黃芪幼苗根系生長發育與GR24和IAA的關系

黃曉宇　龐娟　 陳貴林

摘要：為探究獨腳金內酯和生長素對黃芪根系生長發育的影響，該研究以膜莢黃芪和蒙古黃芪幼苗為材料，在種子萌發袋中添加不同濃度GR24和IAA（2 μmol·L1GR24、5 μmol·L1IAA和2 μmol·L1GR24+5 μmol·L1IAA），7 d后檢測黃芪幼苗主根長和側根數，并測定內源激素含量、生長素和獨腳金內酯相關基因表達量的變化。結果表明：（1）GR24處理顯著促進黃芪主根生長。（2）IAA處理下主根生長受到抑制，側根數明顯增加。（3）GR24+IAA處理下主根的生長同樣受到抑制，膜莢黃芪側根數較IAA處理下減少，說明GR24有抑制IAA對側根發育的誘導作用，但不能緩解IAA對黃芪主根生長的抑制。（4）3種處理下黃芪幼苗根系內源激素含量、生長素和獨腳金內酯相關基因表達量發生了顯著變化，說明GR24和IAA對黃芪幼苗主根長和側根數的影響可能與生長素和獨腳金內酯相關基因表達及內源激素水平的變化有關。該研究結果初步闡明了黃芪幼苗根系生長發育與GR24和IAA之間的關系，為黃芪規范化育苗和幼苗質量控制提供理論依據，對進一步探索獨腳金內酯和生長素調控黃芪根系生長發育的分子機制具有一定的意義。

關鍵詞： 黃芪， 主根， 側根， 獨腳金內酯， 生長素， 基因表達

中圖分類號：Q945

文獻標識碼：A

文章編號：10003142（2022）05084510

Relationship between root growth and development

of Astragalus seedlings and GR24 and IAA

Abstract：In order to explore the effects of strigolactones and auxin on the growth and development of Astragalus roots， Astragalus membranaceus ?and A. membranaceus var. mongholicus seedlings were put into seed germination bag with different concentrations of GR24 and IAA （2 μmol·L1GR24， 5 μmol·L1IAA and 2 μmol·L1GR24+5 μmol·L1IAA）. Primary root length and lateral root number of Astragalus seedlings were measured， and endogenous phytohormones， the expression levels of auxin and strigolactone related genes were determined after seven days treatment. The results were as follows： （1） GR24 treatment could significantly promote the growth of primary roots of Astragalus. （2） The growth of primary roots was inhibited under IAA treatment， and the number of lateral roots was significantly increased. （3） The growth of primary roots under GR24+IAA treatment was also inhibited， the number of lateral roots of A. membranaceus was reduced compared with that under IAA treatment， indicating that GR24 can inhibit the induction of IAA to lateral root development， but can not alleviate the inhibition of IAA to primary root growth. （4） The levels of endogenous hormones， auxin and strigolactone related gene expression in the root of Astragalus seedlings under the three treatments were changed significantly， indicating that the effects of GR24 and IAA on primary root length and lateral root number of Astragalus seedlings may be related to these changes. The results preliminarily clarify the relationship between the root growth and development of Astragalus seedlings and GR24 and IAA， and provide a theoretical basis for the standardized breeding and seedling quality control of Astragalus. It also has certain significance to further explore the molecular mechanism of strigolactones and auxin regulating the growth and development of Astragalus root.

Key words： Astragalus， primary roots， lateral roots， strigolactones， auxin， genes expression

生長素是最早發現且目前研究最多的一類植物激素，一直以來被認為是參與植物根系生長發育最關鍵的核心植物激素（Saini et al.， 2013; Wei et al.， 2016）。生長素的分布、極性運輸和信號轉導決定著植物根系的形態建成（Saini et al.， 2013）。生長素在植物地上部幼嫩組織合成后，通過維管組織運輸到根部（Ljung et al.， 2005; Teale et al.， 2006）。生長素輸入載體AUX1/LAX、生長素輸出載體PIN和ABCB轉運蛋白介導生長素在細胞間的極性運輸（Okushima et al.， 2005; Vieten et al.， 2007; Vanneste & Friml， 2009），使生長素在根部形成一定的濃度梯度，為根的生長發育提供所需的最佳生長素濃度（Teale et al.， 2006）。而PIN蛋白在質膜的定位也進一步影響著細胞極性、生長素分布和根部組織分化（Aida et al.， 2004）。在生長素調控根生長發育的信號轉導過程中，了解最清晰的是泛素化介導的蛋白酶體降解途徑。當生長素響應因子ARF被活化后，其會調控下游參與根生長發育的生長素應答基因表達，進而調控根的生長和發育（Guilfoyle & Hagen， 2007; Saini et al.， 2013）;生長素響應因子ARF7和ARF19通過激活LBD/ASL基因而調控側根的形成（Okushima et al.， 2007）。另外，Zhang等（2008）研究表明MAPK途徑也參與生長素的極性運輸與根的發育。

獨腳金內酯是一類主要產生于植物根系的植物激素，最初發現其具有刺激寄生植物種子萌發的作用（Cook et al.， 1966;Waldie et al.， 2014）。進一步研究表明，它還能夠促進叢枝菌根真菌菌絲分枝（Xie et al.， 2010），抑制植物分枝（GomezRoldan et al.， 2008; 馮丹和陳貴林，2011），調控植物根系的生長發育（Koltai， 2010; RuyterSpira et al.， 2011; Hu et al.， 2018）。擬南芥獨腳金內酯合成突變體max3和max4及獨腳金內酯信號突變體max2較野生型植株主根變短且側根增加，表明獨腳金內酯正調控主根的生長而負調控側根形成（Kapulnik et al.， 2011; RuyterSpira et al.， 2011）。隨著獨腳金內酯類似物GR24的開發與利用及現代分子生物學技術的應用，發現GR24一方面通過抑制生長素外輸載體活性影響生長素正常的極性運輸，從而調控主根的生長和側根的發育（Koltai et al.， 2010;RuyterSpira et al.， 2011）;另一方面，通過刺激分生組織細胞分裂使細胞數量增加進而促進主根生長（RuyterSpira et al.， 2011），但也有研究認為GR24促進了皮層細胞的伸長而不是細胞分裂（Koltai et al.， 2010）。同時，GR24處理阻礙了側根原基由V階段向VI階段的轉換，因而抑制側根形成（RuyterSpira et al.， 2011）;也有學者認為GR24影響側根發生的起始并不影響側根原基的發育（Kapulnik et al.， 2011）。因此，關于獨腳金內酯如何在細胞水平上調控植物根系的生長發育存在很多爭論，對獨腳金內酯如何在分子層面與細胞層面調控根系生長發育的進一步研究將有助于闡明獨腳金內酯在植物根系形態結構建成中所發揮的重要作用。

黃芪作為中醫臨床上常用大宗中藥材，以膜莢黃芪（Astragalus membranaceus）或蒙古黃芪（A. membranaceus var. mongholicus）的干燥根入藥，用量大且用途廣泛（劉強等，2008;陳貴林，2018）。市場上主要以主根長、側根數少的外觀形態指標作為優質黃芪的主要評價標準。黃芪外觀品質在一定程度上影響其有效成分含量。而在農業生產中，黃芪多以移栽苗的方式進行種植。因此，培育優質的黃芪幼苗對于提高黃芪的藥用價值具有重要意義。目前，關于獨腳金內酯和生長素調控植物根系生長發育的研究多集中于水稻、擬南芥和番茄等植物上，而對藥用植物的研究卻鮮有報道。因此，本文基于相關研究報道及前期對黃芪幼苗外施不同濃度的GR24和IAA處理的預實驗結果，最終選取2 μmol·L1GR24、5 μmol·L1IAA和2 μmol·L1GR24 + 5 μmol·L1IAA對黃芪幼苗進行處理，研究GR24、IAA以及二者相互作用對黃芪根系形態、內源激素水平和獨腳金內酯與生長素相關基因表達的影響，為黃芪規范化育苗和幼苗質量控制提供科學依據，同時也為獨腳金內酯和生長素調控藥用植物根系生長發育的分子機制研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1 材料

以膜莢黃芪（Astragalus membranaceus）和蒙古黃芪（A. membranaceus var. mongholicus）為材料，黃芪種子均采購于內蒙古豐鎮市天創農牧業有限公司。

1.2 實驗設計

分別取適量的膜莢黃芪和蒙古黃芪種子于50 mL離心管中，清水沖洗干凈，95%乙醇溶液消毒1 min，0.1% HgCl溶液消毒30 s，無菌水沖洗5～6次，浸泡4 h。之后，將黃芪種子播種于鋪有無菌水浸濕濾紙的培養皿（規格：9 cm）后置于24 ℃恒溫培養箱中黑暗培養。

以1/2 MS營養液為母液，通過添加IAA（3吲哚乙酸）和GR24（人工合成的獨腳金內酯類似物）配制不同IAA濃度（0.04、0.2、1和5 μmol·L1）和GR24濃度（0.01、0.1、1和2 μmol·L1）的營養液，pH值5.8。采用種子萌發袋（高14 cm，寬12.5 cm;北京啟維益成科技有限公司）培養幼苗，每個種子萌發袋中添加10 mL不同IAA濃度和GR24濃度的營養液，對照組（CK）添加10 mL蒸餾水。待黃芪種子黑暗條件下萌發3 d后，將下胚軸長約1 cm、長勢一致的黃芪幼苗轉移到種子萌發袋中（圖版I）。每個種子萌發袋放入6株黃芪幼苗，為一個處理，每處理3個種子萌發袋，兩種黃芪共計30個種子萌發袋180株幼苗。將幼苗置于24 ℃ 恒溫生長室中培養，培養條件為16 h/8 h光周期。每個種子萌發袋隔2 d補充一次1/2 MS營養液，處理7 d后取樣，測量幼苗主根長和統計幼苗側根數。根據以上不同IAA濃度和GR24濃度的處理結果，最終篩選2 μmol·L1GR24、5 μmol·L1IAA和2 μmol·L1GR24+5 μmol·L1IAA分別對黃芪幼苗進行處理，處理7 d后取樣，檢測幼苗主根長、側根數，并測定幼苗根系內源激素含量、獨腳金內酯和生長素相關基因表達量。

1.3 方法

1.3.1 根系形態指標測定收集每個處理18株黃芪幼苗，將根部沖洗干凈，使用直尺測量主根長，在體式顯微鏡（Leica EZ4 HD）下觀察側根，人工統計側根數量。

1.3.2 內源激素含量測定

黃芪幼苗根系生長素（IAA）、獨腳金內酯（SLs）、脫落酸（ABA）和細胞分裂素（CTK）含量參照朱莉莉等（2020）的方法進行提取，采用植物激素酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）進行檢測，使用全光譜酶標儀（美國賽默飛世爾科技公司）在450 nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中植物激素含量，各激素標準曲線的線性關系如表1所示。

1.3.3 黃芪根系總RNA提取及反轉錄按照全式金生物技術有限公司提供的Easy Pure Plant RNA kit試劑盒提取各處理組黃芪幼苗根系總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，采用NanoDrop 2000紫外分光光度計對其濃度和純度進行檢測。參照該公司提供的TransScript AllinOne FirstStrand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（OneStep gDNA Removal）逆轉錄試劑盒將總RNA合成cDNA，放于-20 ℃下保存。

1.3.4 熒光定量PCR采用TransStart Tip Green qPCR SuperMix試劑盒進行熒光定量PCR檢測基因的表達量，使用primer express 3.0.1設計引物（Singh & Pandey， 2015），引物見表2。qPCR反應體系為20 μL，包括2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL、正反向引物各0.4 μL（10 μmol·L1）、Nucleasefree Water 7.2 μL、模板cDNA 2 μL（10 ng·μL1）。反應程序：94 ℃預變性3 min;94 ℃ 5 s，58 ℃ 34 s，72 ℃ 30 s，重復40個循環，每個樣品做3個重復。以18S rRNA作為內參基因，采用2-ΔΔCT方法（Livak & Schmittgen， 2001）分析基因的表達量，實驗儀器采用ABI Prism 7500熒光定量PCR儀。

1.4 數據分析

采用SPSS 22.0軟件統計分析結果，進行單因素方差分析（ANOVA），并使用GraphPad Prism 8繪制柱狀圖，結果用平均值±標準誤顯示。

2結果與分析

2.1 不同濃度GR24與IAA對黃芪幼苗主根長和側根數的影響

由圖1可知，隨著IAA處理濃度的升高，兩種黃芪主根長呈先增長后降低的趨勢。與CK相比，0.2 μmol·L1 IAA顯著促進黃芪主根的生長，1 μmol·L1 IAA和5 μmol·L1 IAA抑制了主根的生長。不同濃度IAA處理下側根數與CK相比均明顯增加。0.1 μmol·L1 GR24、1 μmol·L1 GR24和2 μmol·L1 GR24處理下主根長均顯著高于CK，且隨濃度的升高主根長呈增加的趨勢;而CK和不同濃度GR24處理下均未見黃芪側根發育和生長。表明GR24可促進黃芪主根的生長，其中1 μmol·L1 GR24和2 μmol·L1 GR24作用效果較顯著;0.04 μmol·L1 IAA和0.2 μmol·L1 IAA可促進黃芪主根的生長，1 μmol·L1 IAA和5 μmol·L1 IAA抑制主根的生長;不同濃度IAA對黃芪側根的發育均具有促進作用。

2.2 GR24與IAA對黃芪幼苗主根長和側根數的影響

由圖2可知，CK和IAA、GR24和GR24+IAA處理下黃芪主根隨著生長天數的增加均呈逐漸增長的趨勢;GR24處理的兩種黃芪主根明顯長于同一生長時期CK的黃芪主根，蒙古黃芪的變化趨勢略小于膜莢黃芪;而IAA和GR24+IAA處理的黃芪主根均明顯短于CK，且較CK生長緩慢。

由圖3可知，與CK相比，GR24處理的兩種黃芪主根顯著增長，側根數沒有發生顯著變化;IAA處理下兩種黃芪主根顯著變短、側根數增加，且膜莢黃芪側根數顯著多于蒙古黃芪;GR24+IAA處理下兩種黃芪主根仍顯著短于CK，與IAA單獨處理下無顯著差異，膜莢黃芪側根數顯著少于IAA單獨處理。表明GR24處理對黃芪主根生長具有促進作用;IAA抑制黃芪主根生長，誘導側根發生;GR24+IAA處理下，GR24不能緩解IAA對黃芪主根生長的抑制，可以抑制IAA對膜莢黃芪側根發生的誘導。

2.3 GR24與IAA對黃芪幼苗根系內源激素含量的影響

與CK相比，IAA、GR24和GR24+IAA處理均增加了膜莢黃芪根系IAA和SLs含量（圖4：A，B），而CTK和ABA含量顯著降低（圖4：C，D）。另外，3種處理也均顯著增加了蒙古黃芪根系IAA含量，但對其根系CTK和ABA含量變化沒有顯著影響，SLs含量在GR24和GR24+IAA處理下顯著增加（圖4）。表明IAA和GR24處理顯著影響了兩種黃芪根系內源激素水平，且膜莢黃芪與蒙古黃芪根系內源激素水平變化存在一定的差異。

2.4 GR24與IAA對黃芪幼苗根系生長素相關基因表達的影響

由圖5可知，與CK相比，IAA處理顯著增加了AmPIN1、AmPIN2和AmARF19基因在膜莢黃芪根系的表達，而降低了AmARF7基因表達;蒙古黃芪根系AmPIN1、AmARF7和AmARF19基因表達量均顯著增加，且AmPIN1和AmARF7基因的表達均顯著高于膜莢黃芪，AmPIN2基因在蒙古黃芪根系的表達顯著降低。GR24處理的膜莢黃芪根系與CK相比，AmPIN1、AmPIN2和AmARF7基因表達顯著降低，蒙古黃芪根系中僅AmPIN1和AmARF7基因表達降低。GR24+IAA處理增加了AmPIN1、AmPIN2基因在膜莢黃芪根系的表達， 降低了AmARF7基因的表

達;而蒙古黃芪根系僅AmPIN1表達增加，AmARF7表達減少。表明GR24和IAA影響了黃芪根系生長素相關基因的表達，且膜莢黃芪與蒙古黃芪具有差異的基因表達模式。

2.5 GR24與IAA對黃芪幼苗根系獨腳金內酯相關基因表達的影響

由圖6可知，與CK相比，IAA處理顯著增加了膜莢黃芪根系AmMAX2和AmD14基因的表達，AmCCD8的表達減少;蒙古黃芪根系AmMAX1、AmCCD8、AmMAX2和AmD14的表達均顯著增加，且AmMAX1、AmCCD8和AmD14的表達顯著高于膜莢黃芪。GR24處理顯著增加了膜莢黃芪根系AmMAX1和AmMAX2基因的表達，降低了AmCCD8基因的表達;蒙古黃芪根系AmMAX2和 AmD14表達水平增加，AmMAX1表達降低。GR24+IAA處理均降低了AmCCD8、AmMAX2和AmD14基因在膜莢黃芪和蒙古黃芪根系表達量，增加了AmMAX1基因在蒙古黃芪中的表達，降低了其在膜莢黃芪中的表達。表明IAA和GR24同時也影響了黃芪根系獨腳金內酯相關基因的表達，且獨腳金內酯相關基因在膜莢黃芪與蒙古黃芪根系也具有差異的基因表達模式。

3討論與結論

已有研究表明，獨腳金內酯影響植物根系的形態結構，且生長素是調控植物根系生長發育的關鍵激素，本研究深入探究了獨腳金內酯和生長素與黃芪根系生長發育之間的關系。GR24處理顯著促進了膜莢黃芪和蒙古黃芪幼苗主根的生長，主根的長度明顯增加。這與前人對番茄（Koltai et al.， 2010）、水稻（RuyterSpira et al.， 2011）和高茅草（Hu et al.， 2018）的研究結果一致，說明獨腳金內酯對植物主根具有正調控作用。通常，生長素在低濃度下會促進植物根的生長，高濃度抑制根的生長，促進側根發育（Xing et al.， 2016; Lu et al.， 2019），在黃芪中也得到了相同的結果。兩種黃芪幼苗在5 μmol·L1 IAA處理下主根生長均受到抑制，側根數增加。GR24+IAA共同作用下，主根長較IAA單獨處理下無顯著差異，膜莢黃芪側根數量卻明顯減少，說明GR24可以減輕IAA對側根發育的誘導。

PIN1和PIN2基因是生長素輸出載體PINs家族的兩個成員，在生長素運輸和根系生長素濃度梯度的建立過程中發揮著重要作用（Blilou et al.， 2005; Blakeslee et al.， 2005; Saini et al.， 2013）。本研究中qPCR結果表明GR24處理的兩種黃芪幼苗根系AmPIN1基因表達下調，AmPIN2在膜莢黃芪根系表達下調，說明GR24抑制了生長素運輸基因的表達，進而可能通過影響生長素向根系的極性運輸，打破根系生長素濃度梯度的平衡，促進黃芪主根生長。IAA和GR24+IAA處理促進了AmPIN1基因和AmPIN2基因的表達，因此黃芪幼苗主根生長受到了抑制。Hu等（2019）研究表明，GR24同樣抑制了高茅草冠根PIN1和PIN2基因的表達，NAA和NAA+GR24處理促進了PIN1和PIN2基因表達，與我們的結果相一致。因此，進一步證實了GR24可能通過影響生長素運輸而調控黃芪根系生長和發育。同時，我們發現AmPIN2基因在蒙古黃芪幼苗根系中的表達與膜莢黃芪存在差異，這可能由于膜莢黃芪與蒙古黃芪之間遺傳上的差異和信號轉導的復雜性所致。

除了生長素運輸載體外，生長素響應因子ARFs也參與調控根的生長和發育（Guilfoyle & Hagen， 2007; Chen et al.， 2018; Guan et al.， 2019）。本研究中，IAA處理下AmARF7和AmARF19的表達在蒙古黃芪幼苗根中上調。Chen等（2019）研究發現縮節胺使棉花幼苗根中GhARF7/19和GhLBD18s基因表達上調而促進了側根起始和側根伸長生長，從而使側根數量增加。Okushima等（2007）研究表明，ARF7和ARF19作為轉錄激活因子，通過激活LBD/ASL基因的表達來促進側根形成。因此，推測IAA可能同樣通過誘導黃芪根中AmARF7和AmARF19基因表達，促進了側根發育，側根數量增加;GR24+IAA處理下AmARF7和AmARF19基因在蒙古黃芪根系表達量相比IAA處理下減少，因而側根的發育被減緩。但是AmARF7和AmARF19是否通過誘導AmLBDs基因的表達而促進黃芪側根發育還需要進一步的探究。另外，與CK相比，雖然GR24處理的兩種黃芪根系中AmARF7的表達發生下調，但是CK組和GR24處理下側根均未發育，這可能是由于幼苗生長周期較短所致，因而GR24對側根的發育是否具有抑制作用，還需要進一步研究。

生長素還會通過影響獨腳金內酯的合成和信號轉導，進一步調控植物根的生長和發育（Saini et al.， 2013; Hu et al.， 2018）。Hu等（2018）研究表明，NAA處理能夠顯著上調高茅草冠根中獨腳金內酯信號轉導基因D3和D14的表達。本研究中，IAA處理后獨腳金內酯合成基因MAX1和CCD8在蒙古黃芪幼苗根中顯著上調，獨腳金內酯信號轉導基因MAX2和D14的表達在膜莢黃芪和蒙古黃芪中均上調。因此，IAA可能通過誘導MAX1和CCD8基因表達，促進獨腳金內酯合成，使其含量增加;獨腳金內酯進一步通過影響生長素運輸和信號轉導途徑而調控根的生長和發育;同時通過其自身的信號轉導而調控根的生長和發育。

在植物根的生長發育過程中，每個植物激素并不是單獨地發揮作用，而是互相之間形成動態的反饋環，協同控制根的形成與發育（Hayward et al.， 2009;Saini et al.， 2013）。研究表明生長素與獨腳金內酯能夠顯著影響根系內源激素水平和分布（Hayward et al.， 2009）。本研究IAA、GR24和GR24+IAA處理均導致膜莢黃芪根系IAA和SLs含量增加，CTK和ABA含量減少;在蒙古黃芪根系中IAA和SLs含量增加，CTK和ABA含量沒有顯著變化。因此，說明外源激素信號改變了黃芪根系激素的內穩態，且內源激素水平的變化在不同黃芪中表現出很大的差異性。這種激素水平的變化，可能導致各個激素之間形成新的信號轉導網絡，協調互作從而參與植物生長過程，進而改變黃芪根系的生長發育;另外，兩種黃芪的遺傳差異，可能導致對外源激素信號應答水平的不同，所以出現差異的內源激素水平變化。今后對不同黃芪內源激素變化的深入研究，將有助于進一步理解黃芪對外源信號刺激的應答機制。

綜上所述，本研究發現2 μmol·L1GR24處理可促進黃芪主根生長且可以抑制IAA對黃芪側根發育的誘導，對培育優質黃芪種苗具有重要實踐意義。GR24和IAA對黃芪根系結構的改變可能與生長素和獨腳金內酯相關基因表達的改變及內源激素水平變化有關，為闡明獨腳金內酯和生長素調控黃芪根系生長發育的分子機制奠定了基礎，獨腳金內酯和生長素如何在細胞水平及與其他植物激素之間精細的互作調控黃芪根系的生長發育今后還有待研究。

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（責任編輯周翠鳴）

收稿日期：2021-07-04

基金項目：國家自然科學基金（81660630）;內蒙古自治區科技重大專項課題（ZDZX2018049）;內蒙古科技廳項目（201702114）

第一作者： 黃曉宇（1995-），碩士研究生，主要從事藥用植物化學研究，（Email）huangxiaoyu2340322@163.com。

通信作者：陳貴林，博士，教授，博士生導師，主要從事藥用植物化學研究，（Email）guilinchen61@163.com。