鎘對鴨破骨細胞焦亡的影響

王 怡，馬勇剛，冉 迪，劉宗平*

(1.揚州大學 獸醫學院,江蘇 揚州，225009；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心,江蘇 揚州 225009)

近年來，我國畜禽飼料受到不同程度的鎘污染，多地抽檢的飼料樣品出現鉛鎘含量超標[1]。飼料中鎘的持續污染主要以食物鏈的方式進入人和動物體內[2]，生物半衰期可達10～30年，主要蓄積在肝、腎和骨骼，但其對骨骼的毒性機制尚不明確。破骨細胞是一種多核的終末分化細胞，主要負責降解骨基質，在骨代謝中發揮著重要的作用[3]。研究發現，破骨細胞功能抑制是鎘誘導骨質疏松的主要原因[4]。

研究發現，細胞凋亡在鎘誘導的鴨骨質疏松中發揮了重要作用[5]，鎘暴露明顯增加了鴨成骨細胞和破骨細胞的凋亡。除了細胞凋亡外，其他的細胞死亡方式是否參與鎘誘導的骨質疏松？細胞焦亡是一種非典型的程序性細胞死亡方式[6]。不同于細胞凋亡，細胞焦亡會呈現一系列與炎癥反應相關的形態變化和生理結果，主要表現為細胞膜的通透性改變，細胞內容物大量釋放，細胞膜有大量孔道形成，最終細胞裂解死亡而引發炎癥反應[7]。經典的細胞焦亡是由活化后的炎性半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1) 切割活化的GSDMD所介導[8]，除此之外，活化后的Caspase-1同時也可以剪切細胞因子IL-18和IL-1β的前體使其成熟[9]。近年來的研究發現，細胞焦亡參與了很多疾病的發生與發展[10]。但鎘暴露是否可以誘導破骨細胞焦亡依然尚未闡明。本研究以鴨破骨細胞為模型，通過多種方法探究鎘暴露是否可以誘導鴨破骨細胞發生焦亡，為鎘誘導的骨質疏松提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級鴨胚，由高郵市種鴨繁殖基地提供。

1.2 主要試劑LDH檢測試劑盒 (碧云天生物技術有限公司)；IL-18和IL-1β檢測試劑盒 (上海酶聯生物技術有限公司)；Annexin V-FITC 細胞死亡檢測試劑盒 (南京諾唯贊生物科技有限公司)；Hoechst染色液 (翌圣生物科技有限公司)；Caspase-1試劑盒 (Immunochemistry,USA)。

1.3 鴨破骨細胞分離與培養15日齡的SPF級鴨胚表面消毒，分離股骨，用不含血清的培養基沖出骨髓，過濾后離心。用含血清的培養基重懸細胞，離心后接種于培養板中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。待細胞貼壁后換新鮮培養基，如果細胞密度適宜，5 d后可見大量成熟的破骨細胞。

1.4 鴨破骨細胞形態的觀察成熟的破骨細胞鎘暴露12 h后，在倒置顯微鏡下觀察破骨細胞形態變化并拍照。

1.5 ELISA試劑盒檢測LDH、IL-18和IL-1β的含量鴨破骨細胞經鎘處理結束后，根據試劑盒說明書檢測LDH、IL-18和IL-1β的含量，根據D值計算出各自的相對含量。

1.6 Casepase-1活性和細胞焦亡的檢測待細胞處理完成后，用胰酶消化細胞，收集細胞于流式管中，分別用FITC、PI和SYTOX標記細胞，用流式細胞儀檢測其活性和焦亡率。

1.7 用PI和Hoechst染色觀察破骨細胞膜的完整性細胞處理結束后，棄去細胞板中培養基，加入含PI和Hoechst的PBS在培養箱孵育1 h，在熒光顯微鏡下觀察各自的熒光強度。

1.8 數據分析所有數值均使用GraphPad Prism軟件分析作圖,數據用“平均值±標準差”表示。P<0.05表示組間差異顯著,P<0.01表示組間差異極顯著。

2 結果

2.1 鎘暴露對鴨破骨細胞形態的影響如圖1所示，鴨骨髓單核巨噬細胞培養5 d后，可獲得多核的破骨細胞，用鎘處理12 h，采用倒置顯微鏡觀察破骨細胞的形態。結果顯示，對照組破骨細胞形態完整，細胞膜表面光滑，鎘暴露明顯改變了破骨細胞形態，主要表現為破骨細胞腫脹，具有立體感，細胞膜表面出現大量孔洞。上述結果表明，鎘暴露改變了破骨細胞形態。

圖1 鎘對鴨破骨細胞形態的影響

2.2 鎘暴露對鴨破骨細胞內LDH釋放的影響如圖2所示，成熟鴨破骨細胞鎘處理12 h后，采用LDH試劑盒檢測破骨細胞內LDH的釋放。結果顯示，隨著鎘暴露濃度的增加，LDH的釋放量顯著高于對照組 (P<0.05)。

與對照組相比，*P<0,05，**P<0.01。下同

2.3 鎘對鴨破骨細胞焦亡率的影響如圖3所示，鴨破骨細胞鎘暴露12 h后，流式細胞術檢測破骨細胞焦亡率。結果顯示，與對照組相比，鎘暴露明顯增加了破骨細胞的焦亡率 (P<0.05)。

圖3 鎘對鴨破骨細胞焦亡的影響

2.4 鎘對鴨破骨細胞Caspase-1活性的影響如圖4所示，為了探討Casepase-1是否參與鎘誘導的鴨破骨細胞焦亡，流式細胞術檢測了Caspase-1的活性。結果顯示，與對照組相比，隨著鎘濃度的增加，Caspase-1的活性逐漸增加 (P<0.05)。

圖4 鎘對鴨破骨細胞Caspase-1活性的影響

2.5 鎘對鴨破骨細胞內IL-1β和IL-18的影響圖5所示，ELISA試劑盒檢測破骨細胞內IL-1β和IL-18含量。結果顯示，隨著鎘濃度的增加，與對照組相比，破骨細胞內IL-1β的含量呈劑量依賴性增加 (P<0.05)，IL-18的含量也顯著增加 (P<0.05)。

圖5 鎘對鴨破骨細胞IL-18(左)和IL-1β(右)的影響

2.6 鎘對鴨破骨細胞PI和Hoechst染色的影響如圖6所示，采用PI和Hoechst染色觀察破骨細胞細胞膜和細胞核的完整性。結果顯示，與對照組相比，鎘暴露后紅色熒光明顯增強，同時藍色熒光也顯著增強。

圖6 鎘對鴨破骨細胞PI和Hoechst染色的影響

3 討論

研究發現，鎘暴露與骨質疏松等疾病有密切的關系，但是很少有研究揭示細胞焦亡在骨質疏松中的機制。本課題組前期研究證實了鎘暴露誘導大鼠原代成骨細胞凋亡[11]。近年來，隨著全球工農業的不斷發展，重金屬污染日趨嚴重，有關鎘毒性的研究也越來越多。本研究采用鴨成熟破骨細胞暴露于鎘建立細胞損傷模型，探討鎘誘導鴨破骨細胞死亡的機制，為后期進一步了解鎘誘導的骨損傷提供新思路。

重金屬鎘是一種嚴重影響動物和人類健康的環境污染物，骨骼是其主要的靶器官之一。近期研究發現鎘暴露促進了鴨破骨細胞的凋亡及抑制了破骨細胞的分化，表現出明顯的骨質疏松[5]。細胞凋亡是不同于細胞焦亡的一種程序性死亡方式，細胞凋亡時主要表現出細胞皺縮，細胞骨架解體，細胞核濃縮等。細胞凋亡涉及一系列基因的調控，病理和生理條件下均可發生[12-13]。本研究結果顯示，鎘暴露可使鴨破骨細胞腫脹、具有立體感以及空洞的形成，最終誘導破骨細胞死亡。該種死亡方式明顯不同于細胞凋亡，但完全符合細胞焦亡的形態特征。因此，破骨細胞焦亡很可能是鎘誘導其死亡的主要途徑。

除此之外，細胞凋亡和焦亡都是由Casepase家族介導，細胞焦亡主要是由Caspase-1和Caspase-3介導[14]，細胞凋亡主要是Caspase-8和Caspase-9介導的[15]。Casepase-1是屬于Caspase家族的成員，其激活主要依賴于炎性小體的組裝。當外源性的刺激激活炎性小體后，可直接招募Caspase-1，使其發生自剪切激活[16]。激活后的Casepase-1可誘導細胞發生焦亡，同時可剪切細胞因子IL-18和IL-1β的前體使其成熟，Caspase-3是不依賴炎性小體而參與調控細胞焦亡。本研究發現，鎘暴露后，Casepase-1的活性明顯增加，IL-18和IL-1β的產生也伴隨鎘濃度的增加顯著升高。另外，細胞發生焦亡時細胞膜通透性增加，內容物大量釋放，同時胞外的水分透過細胞膜孔道大量進入胞內，使細胞腫脹，最終細胞裂解死亡[17]。本研究發現，鎘暴露后破骨細胞除了形態發生明顯改變外，破骨細胞內LDH釋放量顯著增加，這進一步說明破骨細胞由于細胞膜破裂而發生大量死亡。結合焦亡的特征，本研究進一步驗證了鎘誘導鴨破骨細胞焦亡的發生。細胞凋亡時，細胞膜上的磷脂酰絲氨酸外翻與FITC-AnnexinV結合，但此時由于細胞膜并未破裂，PI不能夠進入細胞與DNA結合，而發生細胞焦亡時由于細胞膜破裂，PI可直接進入細胞內，形成FITC和PI雙染的細胞群[18]。本研究結果表明，鎘暴露明顯增加了FITC和PI雙染的細胞群，進一步表明鎘暴露引起了鴨破骨細胞發生焦亡。PI和Hoechst染色進一步驗證了鎘暴露誘導鴨破骨細胞發生焦亡而不是凋亡?？傊?，本試驗結果表明，鎘暴露誘導了鴨破骨細胞發生焦亡。