五味子醇甲(批號110857-201815，純度99.7%)，五味子乙素(批號110765-201813，純度99.1%)五味子甲素(批號110764-201915，純度99.5%)均購于中國食品藥品檢定研究院；10批五靈膠囊為清華德人西安幸福制藥有限公司生產(批號S1:200101,S2:200102,S3:200103,S4:200301,S5:200302,S6:200303,S7:200304,S8:200501,S9:200502,S10:200503)；乙腈、磷酸均為色譜純，甲醇等其他試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相；乙腈(A)-0.1%磷酸(B)；梯度洗脫(0～15 min，80%～50%B；15～40 min，50%～30%B；40～60min，30%～0%B；60～80 min，0%～0%B;80～85 min,0%～80% B;85～90 min,80%～80% B);體積流量0.8 mL·min-1；檢測波長：210 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2.2溶液制備

2.2.1混合對照品溶液配制 取丹酚酸B、丹參酮ⅡA、柴胡皂苷a、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素對照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加甲醇制成每1 mL分別含丹酚酸B 100 μg、丹參酮ⅡA20 μg、柴胡皂苷a 400 μg、五味子醇甲300 μg、五味子甲素500 μg、五味子乙素500 μg的混合對照品溶液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2.2供試品溶液制備 取五靈膠囊內容物0.4 g,精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇約40 mL，超聲(頻率50 Hz,功率200 W)30 min，至室溫后再加甲醇至刻度，搖勻，用0.22 μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3陰性樣品溶液 參照五靈膠囊制法，分別制備缺柴胡、靈芝、丹參、五味子藥材的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液，即得。

2.3方法學考察

2.3.1精密度實驗 用批號為200503樣品,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下連續進樣6針，以五味子醇甲為參照峰，測得各共有峰相對峰面積RSD<3%，相對保留時間RSD<1%，表明儀器精密度良好。

2.3.2穩定性實驗 用批號為200503樣品,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下于0、2、4、8、12、24 h進樣，以五味子醇甲為參照峰，測得各共有峰相對峰面積RSD<5%，相對保留時間RSD<2%，表明供試品溶液24 h內穩定性良好。

2.3.3重復性實驗 用批號為200503樣品,按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，以五味子醇甲為參照峰，測得各共有峰相對峰面積RSD<5%，相對保留時間RSD<2%，表明該方法重現性良好。

2.4指紋圖譜建立

2.4.1共有峰標定 選取五味子醇甲峰為參照峰(S)，色譜圖中各色譜峰保留時間與參照峰(S)保留時間的比值為相對保留時間，通過相對保留時間值標定共有峰，其中16個峰為10批樣品共有，標定為共有峰，共有峰面積占總峰面積75%以上，結果見圖1。

圖1 10批五靈膠囊樣品HPLC指紋圖譜

2.4.2相似度評價 共有峰通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012年版)分析，中位數法建立對照指紋圖譜R，見圖2。10批樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度分別為0.998、0.999、0.998、0.998、0.997、0.995、0.999、0.982、0.997、0.986，均在0.980以上，具體結果見表1。

圖2 對照指紋圖譜

表1 相似度分析結果

2.4.3專屬性考察 取4種陰性樣品及批號為200503樣品,按“2.2.2”項下方法制備成溶液，分別吸取4種陰性樣品及樣品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，色譜圖見圖3。通過與陰性樣對比可以得出，共有峰1、11、13、16歸屬丹參，共有峰2歸屬柴胡，共有峰3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15歸屬五味子。

S1:丹參陰性樣 S2：五味子陰性樣 S3：靈芝陰性樣 S4：柴胡陰性樣 S5：五靈膠囊圖3 共有峰歸屬

2.4.4共有峰指認 分別用混合對照品溶液及樣品溶液按“2.1”項色譜條件下進樣，色譜圖見圖4，通過對照品峰對共有峰進行指認，1號峰為丹酚酸B，2號峰為柴胡皂苷a，3號峰為五味子醇甲，12號峰為五味子甲素，13號峰為丹參酮ⅡA，15號峰為五味子乙素。

1:丹酚酸B 2:柴胡皂苷a 3:五味子醇甲 12:五味子甲素 13:丹參酮ⅡA 15:五味子乙素圖4 對照品及樣品HPLC圖譜

3 討論

本實驗用甲醇、乙腈分別對樣品進行處理，結果發現甲醇處理樣品后基線更穩定，峰數量較多，因此本實驗采用甲醇處理樣品。本實驗采用回流提取法及超聲提取法分別對樣品進行處理，對比發現，兩種處理方法差異不大，因此選用簡單實用的超聲提取作為提取方法。本實驗對超聲提取時間(10 min、20 min、30 min、40 min)進行了考察，結果發現30 min時峰面積最大，30 min后峰面積幾乎無變化，因此選擇30 min為樣品提取時間。本實驗用乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸，乙腈-0.25%磷酸分別做梯度考察，結果發現用乙腈-0.1%磷酸進行梯度洗脫，基線平穩，各峰分離度較好，因此采用乙腈-0.1%磷酸作為梯度洗脫流動相。本實驗對樣品溶液進行不同波長(210 nm、250 nm、270 nm、305 nm)檢測，發現210 nm時峰數量最多，信息量最大，因此采用210 nm作為檢測波長。本研究還對流速及柱溫等進行了考察，最后選擇最佳流速為0.8 mL·min-1；最佳柱溫為30 ℃。

本方法的16個共有峰分別歸屬于柴胡、丹參、五味子3種藥材中，較全面反映五靈膠囊中各種成分的分布和比例關系。靈芝主要成分為多糖、三萜及甾醇類化合物，三萜及甾醇類化合物種類復雜且含量較低，紫外光(200 nm～400 nm)范圍內吸收很弱[20-21]，故本圖譜未能體現五靈膠囊中靈芝的成分分布及比例關系，這些不足有待于今后采用別的方法對靈芝繼續進行研究。本方法通過對五靈膠囊中柴胡、丹參、五味子3種藥材中多種成分的對比與分析，相比直接測定制劑中幾種化學成分的含量，具有操作簡便，信息量大的優點，能較全面的控制五靈膠囊的質量。