營養素干預對癲癇小鼠的發作及行為學影響

金伊楠 丁虹

關鍵詞：癲癇，營養素干預，白楊素，行為學

【中圖分類號】 ?R742.1【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2022）16--03

癲癇?。‥P）是全世界最常見的慢性疾病之一，是一種發作性、致殘性的腦功能障礙性疾病，影響數千萬人[1]，表現為反復發作的慢性腦部疾病，患者的發作形式多樣，可能會突然間毫無緣由的發作，可表現為抽搐、痙攣、昏厥、兩眼發直等臨床癥狀，具有發作性、短暫性、重復性和刻板性的特征?；颊叩恼Ｉ詈蜕硇慕】刀家虬d癇發作的不可控而受到極大的損害，其影響不僅停留在患者本人，更是波及其家庭，尤其對于目前很多嬰幼兒患者及其家屬而言，遭受著難以想象的壓力。EP的發病原因復雜多樣，往往是多種因素綜合造成的結果，包括基因、創傷性腦損傷、中樞系統感染、腦血管疾病以及與認知功能損傷相關的退行性神經疾病[1]。對于嬰幼兒患者而言，EP使得其神經發育異常，認知功能、運動能力均無法正常發育;對于成人患者，EP使得他們的生活質量下降，同時在心理方面承受著來自社會、家庭等各方面的壓力，加之其可能誘發的焦慮或抑郁狀態，使患者的正常生活工作都收到極大影響。有研究表明，EP與精神疾病相關聯，可能增加患者患上精神疾病的可能，使患者壽命縮短[2]。目前常用的治療藥物包括苯妥英鈉、奧卡西平、托吡酯等，也可以通過手術治療進行神經刺激、切斷等方式，由于患者可能出現的精神問題，可以適當輔以心理治療。然而，許多患者可能在疾病的發展過程中出現耐藥，而面臨治療瓶頸，仍需要不斷開發尋找安全有效的新藥。本研究通過營養素干預的方式來篩選研究幾種營養素對癲癇小鼠的疾病發展的控制作用，以及對小鼠精神狀態的影響。

材料

1.試劑和藥物

2實驗動物

取8-12周清潔級健康成年雄性昆明小鼠共100只，體重18～22g，購自武漢大學實驗動物中心。喂養環境：飼養在12小時光亮/黑暗環境中，室內恒溫22～25℃，分籠飼養，自由攝食及進水。實驗前1周小鼠適應實驗室環境。所有實驗動物的管理均參照中華人民共和國科學技術部頒布的實驗動物管理條例法（1988，No.134）執行。

方法

1.造模

模型：癲癇模型

Day1-day11腹腔注射PTZ（37mg/kg）制備慢性癲癇模型，day12腹腔注射PTZ（45mg/kg），后連續1h觀察各組小鼠癲癇發作情況，并記錄發作的等級、持續時間、潛伏期及死亡情況。

2.動物分組及藥物干預

將60只小鼠隨機分為正常組，PTZ組，PTZ+白楊素組，PTZ+蜂膠組，PTZ+梅芹茶組，PTZ+NMN組，PTZ+芹菜素組，PTZ+柚皮素組，PTZ+金合歡素組，PTZ+胞二磷膽堿片組。

（1）♂正常對照組：每日腹腔注射0.9%NaCl（0.1ml/10g），每日灌胃蒸餾水（0.1ml/10g），共計42天。（2）♂PTZ組：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃蒸餾水（0.1ml/10g），共計42天。（3）♂PTZ+白楊素組：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃白楊素50mg/kg（0.1ml/10g）。共計42天。（4）♂PTZ+梅芹茶組：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃梅芹茶2.5g/kg（0.1ml/10g）。共計42天。（5）♂PTZ+蜂膠組：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃蜂膠100mg/kg（0.1ml/10g）。共計42天。（6）♂PTZ+NMN組：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃NMN 90mg/kg（0.1ml/10g）。共計42天。（7）♂PTZ+芹菜素組：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃芹菜素20mg/kg（0.1ml/10g）。共計42天。（8）♂PTZ+柚皮素組：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃柚皮素20mg/kg（0.1ml/10g）。共計42天。（9）♂PTZ+金合歡素組：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃金合歡素20mg/kg（0.1ml/10g）。共計42天。（10）♂PTZ+胞二磷膽堿組：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃胞二磷膽堿30mg/kg（0.1ml/10g）。共計42天。

3.觀察指標

營養素干預對小鼠行為學功能的影響

以往研究結果表明，PTZ誘導癲癇小鼠表現出一系列行為障礙，包括運動功能障礙和抑郁樣行為。本研究通過各種行為學測試，包括曠場實驗、懸尾實驗、強迫游泳實驗，對動物行為進行評價和分析。為保證每只小鼠在同一條件下進行測試，每只小鼠參與各個行為學實驗的順序保持不變。行為學測試的實施遵循雙盲的原則，由不清楚各組小鼠分組及藥物干預情況的測試者進行試驗。

（1）小鼠癇性發作行為學評定

小鼠癇性發作等級評分

每次PTZ腹腔注射后，觀察60min小鼠的行為學變化，參照Racine分級標準，記錄癇性發作等級。本實驗采取Racine（1972）行為學分級法對小鼠癲癇發作的嚴重程度進行分級。（見表1）

全面性強直-陣攣發作和極小陣攣性發作的潛伏期

每次PTZ腹腔注射后，參照Racine分級標準，觀察大鼠出現的從輕度肌陣攣性抽搐發作到面部和前肢陣攣，沒有失去扶正反射的連續癇性發作的間歇期為極小陣攣發作潛伏期。而出現平衡跌倒，全身強直-陣攣大發作的間歇期為全面性強直-陣攣發作潛伏期。

（2）曠場實驗

將待觀察小鼠置于內壁黑色的無頂盒子中，其規格為50cm×50cm×30cm，盒子底部被圖像采集系統劃分為25個正方形小格，小鼠應從正中央的小格放入，開始實驗，記錄5min內活動總路程、中央區（四周無墻壁的小格）滯留時間、靜止不動時間、直立次數、大小便次數。

（3）懸尾實驗

懸尾實驗（TST）是通過無法克服不正常體位而誘導產生抑郁絕望行為，屬于“干型”行為絕望模型。其原理是小鼠被懸尾后，會在本能的驅使下嘗試逃脫，但由于外力無法逃脫，進而會放棄掙扎進入特有的抑郁不動狀態，實驗過程中記錄動物不動時間來反映抑郁狀態。將實驗動物的尾部進行固定，使其頭部懸掛朝下，動物在該環境中掙扎，企圖擺脫該困境，在經過努力仍無法擺脫后，出現間斷性不動，顯示“行為絕望”狀態。動物在該環境中拼命掙扎試圖逃跑又無法逃脫，從而提供了一個無可回避的壓迫環境，一段時間的實驗后，記錄處于該環境的動物產生絕望的不動狀態過程中的一系列參數，動物的表現出的這種典型的“不動狀態”，反映了一種被稱之為“行為絕望狀態”，記錄處于該環境的動物產生絕望的不動狀態過程中的一系列參數。實驗中，我們將小鼠的尾部固定懸掛開始計時6min，記錄6min內其懸尾不動的時間與掙扎攀爬的次數來反應其精神狀態。

（4）強迫游泳實驗

強迫游泳實驗（FST）系統適用于大鼠、小鼠或其他實驗室動物，通過將實驗動物置于一個局限的環境中（如水中），與TST相似，一段時間的實驗后，動物即表現出“不動狀態”，反映出“行為絕望狀態”，記錄處于該環境的動物產生絕望的不動狀態過程中的一系列參數。實驗中我們將小鼠放入水中后立刻開始計時8min，通過記錄后6min內小鼠漂浮不動的時間來反應小鼠的精神狀態。

結果與討論

實驗對小鼠進行11周的培養，并定期記錄每只小鼠的癲癇發作情況，最后計算平均得到每組小鼠的發作情況。實驗中應用了白楊素、蜂膠、梅芹茶、中濃度NMN、芹菜素、柚皮素、金合歡素和胞二磷膽堿進行干預。

1.癲癇發作情況變化

通過統計結果（見圖1.2）比較可以發現，與模型組比較，不同營養素中部分對癲癇的控制有一定的效果。實驗結果顯示，白楊素、中濃度NMN、柚皮素、金合歡素和胞二磷膽堿都有一定的效果。而其余營養素的干預效果較差。白楊素整體效果較好，在前期逐漸顯現出對癲癇發作的控制，隨著時間的推移，與模型組相比也有效抑制了癲癇的進程;蜂膠在前四周表現較好，然而之后癲癇發作的進展并未得到控制，甚至高于正常組的發作等級;梅芹茶在前期有一定的控制效果，但最終與模型組相差無異，認為無效;中濃度的NMN始終表現出良好的抑制作用，有效控制了癲癇的發作等級在1級到2級之間;芹菜素比蜂膠效果稍好，其控制效果在前六周表現良好，然而在之后并不能維持其干預作用;柚皮素在第11周將癲癇控制在1級左右，最終效果最優，實驗培養過程中存在時有控制效果下降的問題，但整體干預作用較好;金合歡素在后期表現較好，有效控制并維持其干預效果;使用胞二磷膽堿與模型組相比，始終維持了較好的控制干預效果，期間也并沒有太大的波動。

2.小鼠行為學變化

（1）曠場實驗結果

在曠場實驗中，對小鼠的抑郁情況進行評估，所得結果與癲癇發作的干預結果略有出入。（見圖3）從實驗結果可知，模型組的水平得分與總得分均高于正常組，說明癲癇小鼠較正常小鼠更為焦慮。白楊素、蜂膠、柚皮素和金合歡素干預的小組其水平得分與總得分均比模型組低，更接近正常組，說明這幾種營養素的干預對癲癇小鼠的精神狀態有較好的干預效果。梅芹茶、中濃度NMN和芹菜素干預組的小鼠與模型組相比水平得分與總得分有所下降，但高于正常組，表明其對癲癇小鼠的焦慮狀態有所改善，但最終效果并不及上述的其他幾種干預。胞二磷膽堿的干預對癲癇小鼠的焦慮狀態并沒有明顯的改善。各組小鼠的糞便粒數與正常組相差無幾，對焦慮狀態的反映不夠直觀明顯。就直立次數而言，正常組與模型組在均值上差異不顯著，但誤差范圍內正常組的直立次數更多，表明癲癇小鼠對外界的求知欲下降，有一定的抑郁傾向。白楊素、梅芹茶和中濃度NMN的干預組小鼠直立次數較模型組更高，說明三者能幫助小鼠減輕抑郁。其余營養素干預組的小鼠直立次數并沒有顯著提高，對小鼠抑郁傾向并沒有明顯改善。正常組的中央區停留時間叫模型組更長，表明癲癇小鼠可能有焦慮傾向。白楊素與金合歡素干擾組的中央滯留時間顯著下降，表明這兩種營養素對小鼠的焦慮狀態可能有較好的緩解作用，其他營養素的干預作用并不明顯。

（2）懸尾實驗結果

從懸尾實驗結果來看（見圖4），正常組的懸尾不動時間與攀爬次數都高于模型組，需要進一步實驗重復驗證其準確性。結果顯示，所有的營養素干預對癲癇小鼠的求生欲并無提高，對抑郁狀態也沒有明顯改善，各組的懸尾不動時間與攀爬次數與模型組相比無改善。

（3）強迫游泳實驗結果

在強迫游泳實驗中，正常組的不動時間高于模型組，有待進一步重復驗證。根據結果分析（見圖4），白楊素干預組和梅芹茶干預組均表現出較強的求生欲，表明其精神狀態較好;中濃度NMN干預組和胞二磷膽堿干預組的時間與模型組相差不大，說明其對癲癇小鼠的抑郁狀態改善不大。其余組別與正常組相比沒有太大差異，與模型組相比也沒有更多的改善。

3.討論

實驗通過PTZ致毒性進行癲癇小鼠的造模，利用黃酮類營養素干預來比較其有效性，進一步探討其可能的機制。通過對小鼠11周的培養記錄，可以發現白楊素、中濃度NMN、柚皮素、金合歡素和胞二磷膽堿能夠改善癲癇的發作，相較于其他營養素，它們的有效性更持久;通過曠場實驗可以得知，使用白楊素、蜂膠、柚皮素和金合歡素干預的癲癇小鼠在抗焦慮方面具有較好的表現，而白楊素、梅芹茶和中濃度NMN的干預組的癲癇小鼠在求知欲方面表現優于模型組，表明其抑郁傾向得到緩解;在懸尾實驗中，各營養素的表現相差無幾;在強迫游泳實驗中，白楊素干預組和梅芹茶干預組的小鼠表現出更強的求生欲。因此，結合所有實驗的結果來看，在所有營養素中，白楊素在各方面的表現最佳，它能有效改善癲癇的發作，同時對癲癇小鼠的精神狀態也起到了很大的幫助作用。白楊素為5，7-二羥基黃酮，具有抗腫瘤、抗焦慮、抗炎、抗氧化等藥理活性，它能夠通過上調Nrf2-ARE信號通路相關蛋白進而激活大鼠體內抗氧化酶系和自由基清除系來減輕這些物質對大鼠腦組織造成的損傷，另外，白楊素也可能通過上調p-ERK、同時下調NF-κB和p-P38的表達發揮神經保護的作用[3]。除此之外，有關于腦缺血-再灌注損傷的實驗表明，白楊素可通過上調神經營養因子NGF、BDNF表達量而對腦缺血-再灌注損傷具有一定的神經保護作用。有研究[4]證明，白楊素可改善創傷性腦損傷（TBI）大鼠前庭運動功能障礙，改善認知記憶障礙，減輕焦慮/抑郁樣行為，其可能的機制是通過調節大腦皮質和海馬DG區Bcl-2家族蛋白的表達來減輕神經炎癥和預防神經元凋亡。對于PTZ致毒性的癲癇小鼠而言，白楊素可能發揮神經保護作用，同時減輕PTZ引發的腦內炎癥，進而對抗PTZ誘發的癲癇的發展。另一方面，白楊素具有抗抑郁/減輕焦慮的作用，對于癲癇誘發的焦慮和抑郁有一定的緩解作用。通過研究實驗我們可以發現，部分營養素對癲癇的進展具有一定的控制作用，同時也能緩解其帶來的精神方面的不良影響。通過營養素進行干預是極具潛力的方向，藥物治療可能會帶來許多不良反應，而營養素能夠避免對人體造成傷害，同時與藥物配合治療可能會達到更好的治療效果，或許營養素干預的方案能夠阻止一些患者病程發展為難治性癲癇，對于患者及其家庭而言都具有重大意義。對于無論是白楊素，還是實驗涉及到的其他營養素，需要進一步重復實驗以及其他實驗輔以驗證來確定它們的干預效果。

事實上，目前癲癇普遍存在于我們的生活中，在嬰幼兒中的發病率也極高，對于許多家庭而言，面對新生命誕生的愉悅被疾病打破，家人承受著巨大的經濟與心理負擔。而對營養素干預作用的研究或許將給這些家人帶來希望，通過營養素干預使得患者有機會擺脫鎮靜劑，走向新生活。因此對于營養素干預控制癲癇病程發展的深入研究與篩選具有重要意義。

參考文獻：

[1]張萌，王蘭桂.癲癇發病機制的研究進展[J].中西醫結合心血管病電子雜志，2020，8（35）：31-32.

[2]馬慧萍，吳金華，蒙萍，等.白楊素對大鼠急慢性腦缺血損傷后氧化應激和Nrf2/HO-1途徑的影響[J].解放軍醫藥雜志，2015，27（12）：15-20..

[3]趙煦萌.白楊素對實驗性腦梗死大鼠腦保護作用及其機制的研究[D].河北：河北醫科大學，2013.DOI：10.7666/d.Y2337622.

[4]王葉葉，江羽，梁晨，等.白楊素對腦缺血-再灌注損傷的神經保護機制研究[J].世界科學技術-中醫藥現代化，2019，21（4）：580-586.