黃芩苷對擠壓綜合征大鼠急性腎損傷的保護作用機制研究

邢兆國，王彥志，賈東昭，李琦軍

(石家莊市第三醫院，河北 石家莊 050011)

擠壓綜合征主要發生在地震、滑坡和交通事故等創傷性事件后，長時間壓迫缺血的骨骼肌一旦再灌注，會導致橫紋肌溶解癥(肌細胞分解)。除了局部效應外，還可導致急性呼吸窘迫綜合征、急性腎損傷、循環性休克、全身炎癥反應綜合征、多器官衰竭和混雜的晚期癥狀引起的全身衰竭，急性期病死率高[1-2]。液體療法是擠壓綜合征的一線治療方法，通過早期輸液可以預防休克和急性腎衰竭，使用含碳酸氫鈉的生理鹽水可有效治療急性腎衰竭導致的高鉀血癥[3]，但這些措施很難防止缺血再灌注損傷后炎癥的發生。黃芩苷是從黃芩根中分離得到的一種天然黃酮，具有抗炎、抗氧化和抗凋亡作用[4-5]。近年研究證實黃芩苷可防止急性腎損傷，其作用機制可能與一氧化氮(NO)有關[6-8]。本研究復制擠壓綜合征大鼠模型，探討了黃芩苷是否通過損傷肌肉中內皮型一氧化氮合酶(eNOS)激活機制影響線粒體功能障礙而發揮保護作用。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 雄性SPF級SD大鼠120只，體重250～300 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(冀)2018-1-05。將大鼠安置在溫度為(23±3)℃、相對濕度為(55±15)%的房間中，光照/陰暗周期為12∶12 h，可自由獲取食物和水。

1.2實驗儀器與藥品 PowerLab數據采集系統(AD Instruments，日本名古屋)，Celltac血液分析儀(日本東京日本高登公司)，大鼠白細胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒、大鼠TIM-1/KIM-1/HAVCR ELISA試劑盒(R&D公司，美國明尼蘇達州)，髓過氧化物酶(MPO)(Abcam公司，美國)，超氧化物歧化酶(SOD)分析試劑盒-WST(Dojindo實驗室，日本東京)，線粒體分離試劑盒(Thermo Fisher科技公司，日本神奈川)，JC-1線粒體膜電位分析試劑盒(Cayman化學公司，美國)，eNOS抗體、磷酸化eNOS(p-eNOS)抗體(Ser1177)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)抗體與β-actin抗體(Cell Signaling公司，日本東京)，血紅素氧化酶(HO)-1抗體(Thermo Fisher科技公司，美國)，黃芩苷(Sigma Aldrich公司，美國)。

1.3動物分組與造模方法 將大鼠隨機分為假手術組、模型組、生理鹽水組、生理鹽水+黃芩苷組，每組30只。假手術組麻醉后不做任何處理；其余組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進行麻醉后，參考文獻[9]建立擠壓綜合征模型：將2.0 kg的金屬圓筒綁在大鼠的雙側后肢上，應用橡膠止血帶纏繞5次，并將帶子的末端粘上。壓迫5 h后，切斷繃帶，取下止血帶，解除壓迫。生理鹽水組和生理鹽水+黃芩苷組用橡皮止血帶減壓，然后立即分別進行1，3，6，24 h再灌注，以30 mL/(kg·h)的速度進行大量液體復蘇，生理鹽水+黃芩苷組同時給予黃芩苷20 mg/kg靜滴。

1.4觀察項目及方法

1.4.1平均動脈壓(MAP) 使用PowerLab數據采集系統記錄地圖，計算各組大鼠再灌注后0，1，3，6，24 h的MAP。

1.4.2血液生化參數 各組分別于再灌注后0，1，3，6，24 h從頸靜脈采集靜脈血并離心，測量血鉀(K+)和肌酸磷酸激酶(CPK)水平。使用Celltac血液分析儀(日本東京日本高登公司)測量血細胞比容(Hct)。

1.4.3細胞因子水平 采用ELISA法檢測各組再灌注后0，1，3，6，24 h血清IL-1β和TNF-α水平。

1.4.4腎臟功能 利用PE-50進行膀胱插管，從減壓前1 h開始直到減壓后立即(0 h)采集尿樣，每1 h采集1次，持續24 h，并在20～25 ℃下以1 500×g離心5 min，根據試劑盒說明測定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)水平，采用ELISA法測定尿液中腎損傷因子-1(KIM-1)水平(采用尿肌酐校正)。同時檢測各組再灌注后0，1，3，6，24 h血清NAG水平。

1.4.5硝酸鹽水平 參考文獻[10]的方法，使用專用的HPLC系統(ENO-20，Eicom，京都，日本)測定損傷肌肉(腓腸肌)中亞硝酸鹽(NO2-)、硝酸鹽(NO3-)含量。

1.4.6MPO、SOD活性及活性氧(ROS)含量和線粒體功能 分別于再灌注后0，1，3，6，24 h取各組大鼠損傷腓腸肌組織，測定MPO、SOD活性及硫代巴比妥酸反應產物(TBARS)含量(反映ROS產生情況)，同時測量各時間點血液中MPO活性；利用線粒體分離試劑盒分離肌肉中的線粒體，使用JC-1線粒體膜電位分析試劑盒評估線粒體膜電位(即線粒體內膜功能)；使用Quantikine?cyt c免疫分析法(R&D公司)測量損傷肌肉細胞質(不包括線粒體)中細胞色素C(Cyt C)含量評估線粒體外膜功能。所有操作程序均按照相應的說明手冊執行。

1.4.7損傷肌肉組織中eNOS、p-eNOS、iNOS、HO-1表達情況 采用Western blot法檢測：取各組大鼠損傷肌肉組織，勻漿并離心，用SDS-PAGE分離裂解液中的蛋白質。分別使用抗eNOS、p-eNOS、iNOS、HO-1、β-actin抗體檢測膜上的蛋白質。然后使用結合辣根過氧化物酶的二抗(Pierce Biotechnology)和增強化學發光檢測系統(Pierce生物科技公司)觀察蛋白質條帶。

2 結 果

2.1各組大鼠MAP及血清K+、CPK、Hct比較 模型組大鼠再灌注1，3，6，24 h的MAP均明顯低于假手術組(P均<0.05)，血清K+、CPK和Hct均明顯高于假手術組(P均<0.05)，且血清K+、Hct再灌注6 h最高，CPK再灌注3 h最高。生理鹽水組和生理鹽水+黃芩苷組再灌注1，3，6，24 h的MAP均明顯高于模型組(P均<0.05)，血清K+、CPK和Hct均明顯低于模型組(P均<0.05)，生理鹽水+黃芩苷組再灌注6 h血清K+和再灌注3，6 h CPK水平均明顯低于生理鹽水組(P均<0.05)。見圖1。

圖1 假手術組和擠壓損傷綜合征各組大鼠再灌注后各時間點MAP及血清K+、CPK、Hct

2.2各組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平比較 模型組大鼠再灌注1，3，6，24 h的血清IL-1β、TNF-α水平均明顯高于假手術組(P均<0.05)，且再灌注6，24 h的血清IL-1β水平和3，6，24 h的血清TNF-α水平均明顯高于再灌注1 h(P均<0.05)。生理鹽水組和生理鹽水+黃芩苷組再灌注1，3，6 h的血清IL-1β、TNF-α水平及生理鹽水+黃芩苷組再灌注24 h的血清IL-1β水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，生理鹽水組與生理鹽水+黃芩苷組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖2。

圖2 假手術組和擠壓損傷綜合征各組大鼠再灌注后各時間點血清IL-1β、TNF-α水平

2.3各組大鼠尿液與血漿中NAG水平和KIM-1/Cr比較 再灌注0，1，3，6 h，各組大鼠尿液中NAG水平、KIM-1/Cr比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；再灌注24 h，模型組尿液中NAG水平、KIM-1/Cr均明顯高于假手術組(P均<0.05)，且再灌注6 h和24 h血漿中NAG水平均明顯高于假手術組(P均<0.05)。再灌注24 h，生理鹽水組、生理鹽水+黃芩苷組尿液中NAG水平和生理鹽水+黃芩苷組血漿中NAG水平、KIM-1/Cr均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖3。

圖3 假手術組和擠壓損傷綜合征各組大鼠再灌注后各時間點尿液與血漿中NAG水平及KIM-1/Cr

2.4各組大鼠肌肉組織中NO2-與NO3-含量比較再灌注0，1，3 h，模型組損傷肌肉組織中NO2-和NO3-含量均明顯低于假手術組(P均<0.05)，而再灌注24 h均明顯高于假手術組(P均<0.05)。生理鹽水組再灌注各時間點損傷肌肉組織中NO2-和NO3-含量與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；生理鹽水+黃芩苷組再灌注1，3 h損傷肌肉組織中NO2-和NO3-含量與假手術組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，再灌注6，24 h損傷肌肉組織中NO2-和NO3-含量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且再灌注24 h NO3-含量明顯低于生理鹽水組(P<0.05)。見圖4。

圖4 假手術組和擠壓損傷綜合征各組大鼠再灌注后各時間點損傷肌肉組織中NO2-與NO3-含量

2.5各組大鼠肌肉組織和血液中MPO活性及肌肉組織中SOD活性、TBARS、JC-1與細胞漿中Cyt C含量比較 模型組再灌注6，24 h肌肉組織中MPO活性和再灌注3，6，24 h血液中MPO活性均明顯高于假手術組(P均<0.05)，生理鹽水+黃芩苷組均明顯低于模型組(P均<0.05)，生理鹽水組僅肌肉組織中MPO活性明顯低于模型組(P均<0.05)。再灌注3，6 h，模型組肌肉組織中SOD活性明顯低于假手術組(P均<0.05)，TBARS水平明顯高于假手術組(P均<0.05)；生理鹽水組SOD活性與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，TBARS水平明顯低于模型組(P均<0.05)；生理鹽水+黃芩苷組SOD活性明顯高于模型組(P<0.05)，TBARS水平明顯低于模型組(P<0.05)，但與生理鹽水組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。再灌注1，3，6，24 h，模型組JC-1熒光強度均明顯低于假手術組(P均<0.05)，細胞質中Cyt C含量均明顯高于假手術組(P均<0.05)；生理鹽水組JC-1熒光強度與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，細胞質中Cyt C含量均明顯低于模型組(P均<0.05)；生理鹽水+黃芩苷組JC-1熒光強度均明顯高于模型組(P均<0.05)，細胞質中Cyt C含量均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖5。

圖5 假手術組和擠壓損傷綜合征各組大鼠再灌注后各時間點肌肉組織和血清中MPO活性及肌肉組織中TBARS、SOD活性、JC-1與細胞漿中Cyt C含量

2.6各組大鼠肌肉組織中p-eNOS、iNOS、HO-1表達情況比較 再灌注1，3 h，假手術組、模型組、生理鹽水組損傷肌肉組織中p-eNOS/eNOS和iNOS、HO-1相對表達量比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，生理鹽水+黃芩苷組p-eNOS/eNOS表達量均明顯高于模型組(P均<0.05)。模型組再灌注24 h損傷肌肉組織中 p-eNOS/eNOS表達量和再灌注6，24 h的iNOS、HO-1相對表達量均明顯高于假手術組(P均<0.05)，生理鹽水+黃芩苷組均明顯低于模型組(P均<0.05)，生理鹽水組有降低趨勢，但與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖6。

圖6 假手術組和擠壓損傷綜合征各組大鼠再灌注后各時間點肌肉組織中p-eNOS、iNOS、HO-1表達情況

3 討 論

腎損傷所致腎衰竭是擠壓綜合征的嚴重并發癥，可由循環休克、腎小動脈血管收縮、肌紅蛋白在腎小管內沉積或代謝性酸中毒(尿酸度)引起[11-12]，且肌紅蛋白在腎小管內沉積會導致氧化損傷[13]。目前臨床主要使用含生理鹽水和碳酸氫鹽的液體來預防擠壓綜合征引起的高鉀血癥和循環性休克，維持尿液pH值在6.5以上以防止肌紅蛋白的管內沉積[14]，必要時需要腎臟替代治療，但患者的病死率仍較高。本實驗探討了黃芩苷保護腎損傷的機制，以為其臨床應用提供可靠依據。

本實驗結果顯示，模型組大鼠再灌注1，3，6，24 h的MAP均明顯低于假手術組，血清K+、CPK和Hct均明顯高于假手術組，且血清K+、Hct再灌注6 h最高，CPK再灌注3 h最高；生理鹽水組和生理鹽水+黃芩苷組各時間點的MAP均明顯高于模型組，血清K+、CPK和Hct均明顯低于模型組，且生理鹽水+黃芩苷組再灌注6 h血清K+和再灌注3，6 h CPK水平均明顯低于生理鹽水組。提示黃芩苷干預可改善血壓，預防高鉀血癥的發生，機制可能與降低CPK水平，減少肌肉損傷，促進腎排泄K+和細胞攝取K+有關。

擠壓綜合征腎損傷的發生與炎癥反應密切相關，IL-1β、TNF-α過度表達會加劇腎損傷。尿酸氮、肌酐是評估腎功能的常用指標，但腎損傷早期這些指標變化不明顯。NAG是腎近曲小管上皮細胞中的一種溶酶體酶，在腎小管受損時可被釋放，尿液和血清液中均可以檢測到，但血液中含量明顯低于尿液中含量[15]。KIM-1是腎近曲小管上皮細胞一種跨膜糖蛋白,急性腎損傷時其在受損后再生的近曲小管上皮細胞中表達增多。本實驗結果顯示，模型組大鼠再灌注1，3，6，24 h的血清IL-1β、TNF-α水平均明顯升高，且隨著時間推移逐漸增高；生理鹽水組和生理鹽水+黃芩苷組各時間點的血清IL-1β、TNF-α水平均明顯低于模型組。再灌注0～6 h，各組大鼠尿液中NAG水平、KIM-1/Cr變化不明顯，再灌注24 h明顯升高，血漿中NAG水平再灌注6 h和24 h均明顯升高。再灌注24 h，生理鹽水組、生理鹽水+黃芩苷組尿液中NAG水平和生理鹽水+黃芩苷組血漿中NAG水平、KIM-1/Cr均較模型組明顯降低。提示黃芩苷可抑制炎癥因子過度表達，從而減輕炎癥損傷，保護腎功能。臨床中由于擠壓綜合征腎損傷患者出現無尿，采集尿樣比采血更困難，故可通過檢測血NAG用于評估腎損傷情況。

擠壓綜合征再灌注后會出現肌細胞溶解后的線粒體功能障礙，在缺氧缺血條件下，線粒體功能障礙會使ROS大量生成，導致氧化損傷，血漿中氧化應激標志物MPO與SOD活性增強[16]，Cyt C泄漏到細胞質[17]。NO是一種重要的調節因子，可抑制白細胞黏附[18]、細胞間黏附分子和p-選擇素的表達[19]，其可作為氧自由基清除劑保護線粒體[20]。擠壓的局部肌組織中eNOS和iNOS表達上調，NO生成增加，肌肉組織中NO2-與NO3-含量也相應增多，NO參與擠壓綜合征引起的腎臟損傷[21]。HO-1由NF-κB誘導生成，在缺血再灌注損傷后具有細胞保護作用[22]。本實驗結果顯示，再灌注0，1，3 h，模型組損傷肌肉組織中NO2-和NO3-含量均明顯降低，再灌注24 h均明顯升高；生理鹽水組再灌注各時間點NO2-和NO3-含量與模型組比較變化不明顯，生理鹽水+黃芩苷組再灌注6，24 h NO2-和NO3-含量均明顯低于模型組。模型組再灌注6，24 h肌肉組織中MPO活性和再灌注3，6，24 h血液中MPO活性均明顯升高，生理鹽水+黃芩苷組均明顯低于模型組，生理鹽水組僅肌肉組織中MPO活性明顯低于模型組。再灌注3，6 h，模型組肌肉組織中SOD活性明顯降低，TBARS水平明顯升高；生理鹽水組SOD活性與模型組比較變化不明顯，TBARS水平明顯低于模型組；生理鹽水+黃芩苷組SOD活性較模型組高，TBARS水平較模型組低，但與生理鹽水組比較差異不明顯。再灌注1，3，6，24 h，模型組JC-1熒光強度均明顯降低，細胞質中Cyt C含量明顯升高；生理鹽水組JC-1熒光強度與模型組比較差異不明顯，生理鹽水+黃芩苷組均明顯高于模型組；生理鹽水組和生理鹽水+黃芩苷組細胞質中Cyt C含量均明顯低于模型組。再灌注1，3 h，假手術組、模型組、生理鹽水組損傷肌肉組織中p-eNOS/eNOS和iNOS、HO-1相對表達量均無明顯變化，生理鹽水+黃芩苷組p-eNOS/eNOS表達量均明顯高于模型組；模型組再灌注24 h損傷肌肉組織中 p-eNOS/eNOS表達量和再灌注6，24 h的iNOS、HO-1相對表達量均明顯升高，生理鹽水+黃芩苷組均較模型組低。提示再灌注后損傷肌肉存在SOD活性降低和線粒體功能紊亂，黃芩苷干預未顯示出直接清除自由基的能力，但可通過改善線粒體膜電位和線粒體外膜功能來防止線粒體損傷，可激活eNOS的抗自由基作用，減輕氧化損傷。生理鹽水+黃芩苷組HO-1相對表達量降低，其原因可能是缺血再灌注損傷后HO-1蛋白表達受到抑制。

綜上所述，黃芩苷可能通過改善擠壓綜合征肌細胞溶解后的線粒體功能障礙，抑制炎癥反應來發揮腎臟保護作用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。