大黃素聯合雷替曲塞抑制胰腺癌細胞增殖及對血管緊張素轉換酶2、血管緊張素Ⅱ的影響Δ

馬 曉，尚 昆，林海珊，王 婧

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院腫瘤科，北京 100050)

胰腺癌是發病率高、致死率高的消化道惡性腫瘤之一，具有起病隱匿、發展迅速和治療效果欠佳的特點。即使目前腫瘤的靶向治療及免疫治療發展迅速，厄洛替尼、奧拉帕利和程序性細胞死亡蛋白-1抑制劑相繼被納入指南，但患者的生存期并未出現顯著延長，治療尚無明顯突破。胰腺癌患者腹部脹滿不適常見，大黃類藥物有一定療效，既往研究結果也發現大黃素具有保護胰腺、抑制胰腺癌細胞增殖的作用[1]。雷替曲塞為抗代謝類葉酸類似物，能夠經過還原葉酸載體攝入腫瘤細胞，進而被葉酰聚谷氨酸合成酶轉化成聚谷氨酸鹽，并貯存于腫瘤細胞中，從而發揮更強的抑制胸苷酸合成酶作用，并能夠延長抑制時間，有效提高抗瘤活性[2]。對于老年患者或者心臟風險大的患者，接受雷替曲塞治療的安全性良好，因此，雷替曲塞在臨床中應用廣泛。本研究擬通過大黃素與雷替曲塞聯合應用，觀察其對胰腺癌細胞增殖能力的影響及對血管緊張素轉換酶2(ACE2)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的作用效果，為臨床用藥提供更多理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

PANC-1胰腺癌細胞系購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，于含10%胎牛血清的1640培養基培養傳代。

1.2 儀器

ELx800型酶標儀(美國BioTek公司)；NovoCyte 1040型流式細胞儀[艾森生物(杭州)有限公司]；UV-2450紫外光度儀(日本Shimadzu公司)。

1.3 藥品與試劑

青霉素/鏈霉素溶液(批號：KGY002)、0.25%胰蛋白酶-EDTA細胞消化液(Trypsin-EDTA)(批號：KGY001)、磷酸鹽緩沖液(PBS)(批號：KGB500)、Braford蛋白含量檢測試劑盒(批號：KGA801)和全蛋白抽提試劑盒(批號：KGP250)均購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；胎牛血清(FBS)(美國ExCell Biology公司，批號：FSS500)；DMEM培養基(美國Gibco公司，批號：12800-082)；(上海ExCell公司)；1640培養基(美國Hyclone公司)；大黃素(美國Sigma公司)；雷替曲塞(南京正大天晴制藥有限公司，國藥準字：H20090325；規格：2 mg/支；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國Rapid Bio公司)。

1.4 實驗分組

本研究共分為4組，對照組[給予0.1%二甲基亞砜(DMSO)]、雷替曲塞組(給予雷替曲塞)、大黃素組(給予大黃素)和聯合用藥組(給予大黃素+雷替曲塞)。

1.5 四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測細胞活力

將PANC-1細胞鋪于96孔板內，每孔加入50 μL細胞懸液(約1×104個細胞)，另加入1640培養液50 μL。待細胞充分貼壁后進行實驗，按照不同組別分別給予雷替曲塞、大黃素以及兩藥聯合處理，干預72 h后實驗終止。96孔板每孔加入MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h，吸出上清液，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩混勻后，使用酶標儀測量波長為490 nm處的吸光度(OD)值，計算細胞增殖率。細胞增殖率=用藥組平均OD值/對照組平均OD值×100%。

1.6 ELISA法測定白細胞介素(IL)6、IL-1β及腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平

分別收集對照組、雷替曲塞組、大黃素組和聯合用藥組細胞上清液，按照ELISA試劑盒的說明書進行檢測。取出IL-6、IL-1β和TNF-α抗體包被板，將不同濃度的標準品及實驗樣本加入反應孔中，并用封板膠紙封閉，37 ℃孵育90 min；舍棄反應孔中液體，每孔加入洗滌液350 μL，反復洗板共5次；除空白孔之外，其余反應孔中加入生物素化抗體工作液100 μL/孔，用封板膠紙封閉，37 ℃孵育60 min并反復洗板；除空白孔外，各反應孔中加入酶結合物工作液100 μL/孔，用封板膠紙封閉，37 ℃孵育30 min后反復洗板；加入顯色劑，37 ℃避光孵育15 min。加入終止液100 μL/孔，混勻后測量波長為450 nm處的OD值。

1.7 Annexin-V FITC/PI雙染法檢測PANC-1細胞凋亡情況

(1)將PANC-1細胞消化后，接種至六孔板，待PANC-1細胞貼壁后，根據不同組別加入相應的含藥培養基，同時設立陰性對照組；(2)待各組藥物作用48 h后用0.25%胰酶消化，收集細胞；(3)用PBS洗滌PANC-1細胞2次，收集5×105細胞；(4)每孔加入Binding Buffer懸浮細胞500 μL，并加入Annexin V-FITC 5 μL及Propidium Iodide 5 μL混勻；(5)避光反應10 min；用流式細胞儀進行檢測細胞凋亡情況(參數：Ex=488 nm；Em=530 nm)。

1.8 蛋白質印跡法檢測胰腺癌細胞內ACE2、Ang Ⅱ 表達水平

PANC-1細胞按照不同干預組，加入相應藥物處理后提取細胞總蛋白，并測定蛋白濃度，每個樣品上樣30 g，進行蛋白電泳，電轉移到PVDF膜，牛奶封閉后順序加入ACE2、AngⅡ、GAPDH一抗(1∶1 000)及二抗(1∶5 000)，到達反應時間后，使用ECL試劑盒檢測雜交信號，并計算ACE2、AngⅡ蛋白含量。

1.9 免疫熒光法測定ACE2、AngⅡ蛋白表達情況

將不同干預組的PANC-1細胞進行免疫熒光細胞化學染色，觀察各組ACE2、AngⅡ蛋白表達情況。具體流程：(1)PBS反復洗滌3次，每次5 min；(2)棄去PBS，加入4%多聚甲醛，在37 ℃條件下固定40 min；(3)37 ℃條件下PBS再次洗滌3次，每次5 min；(4)使用0.1% Triton X-100在細胞膜打孔，室溫(25 ℃)下反應20 min；(5)加入3% H2O2浸泡，抑制內源性過氧化物酶，室溫下反應20 min；(6)37 ℃條件下PBS反復洗滌3次，每次5 min；(7)加入正常血清封閉液，每孔50 μL，37 ℃，反應30 min；(8)去除血清封閉液，直接加入相對應的ACE2、AngⅡ一抗；(9)滴加1%BSA按1∶500稀釋的濃縮型FITC和Cye標記二抗，每孔50 μL，37 ℃避光孵育40 min；(10)37 ℃，PBS反復洗滌3次，每次5 min；(11)滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，稀釋濃度1∶100)，37 ℃避光孵育5 min；(12)沖洗，室溫下PBS洗滌4次，每次2 min；用激光共聚焦顯微鏡觀察并攝取熒光圖像。

1.10 統計學方法

2 結果

2.1 大黃素、雷替曲塞以及聯合用藥對PANC-1細胞增殖能力的影響

應用不同濃度大黃素(200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25、0.390 625和0.195 312 5 μmol/L)對PANC-1細胞進行刺激，MTT方法檢測結果顯示，單用大黃素刺激胰腺癌細胞，隨著大黃素濃度的降低，胰腺癌細胞的抑制率逐漸降低，抑制率由54.53%逐漸降至3.31%，提示大黃素對胰腺癌細胞增殖能力的抑制作用呈劑量依賴性，見表1。應用不同濃度雷替曲塞(40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25、0.078 125、0.039 062 5 μg/mL)，MTT方法檢測結果顯示，單用雷替曲塞刺激胰腺癌細胞，其對胰腺癌細胞增殖能力的抑制作用亦呈劑量依賴性，隨著雷替曲塞濃度的降低，胰腺癌細胞的抑制率由54%逐漸降至8.29%，見表2。根據IC50，后續選擇大黃素100 μmol/L、雷替曲塞40 μg/mL進行實驗。PANC-1細胞加藥處理24、48及72 h，大黃素組的PANC-1細胞抑制率分別為11.72%、21.26%及46.73%，雷替曲塞組的抑制率分別為8.40%、19.59%及42.39%，聯合用藥組的抑制率分別為22.85%、47.75%及68.71%，聯合用藥組的抑制率高于大黃素組和雷替曲塞組。

表1 不同濃度大黃素對PANC-1細胞的增殖抑制作用Tab 1 Inhibitory effect of different concentration of emodin on the proliferation of PANC-1

表2 不同濃度雷替曲塞對PANC-1細胞的增殖抑制作用Tab 2 Inhibitory effect of different concentration of Raltetrexed on the proliferation of PANC-1

2.2 大黃素、雷替曲塞以及聯合用藥對PANC-1細胞上清液中IL-6、IL-1β、IL-10和TNF-α水平的影響

使用不同藥物處理72 h時取細胞上清液，分別測定IL-6水平，結果發現，各用藥組PANC-1細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.001)；雷替曲塞組PANC-1細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著低于大黃素組，聯合用藥組上述指標水平顯著低于大黃素組和雷替曲塞組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 四組PANC-1細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平比較Tab 3 Comparison of IL-6, IL-1β and TNF-α levels in the supernate of PANC-1 cells among four

2.3 Annexin-V FITC/PI雙染法檢測大黃素、雷替曲塞以及聯合用藥對PANC-1細胞凋亡的影響

用藥物干預PANC-1細胞72 h后，各用藥組PANC-1細胞凋亡率均顯著高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)；聯合用藥組PANC-1細胞凋亡率顯著高于大黃素組和雷替曲塞組，差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖1、表4。

表4 四組PANC-1細胞凋亡率比較Tab 4 Comparison of apoptosis rate of PANC-1 cells

2.4 蛋白質印跡法檢測大黃素、雷替曲塞以及聯合用藥對PANC-1細胞ACE2、AngⅡ表達的影響

用藥物干預PANC-1細胞72 h后，提取細胞蛋白，測定ACE2、AngⅡ蛋白水平。結果顯示，大黃素組、雷替曲塞組ACE2表達高于對照組，而聯合用藥組表達最高；大黃素組、雷替曲塞組ACEⅡ的表達低于對照組，而聯合用藥組表達最低，見圖2、表5。

表5 四組PANC-1細胞ACE2、AngⅡ蛋白水平比較Tab 5 Comparison of ACE2 and AngⅡ protein levels in PANC-1 cells among four groups

A.對照組；B.大黃素組；C.雷替曲塞組；D.聯合用藥組A.control group; B.emodin group; C.raltitrexed group; D.combination group圖1 四組PANC-1細胞凋亡情況Fig 1 Apoptosis of PANC-1 cells in four groups

圖2 四組PANC-1細胞ACE2、AngⅡ蛋白表達情況Fig 2 Expression of ACE2 and AngⅡ protein in PANC-1 cells of four groups

2.5 免疫熒光法檢測大黃素、雷替曲塞以及聯合用藥對PANC-1細胞ACE2、AngⅡ表達的影響

從激光共聚焦顯微鏡的觀察結果可見，ACE2蛋白陽性表達呈綠色熒光，細胞核呈藍色熒光；ACE2表達部位在胰腺癌細胞的胞漿中，胰腺癌細胞的細胞核中無ACE2表達；大黃素及雷替曲塞單藥組PANC-1細胞ACE2表達高于對照組，聯合用藥組PANC-1細胞ACE2表達較對照組明顯升高，見圖3。AngⅡ蛋白陽性表達呈綠色熒光，細胞核呈藍色熒光；AngⅡ表達部位在胰腺癌細胞的胞漿和細胞核中；大黃素組、雷替曲塞組PANC-1細胞AngⅡ表達低于對照組，聯合用藥組PANC-1細胞AngⅡ表達較對照組明顯降低，見圖4。

A. 對照組；B.大黃素組；C.雷替曲塞組；D.聯合用藥組A. control group; B. emodin group; C. raltitrexed group; D. combination group圖3 四組PANC-1細胞ACE2蛋白表達情況Fig 3 Expression of ACE2 protein in PANC-1 cells of four groups

A. 對照組；B.大黃素組；C.雷替曲塞組；D.聯合用藥組A. control group; B. emodin group; C. raltitrexed group; D. combination group圖4 四組PANC-1細胞AngⅡ蛋白表達情況Fig 4 Expression of AngⅡ protein in PANC-1 cells of four groups

3 討論

胰腺癌是惡性度較高的腫瘤，具有病程短、進展快速和死亡率高的特點。胰腺癌的治療方案仍值得進一步探索，亟需更為有效的藥物延長患者生存期，提高患者生活質量[3]。

雷替曲塞為喹唑啉葉酸鹽類似物，最初由英國Zeneca公司與Royal Mardsen醫院合作開發，屬于抗代謝類抗腫瘤藥。雷替曲塞經還原葉酸載體攝入細胞被葉酰聚谷氨酸合成酶轉化為聚谷氨酸鹽形式貯存細胞中，發揮更強胸苷酸合酶抑制作用。雷替曲塞聚谷氨酸鹽通過增強TS抑制能力、延長抑制時間而提高其抗腫瘤活性。由于其多聚谷氨酸鹽代謝物的半衰期相對比較長，約為198 h，而常用的化療藥5-氟尿嘧啶(5-FU)的半衰期僅為20 min，因此，雷替曲塞能夠維持較長時間發揮抗腫瘤作用。雷替曲塞與5-FU的作用靶酶雖然相同，但由于兩者作用部位不同，代謝途徑有差異，不易產生交叉耐藥性，故雷替曲塞可作為胰腺癌5-FU耐藥后的優化選擇[4]。研究結果發現，大黃素可抑制腫瘤細胞的增殖，其機制包括抗胰腺纖維化[5]，抑制Stat3信號通路，增強表皮生長因子受體抑制劑對胰腺癌細胞的抑制作用[6]，激活凋亡和自噬途徑[7]，抑制上皮間質轉化[8]，下調缺氧誘導因子1α[9]，增強5-Aza-CdR對胰腺癌細胞腫瘤抑制基因P16的去甲基化作用等[10]。

本研究系統觀察了大黃素、雷替曲塞單藥及兩者聯合應用對胰腺癌PANC-1細胞的抑制作用。各用藥組PANC-1細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。IL-6為核因子κB信號通路的下游炎癥介質，能通過激活STAT3傳遞信號，阻斷炎癥過程中出現的細胞凋亡，促進微小體形成，促進胰腺癌細胞持續增殖和遠處轉移[11-12]。一項Meta分析研究結果指出，循環中IL-6水平有可能是一個獨立的預后生物標志物，高IL-6水平與短總生存期相關[13]。下調IL-6的表達水平，可有助于實現抑制腫瘤的作用。IL-1由腫瘤細胞表達和分泌，可通過小G蛋白Ras誘導轉錄因子的激活，可誘導激活蛋白1的激活。高IL-6水平和高IL-1水平的患者表現出整體和無進展生存期縮短，腫瘤控制率降低[13]。本研究結果顯示，大黃素和雷替曲塞單藥均可有效降低PANC-1細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平，上述2藥聯合應用可使其進一步降低，對腫瘤的抑制作用顯著增加。

近年來，臨床腫瘤學的一個主要目標是促進細胞凋亡，有效殺滅腫瘤細胞。這一程序性細胞死亡過程由多種因素介導，凋亡通路與其他信號機制的相互作用也會影響細胞死亡[14]。本研究結果發現，聯合用藥組的PANC-1細胞凋亡率顯著高于大黃素組及雷替曲塞組，提示上述兩藥聯合應用可以產生協同作用，通過促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖。

既往研究結果證實，ACE2在胰腺中的表達具有保護胰腺作用[15-16]；可抑制胰腺癌細胞增殖、血管生成和轉移[17-18]。ACE2高表達的腫瘤患者生存期相對更長，而ACE2低表達可作為預后差的指標之一[16]。下調ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸會促進腫瘤細胞的增殖及轉移[19]。本研究在蛋白水平觀察PANC-1細胞ACE2、AngⅡ表達的變化，結果證實，各用藥組PANC-1細胞ACE2蛋白水平升高，且聯合用藥組最高；各用藥組PANC-1細胞AngⅡ蛋白水平降低，且聯合用藥組最低，與既往研究結果一致。

中醫學中雖無“胰腺癌”的病名，但就其臨床表現，該病屬于中醫學“積聚”“結胸”和“黃疸”等范疇。中醫古籍對其病因病機亦有不少論述，如《證治匯補》中記載，“積之始生，因起居不時，憂慮過度，飲食失節，脾胃虧損，邪正相搏，結于腹中”?！氨孀C論治”是中醫治療學的基本原則。胰腺癌晚期，熱毒血瘀證型較為常見。利用中醫辨證論治的觀點，針對熱毒血瘀證的胰腺癌患者，特別是對于便秘為主的患者，加強大黃通腑，有利于胃腸功能的恢復，提高療效。

綜上所述，本研究通過細胞實驗證實了大黃素、雷替曲塞能夠下調IL-6、IL-1β及TNF-α水平，促進胰腺癌細胞凋亡，實現對胰腺癌PANC-1細胞增殖的抑制作用；兩者聯合應用可起到協同效應，抑制腫瘤細胞增殖的作用更為明顯，其機制可能與上調ACE2蛋白表達、下調AngⅡ蛋白表達有關，可為中西醫結合治療胰腺癌提供理論依據。