基于人消化道微生態體外模擬系統觀察納米二氧化鈦對腸道菌群的影響

張家赫，史佳琪，陳章健，賈 光

(北京大學公共衛生學院勞動衛生與環境衛生學系，食品安全毒理學研究與評價北京市重點實驗室，北京 100191)

二氧化鈦(titanium dioxide, TiO2)作為一種食品添加劑應用已久。1966年，美國食品與藥物管理局正式認可TiO2作為食品添加劑，最高允許添加量為1%[1]。我國國家健康衛生委員會(原衛生部)在食品添加劑使用標準(GB2760-2014)中規定TiO2可以作為食品添加劑適量使用，飲料和糖果中最高允許添加量為10 g/L。但隨著時代的發展和技術的進步，納米二氧化鈦(titanium dioxide nanoparticles，TiO2NPs)已大量存在于食品級TiO2中，占據總顆粒數的17%～35%[2]。據報道，北京市20～30歲人群每天消化道TiO2NPs攝入量為0.02～3.09 μg/kg[3]。TiO2NPs經消化道攝入可能在人體組織中蓄積，并產生健康風險，如氧化應激、組織病理學改變、致癌作用、遺傳毒性、生殖毒性和免疫破壞等[4]，但機制尚未完全明確。此外，TiO2NPs具有良好的抗菌能力，對常見細菌具有抑制生長和殺滅的作用[5-7]，因此，TiO2NPs對人消化道尤其是腸道菌群的影響值得關注。人體腸道菌群對于宿主能量與代謝平衡以及身體健康的影響已經受到科學界廣泛關注和探索，人類腸道正常菌群通過多種免疫因子與腸道免疫系統形成動態平衡狀態，失衡時可能引起各種負面健康效應。

目前已有動物實驗顯示TiO2NPs經口攝入可以對腸道菌群產生影響，主要影響乳酸桿菌(Lactobacillus)等厚壁菌門(Firmicutes)細菌的相對豐度[8-13]。然而腸道菌群的組成在物種之間甚至同物種的不同品系之間存在明顯差異[14]，導致動物實驗結果外推至人體時具有局限性。而體外消化道微生態模擬系統提供了一種可能的直接研究人源腸道菌群的實驗方式，常見的體外消化道微生態模擬系統可以分為單相靜態、半連續動態和多相連續動態模擬系統。1993年，Molly等[15]提出了人類腸道微生態模擬系統(simulation of human intestinal microbial ecosystem，SHIME)，這種連續動態模擬系統采用5個部分模擬了胃、小腸、升結腸、橫結腸、降結腸的微生態，被應用于食品醫藥[16]、重金屬污染[17]等腸道菌群相關研究。各種體外模擬系統不斷經歷優化和改進，較好地模擬人體消化道微生態，在腸道菌群研究領域有著廣闊的發展應用前景。本文參考SHIME等已有模型構建了體外人消化道微生態模擬系統，研究TiO2NPs對人源腸道菌群組成和結構的影響。

1 材料與方法

1.1 TiO2 NPs的理化表征

TiO2NPs購自上海麥克林生化科技有限公司。使用透射電鏡(transmission electron microscopy，TEM；JEM-1400，JEOL公司，日本)觀察顆粒的形狀和平均粒徑；通過電感耦合等離子體質譜(inductively coupled plasma mass pectrometry，ICP-MS；IRIS Advantag，美國)檢測顆粒純度；使用X射線衍射儀(X-ray powder diffractometry，XRD；PANalytical’s X’Pert PRO，荷蘭)測量晶型；使用BET(Brunauer-Emmett-Teller)法測量比表面積；通過動態光散射(dynamic light scattering，DLS；ZetaSizer Nano ZS90，英國)測量TiO2NPs(1 g/L)的水合粒徑和Zeta電位。

1.2 人源腸道菌群提取

參考葉峰等[18]的方法提取和保存糞便菌群。糞便菌群供體為1位健康成人志愿者(24周歲男性，無慢性消化道疾病及其他病史，半年內未服用過抗生素類藥物)。取新鮮糞便約5 g加入25 mL磷酸鹽緩沖液，混勻后4 ℃靜置1 min，取上清液10 mL，4 ℃下1 500 r/min離心3 min，上清液為菌群提取液，放入超凈臺備用。

1.3 人消化道微生態體外模擬系統構建

1.3.1溶液配置 營養液：腦心浸液肉湯培養基(青島海博生物)；模擬胃液：氯化鈉3 g/L、胃蛋白酶3.2 g/L、36.5%(體積分數)濃鹽酸7 ml/L，pH測定為1.40；模擬胰液：碳酸氫鈉12.5 g/L、牛膽汁6 g/L、豬胰素粉0.9 g/L，pH測定為8.16。

1.3.2體外模擬流程 本實驗構建的模擬系統是在SHIME基礎上簡化的三相半連續動態模擬系統。模擬過程完整模擬TiO2NPs經口攝入后逐步進入胃、小腸和結腸，并在結腸階段與腸道菌群相互作用的整個過程。整個模擬過程在同一培養瓶中進行，通過改變液體環境模擬胃、小腸、結腸階段，因此屬于三相半連續動態模擬系統。模擬過程從胃模擬階段開始，用模擬營養液和TiO2NPs染毒液模擬納米顆粒和食物混合經口攝入的過程，其被加入到模擬胃液中，而后加入模擬胰液進入小腸階段，最后加入提前穩定培養的菌液，模擬結腸階段(圖1)。整個體外模擬系統由電熱套保證恒溫，細胞培養瓶密封并用厭氧產氣袋保證無氧環境，培養過程中采用搖床以60～70 r/min模擬腸道蠕動。實驗過程在超凈臺中進行。

TiO2 NPs, titanium dioxide nanoparticles.CNC, computer numerical control.

1.3.3系統穩定性評價 根據培養過程中菌群內主要細菌：腸球菌(Enterococci)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和乳酸桿菌的生長曲線，初步評價系統的穩定性。實驗方法如下：取1 mL菌群提取液，在不加TiO2NPs染毒的情況下，按上述體外模擬系統流程培養48 h。在培養的第0、12、24、36、48 h，從體系中吸取菌液，分別接種在腸球菌、大腸桿菌和乳酸桿菌的選擇性培養基上，按適宜條件培養后進行細菌計數。膽鹽七葉苷瓊脂培養基(bile esculin agar，BEA)用來選擇性培養腸球菌，伊紅美藍培養基(eosin-methylene blue medium，EMB)用來選擇性培養大腸桿菌，乳酸桿菌選擇性培養基(Lactobacillusselective agar，LBS)用來選擇性培養乳酸桿菌。

1.4 TiO2 NPs染毒

參考人群日常暴露劑量[3, 19]和體外細菌毒性實驗結果[20-21]，設置染毒劑量的最低值為20 mg/L，并以5為組距設置中高劑量組。

在胃階段向模擬系統中加入不同量的TiO2NPs，在結腸模擬階段加入提前培養穩定的菌液，使最終TiO2NPs的染毒濃度為0、20、100、500 mg/L，繼續培養16 h染毒結束。對照組(0 mg/L)和TiO2NPs低(20 mg/L)、中(100 mg/L)、高(500 mg/L)劑量染毒組各設置3個平行樣。每個樣本均收集1 mL染毒結束時的菌群培養液于凍存管中，短暫放于-20 ℃冰箱后轉移至-80 ℃保存待測。

1.5 菌群16S rRNA測序

取1 mL菌液凍干去除水分后采用十六烷基三甲基溴化銨法進行菌群基因組DNA提取，并利用1%(10 g/L)瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。使用稀釋后的基因組DNA作為模板，使用合成帶有Barcode的特異引物(針對V4區域的515F和826R，針對V3+V4區域的341F和806R)和96孔熱循環(HID VeritiTM96-Well Thermal Cycler)PCR儀進行PCR擴增，PCR產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增目的條帶大小，并用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒純化。得到擴增條帶后使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴增進行文庫模板的富集，利用氫氧化鈉變性產生單鏈DNA片段，構建形成Miseq文庫。使用Ion S5 XL測序儀進行單端測序，根據熒光信號結果獲知Miseq文庫中模板DNA片段序列。

1.6 數據分析

數據導出為Fastq格式文件。利用Trimmomatic軟件采用滑動窗口對序列進行篩選和保留，利用Flash和Pear軟件對具有重疊(overlap)的序列進行拼接，最小重疊區域10 bp，錯配率0.1，得到初始文件(Fasta)序列。根據已知數據庫(http://www.drive5.com/uchime/uchime_download.html)用uchime方法比對去除Fasta序列的嵌合體，對于未知數據庫使用自比對(denovo)方法進行去除，同時去除不合要求的短序列。采用Qiime和vsearch軟件進行聚類歸組分析，將優質序列(clean tags)聚類分為許多操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)，對97%相似水平下的OTUs進行生物信息統計分析，聚類方法采用uparse聚類法；采用Qiime和Uclust Consensus Taxon Assigner軟件對OTUs代表序列在各個水平(界kingdom、門phylum、綱class、目order、科family、屬genus、種species)注釋其群落的物種信息。

對各樣本組學數據進行歸一化處理，采用mothur和Qiime軟件進行Alpha多樣性分析；采用Qiime和R軟件進行Beta多樣性分析；采用R軟件進行單因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)和線性判別效應量分析(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)，根據線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)得分評估各組間的物種差異并尋找組間差異的腸道菌；采用PICRUSt 2.0軟件，根據京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數據庫信息，對基因序列的功能豐度進行預測。

其他實驗數據使用R軟件進行統計分析，使用Shapiro-Wilk正態性檢驗和Bartlett方差齊性檢驗，連續變量采用均數±標準差表示。所有實驗數據基于同一樣本來源的3次生物學重復實驗結果。所有檢測均為雙側檢驗，并以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TiO2 NPs表征

TiO2NPs的表征結果顯示，TiO2NPs粒徑為球形，直徑為(25.12±5.64)nm，純度為99.99%，晶體結構為銳鈦礦，比表面積(77.51±0.29)m2/g，在超純水中水合粒徑為(609.43±60.35)nm，Zeta電位為(-8.33±0.22)mV。

2.2 系統穩定性評價結果

選擇性培養基培養結果如圖2所示。在0～24 h，各類細菌數量隨培養時間延長逐漸增加，在24～48 h維持相對穩定，并在48 h時顯示出下降趨勢(圖2)，這說明本模擬系統穩定性良好，在培養24 h時即能達到相對穩定，且穩定狀態可以保持24 h。在24 h，BEA顯示腸球菌計數達到(1.6±0.85)×107個，EMB顯示大腸桿菌計數達到(5.6±0.82)×107個，LBS顯示乳酸桿菌計數達到(2.7±1.32)×107個。

本研究中體外消化道模擬系統培養24 h后腸球菌、大腸桿菌和乳酸桿菌數量轉化為以10為底的對數值分別為7.17±0.28、7.74±0.07、7.40±0.20。SHIME模型[15]中，培養穩定時對應細菌計數(以10為底的對數值)分別為7.33±0.38、7.69±0.71、6.58±0.78。與SHIME模型相比，本研究所用的體外消化道模擬系統在腸球菌和大腸桿菌計數上相近，初步判斷穩定性較好。

2.3 腸道菌群組成分析

2.3.1OTUs聚類分析 OTUs是在系統發生學或群體遺傳學研究中，為便于進行分析，人為給某一個分類單元(品系、屬、種、分組等)設置的統一標志。通過歸類操作(cluster)，共產生223個OTUs。按組分，各樣本組共有的OTUs數目為143個，對照組、20 mg/L TiO2NPs劑量組、100 mg/L TiO2NPs劑量組、500 mg/L TiO2NPs劑量組分別具有獨特的OTUs數目為2、0、1、3個，TiO2NPs染毒組共有而對照組沒有的OTUs有50個(圖3A)。按樣本分，各樣本共有的OTUs數目為87個(圖3B)。說明對照組和TiO2NPs染毒組OTUs不同，提示菌種組成存在差異。

The sample names and operational taxonomic units(OTUs)quantity of each part are marked in the figure.Low, 20 mg/L TiO2 NPs; Middle, 100 mg/L TiO2 NPs; High, 500 mg/L TiO2 NPs.

2.3.2物種組成分析 對OTUs代表序列進行對比分析，并在各個生物學分類水平注釋其群落的物種信息。根據分類分析結果可以得知樣本或樣本組間在各分類水平上的分類學對比情況，反映了樣本中微生物的種類和相對豐度?；赨nweighted Unifrac距離矩陣，UPGMA方法聚類建樹，并將聚類結果與各樣品在門、綱、目、科、屬水平上的物種相對豐度整合展示為圖4。在門水平上，4組均以變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門為主(圖4A)。在綱水平上，對照組以γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)和Negativicutes菌綱為主，低、中、高TiO2NPs染毒組均以γ-變形菌綱和梭菌綱(Clostridia)為主(圖4B)，對照組的各樣本彼此間更為接近。在目(圖4C)和科(圖4D)水平上，TiO2NPs染毒組之間表現出分離的趨勢。在屬水平上，大腸埃希氏菌屬(Escherichia-Shigella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、腸球菌屬(Enterococcus)等細菌在各組間表現出相對豐度的差異(圖4E)。

In the proportional bar charts, each color represents a species of bacteria at the corresponding level(the same color represents different bacteria at diffe-rent levels), and the length of each color block represents the relative abundance of the corresponding bacteria.On the left side of the bar charts it is showed the results of clustering each sample according to the similarity degree of strain composition.

2.4 腸道菌群物種多樣性分析

2.4.1Alpha多樣性分析 群落生態學中研究微生物多樣性，通過單樣品的多樣性分析(Alpha多樣性)可以反映微生物群落的豐度和多樣性，包括一系列統計學分析指數估計環境群落的物種豐度和多樣性。Chao1和Observed species指數主要反映樣本的物種豐富度信息，Shannon和Simpson綜合體現物種的豐富度和均勻度，PD whole tree兼顧物種豐富度和進化距離。TiO2NPs染毒組的Chao1、Observed species和PD whole tree均顯著高于對照組，而對照組在Shannon和Simpson指數上與TiO2NPs染毒組差異無統計學意義，各指數具體分布見圖5。

Low, 20 mg/L TiO2 NPs; Middle, 100 mg/L TiO2 NPs; High, 500 mg/L TiO2 NPs.*P<0.01, #P<0.001, vs. control.

2.4.2Beta多樣性分析 主成分分析(principal component analysis，PCA)結果見圖6A，PCA前兩個主成分解釋方差的百分比分別為63.15%和14.57%，共計77.82%，圖中表現出對照組與TiO2NPs染毒組顯著分離。利用偏最小二乘法判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)構建模型(圖6B)，可見前兩個主坐標可解釋的方差百分比分別為36.08%和8.62%，共計42.70%，對照組和TiO2NPs染毒組的分離趨勢明顯可見。以上結果表明，TiO2NPs改變了腸道菌群的beta多樣性，使得TiO2NPs染毒組與對照組的菌群結構和組成產生了顯著差異。

Low, 20 mg/L TiO2 NPs; Middle, 100 mg/L TiO2 NPs; High, 500 mg/L TiO2 NPs; PC, principal component; PCA, principal component analysis; PLS-DA, partial least squares discrimination analysis.

2.5 差異腸道菌群篩選

采用LEfSe分析可以找到組間在豐度上有顯著差異的物種，其結果由原始數據柱狀圖和分支進化圖展示(圖7)。以LDA得分>3為標準，共篩出42個在TiO2NPs染毒組和對照組中存在顯著差異的細菌種類，其中包括擬桿菌門(Bacteroidetes)，放線菌綱(Actinobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、擬桿菌綱(Bacteroidetes)3個菌綱，擬桿菌目(Bacteroi-dales)、梭菌目(Clostridiales)、乳桿菌目(Lactobacillales)、巴斯德氏菌目(Pasteurellales)4個菌目，擬桿菌科(Bacteroidaceae)、雙歧桿菌科(Bifidobacteria-ceae)、腸球菌科(Enterococcaceae)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)等9個菌科，擬桿菌屬(Bacteroides)、腸桿菌屬、腸球菌屬、優桿菌屬(Eubacterium)等17個菌屬以及陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)等8個菌種。

2.6 差異腸道菌群功能預測

利用PICRUSt 2.0軟件，根據KEGG數據庫，對16S rRNA高通量測序數據進行KEGG基因注釋，并預測相關通路和功能。結果提示，共有14種功能和通路具有統計學差異(圖8)，包括“氧化磷酸化”“能量代謝”“磷酸鹽和磷酸鹽代謝”“甲烷代謝”“真核生物中的核糖體發生”“環境適應”“蛋白酶體”“消化系統”“植物-病原相互作用”“傳染?。杭毦薄懊庖呒膊　薄暗鞍踪|消化吸收”“阿米巴病”“系統性紅斑狼瘡”等。

The ordinate represents the 14 functions and pathways with statistical differences, and the ordinate shows the corresponding-lgP values.

3 討論

本研究通過體外消化道微生態模擬方法研究了TiO2NPs對人源腸道菌群的影響。體外模擬系統從液體環境、有機物和無機鹽、寄生菌群、外部環境等多方面盡可能地還原人體消化道微生態，具有簡便快速、相對廉價、符合醫學倫理和可重復利用等優點。目前，體外模擬系統已經在營養學、藥理學和食品化學等領域得到認可和廣泛應用，但在納米材料領域還未得到廣泛應用[22]。Dudefoi等[23]利用SHIME模型培養人工混合的菌群，發現TiO2NPs對細菌群落影響有限，卵形擬桿菌(Bacteroidesovatus)豐度降低，而耳蝸形梭菌(Clostridiumcocleatum)豐度增加。MET-1菌群是由33種標準細菌混合的用于糞菌移植治療的模擬菌群，與本研究所用的直接人來源的糞便菌群有所不同。但本研究也同樣發現了3種擬桿菌屬的細菌(Bacteroidessalyersiae，Bacteroidessp.MarseilleP2653，BacteroidesuniformisdnLKV2)和一種梭菌(ClostridiabacteriumUC5.1-2G4)在對照組和TiO2NPs染毒組之間存在顯著的豐度差異，這提示擬桿菌和梭菌可能是TiO2NPs影響的關鍵人源菌種。體外模擬系統難以完全模擬復雜的體內生理過程，不得不在準確性和易用性之間妥協，這需要在今后的研究和應用中繼續優化改進。

TiO2NPs可以改變影響腸道菌群的組成和結構，影響益生菌的相對豐度，進而影響機體代謝和功能。腸道益生菌是一類對宿主有益的腸道細菌，主要包括乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和革蘭氏陽性球菌(Gram-positive cocci)。本研究發現腸道益生菌在TiO2NPs染毒組和對照組間存在顯著差異，包括乳酸桿菌屬和兩種雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis，Bifidobacte-riumlongum)。與對照組相比，高劑量TiO2NPs染毒組中乳酸桿菌增加而雙歧桿菌減少。在大鼠體內的實驗得到了相似的結果[9-10]，但在小鼠中的部分研究則發現乳酸桿菌相對豐度減少或不變[11-12]。此外，在其他實驗動物中表現出差異的勞森菌(Lawsonia)或生絲微菌屬(Hyphomicrobium)等在本研究中均未被發現。正常人腸道菌群中占比最多的細菌屬是擬桿菌屬、梭菌屬、消化球菌屬(Peptococcus)、雙歧桿菌屬、真桿菌屬(Eubacterium)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)和消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)[24]，其中擬桿菌屬等在本研究中表現出受到TiO2NPs的顯著影響。同時，TiO2NPs還可能通過改變腸道菌群影響機體能量代謝和免疫功能。本研究通過PICRUSt功能預測發現，TiO2NPs對腸道菌群的影響可能引起氧化磷酸化等能量代謝改變、系統性紅斑狼瘡等免疫功能異常以及其他多種代謝和功能變化。TiO2NPs在亞急性和亞慢性動物實驗中均可引起免疫炎癥反應，導致小腸炎性浸潤[9]、上皮細胞形態改變[25]、連接蛋白合成受阻[26]等，并可通過血液循環產生肝、腎、脾等器官損傷[27]。本研究提示，TiO2NPs消化道暴露可能改變人體腸道菌群中的益生菌及其他主要細菌的相對豐度，從而影響人體健康。

綜上所述，體外人消化道微生態模擬系統下TiO2NPs可以影響人源腸道菌群的組成和結構，改變其中益生菌等多種細菌的相對豐度，并可能影響機體的代謝和功能。體外人消化道微生態模擬系統在納米材料消化道暴露后對人源腸道菌群的影響研究中具有較好的應用前景。