不同發酵醅層的濃香型原酒風味成分對比分析

馬世源，周 健，明紅梅，何朝玖，任 清，熊堂語，馬 浩，胥 佳

（1.四川輕化工大學生物工程學院，四川自貢 643002；2.宜賓南溪酒業有限公司，四川宜賓 644100；3.北京工商大學輕工科學技術學院，北京 100048）

濃香型白酒是我國白酒中的典型代表之一，具有窖香濃郁、綿柔甘洌、入口綿甜、香味協調及尾凈余長等風格特點。與其他香型白酒釀造相比，濃香型白酒釀造具有“泥窖固態發酵，采用續糟配料，混蒸混燒”等特點。由于泥窖是一個相對獨立的生態系統，窖內不同空間環境的微生態不同。微生物的生長代謝與環境因素聯系緊密，使得窖池中不同酒醅層的發酵效果不同，最終導致不同酒醅層所產原酒存在差異。

目前，釀酒行業普遍認為下層酒醅原酒的酒質優于上層酒醅原酒，但表征其差異性的典型物質及不同醅層原酒風味組的形成機制，依舊是釀酒行業亟待解決的問題。段明松等研究發現上、中、下三層酒醅原酒風味物質總含量依次增高，同時認為乙酯類物質是原酒中的主要呈香物質。王松等利用液液微萃取法（Liquid-liquid microextraction，LLME）結合GC-MS 技術對不同醅層原酒的揮發性物質進行了分析，結果表明，3-甲硫基丙醇、亞油酸乙酯、亞麻酸乙酯、糠醇、4-乙基愈創木酚等是最上層酒醅原酒與其余原酒差異性較大的物質。為探究上下醅層原酒產生差異的原因，伊倩倩等將酒醅相關指標與原酒主要風味物質進行了Spearman相關性分析，認為氧氣含量是引起不同醅層原酒風味差異的主要原因。唐潔等在清香型小曲酒新工藝研發中探索微生物及環境因子對酒體風味變化的影響，發現環境和微生物因素共同解釋了酒醅風味物質的變化，其中水分、酵母總數、還原糖和淀粉是影響酒醅中風味物質的重要因素。這些微環境因子對于微生物及其代謝物的影響，目前尚無定論，還有待進一步研究。但解決問題的關鍵，首先是著手不同醅層原酒典型風味物質及其差異性分析，為后續深入研究提供理論依據。

本研究采用GC-MS/MS 技術對不同醅層的原酒進行香氣成分分析，利用偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLSDA）模型中變量投影重要度（variable importance for the projection,VIP）來篩選對不同醅層原酒具有差異貢獻的風味物質，結合香氣活度值（odor activity value，OAV）探究引起不同醅層原酒差異的主要風味物質，為揭示濃香型白酒窖內發酵機制及其原酒品質控制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：按照“掐頭去尾”摘酒工藝從上、下兩層酒醅餾酒中摘取的二段、三段濃香型原酒，來自于四川某酒企隨機選取五口發酵效果良好的窖池。采取平行取樣法進行取樣，將相同發酵醅層且相同段次的原酒編為一組，其中上層酒醅原酒編號為U-2 組、U-3 組，下層酒醅原酒編號為D-2 組、D-3組。

試劑：2-辛醇（色譜級），上海安譜有限公司。

儀器設備：8890 氣相色譜儀-7000D 三重四極桿質譜檢測器（GC/TQ）、Agilent MassHunter 數據采集工作軟件，美國Agilent科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本處理

取980 μL 酒樣過0.22 μm 微孔膜，向其中添加20 μL 內標物溶液（2-辛醇，終質量濃度30 mg/L），混合均勻后即可進樣。

1.2.2 GC-MS/MS檢測

氣相色譜條件：Agilent DB-WAX 毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 Micron）；升溫程序：35 ℃保持7 min，以7 ℃/min 升至100 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 升至220 ℃，保持10 min；采用恒流模式，載氣（He）流速1.0 mL/min，分流比10∶1，進樣量：1 μL，進樣口溫度220 ℃。

質譜條件：電子轟擊（EI）電離源：電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃。質量掃描范圍m/z 29～500；溶劑延遲：5 min。

1.2.3 風味物質定性與定量方法

采用NIST12 譜庫檢索定性，首先將譜圖進行本底扣除，然后根據有機質譜裂分規律進行譜庫檢索。原酒中的風味物質定量采用內標法進行半定量，即各成分的峰面積與內標物峰面積之比。

1.2.4 香氣活度值計算

香氣活度值（OAV）是指某化合物的質量濃度與該物質的嗅覺閾值的比值，可用來表示酒體中香氣物質對主體香氣成分的貢獻，當OAV 大于1時，表明該香氣成分對樣本香氣有直接貢獻，當OAV 大于100 時，判斷該成分為樣品的特征香氣成分。

1.2.5 數據處理與分析

采用Excel 2021 對數據進行處理，利用TBtools、Origin 繪制相關圖形，應用SIMCA 14.1 軟件完成樣本的PLS-DA分析。

2 結果與分析

2.1 不同發酵醅層原酒風味組結構特征

通過直接進樣結合GC-MS/MS 技術在所有樣本中共鑒定出54 種風味物質，其中酯類29 種、醇類12 種、酸類4 種、其他類9 種?；诎攵拷Y果將檢出的各類風味物質的含量百分比作堆積柱狀圖，如圖1所示。

圖1 不同醅層原酒風味物質構成圖

由圖1 可以看出，不同醅層原酒均以酯類、醇類、酸類3 種風味物質為主，三類物質總含量占比均在91 %以上，不同醅層原酒在風味組的構成上較相似。各風味組中酯類物質占比最高，均達到67 %以上，且在不同醅層原酒中占比不相同。其中，酯類物質在下層酒醅二段酒、三段酒的占比分別為73.81%、70.73%，在上層酒醅二段酒、三段酒的占比分別為70.55 %、67.75 %，下層酒醅原酒中酯類物質總占比高于上層酒醅原酒。窖泥中的一些產主體香功能厭氧菌逐步向窖池內遠端糟醅遷移，在近端糟醅可能會形成功能菌群的優勢區，促進了底層、下層等窖池部位糟醅中酯類物質生成。相同段次上層原酒中醇類物質和酸類物質占比均高于下層原酒中的占比，且下層二段酒的醇類物質和酸類物質占比最低，分別為15.75 %、1.79%；上層三段酒的醇類物質和酸類物質占比最高，分別為19.14%、6.06%。

2.2 不同發酵醅層原酒風味組成分分析

不同醅層原酒中檢出的風味物質種類存在差異，其中，上層酒醅二段、三段原酒中均檢測出51種風味物質，且有2 種是上層酒醅原酒中特有的成分；下層酒醅二段、三段原酒中均檢測出52 種風味物質，且有1種是下層酒醅原酒中特有的成分。

將不同醅層原酒中風味物質的含量作熱圖，如圖2 所示。熱圖能直觀的反映酒樣中風味物質含量的差異，圖中顏色越接近紅色說明相對含量越高，顏色越接近藍色說明相對含量越低。

圖2 不同醅層原酒風味物質含量熱圖

雖然不同醅層原酒在風味組的構成上較相似，但在風味物質的種類及總含量上存在差異，其中，上層酒醅二段、三段原酒中共檢測出51 種風味物質，且有2 種風味物質僅在上層酒醅原酒中檢出；下層酒醅二段、三段原酒中共檢測出52 種風味物質，且有1 種風味物質僅在下層酒醅原酒中檢出；上層酒醅二段、三段原酒的風味物質總含量分別為3.55 g/L、3.06 g/L，下層酒醅二段、三段原酒的風味物質總含量分別為5.06 g/L、3.47 g/L。在同段次原酒中下層酒醅原酒的風味物質總含量明顯高于上層酒醅原酒，這可能與發酵過程中黃水下滲，黃水中富集一部分風味物質，以及下醅層微環境差異、微生物群落更為復雜的物質代謝等有關。

酯類物質是濃香型白酒中最主要的微量香氣成分，其主要代謝途徑為：在?；o酶A和醇乙酰轉移酶的共同作用下進行生物合成，或者酸、醇類物質在酯化酶和脂肪酶的催化作用下反應合成。在不同醅層原酒檢測到的29 種酯類物質中，己酸乙酯、乙酸乙酯是不同醅層原酒中含量最高的2 種酯類物質。己酸乙酯作為濃香型白酒的主體香味成分，其含量是判定濃香型白酒品質的重要指標之一。下層酒醅二段、三段原酒中己酸乙酯含量分別為2082.08 mg/L、1517.70 mg/L，上層酒醅二段、三段原酒中己酸乙酯含量分別為1342.64 mg/L、1081.52 mg/L，可以看出己酸乙酯在下層酒醅原酒中的含量高于上層酒醅原酒。乙酸乙酯主要呈現水果香和甜香，其在上層酒醅二段、三段酒中的含量分別為782.23 mg/L、568.33 mg/L，在下層酒醅二段、三段酒中的含量分別為995.06 mg/L、353.45 mg/L。庚酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯和辛酸乙酯等4 種酯類物質在不同醅層原酒中的含量差異顯著，其中庚酸乙酯、丁酸乙酯和辛酸乙酯均是下層原酒高于上層原酒，其在下層酒醅二段酒中的含量分別為211.84 mg/L、138.71 mg/L、92.19 mg/L，在上層酒醅二段酒中的含量分別為109.79 mg/L、78.21 mg/L、59.42 mg/L。乳酸乙酯則是上層酒醅原酒中的含量高于下層酒醅原酒，其在上層酒醅二段、三段酒中的含量分別為220.02 mg/L、279.10 mg/L，在下層酒醅二段、三段酒中含量分別為134.05 mg/L、162.38 mg/L。這些酯類物質帶有花香、水果香、菠蘿香等香氣特征，是組成白酒酒體風格的重要香氣成分。此外乙酸戊酯、乙酸己酯、戊酸丁酯、戊酸丙酯、己酸異戊酯、己酸戊酯、己酸甲酯、己酸己酯、己酸丁酯、己酸丙酯、庚酸丙酯、丁酸己酯、丁酸丁酯、5-甲基己酸乙酯、4-甲基戊酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯等酯類物質在下層酒醅原酒中含量均高于上層酒醅原酒。棕櫚酸乙酯是一種高級脂肪酸酯，它能增加酒體的醇厚感，降低酒種的干澀味，其在上、下兩層酒醅原酒中含量差異顯著，在上層酒醅二段、三段原酒中含量分別為6.97 mg/L、5.11 mg/L，在下層酒醅二段、三段原酒中含量分別為1.00 mg/L、0.54 mg/L。棕櫚酸乙酯主要來源于大米等釀造原料中脂肪分解的棕櫚酸和乙醇在酯酶的作用下合成，上層酒醅氧氣充足，霉菌、酵母等微生物代謝旺盛，從而促進棕櫚酸乙酯的合成，研究表明棕櫚酸乙酯在酸性條件下會被降解，下層酒醅酸度相對較高，導致上層酒醅原酒中棕櫚酸乙酯含量高于下層酒醅原酒。

醇類物質在白酒中不僅具有呈香助味的作用，帶來醇甜感、使酒體更豐滿，同時也是酯類物質形成的前體物質。各原酒中醇類物質均以正戊醇、正己醇、正丁醇、正丙醇、2-丁醇、3-甲基丁醇等6種高級醇為主，其含量之和在醇類物質中的占比均達到93%以上。正己醇和2-丁醇在不同原酒中含量存在明顯差異，正己醇具有水果香、花香等特征，在上層二段原酒中含量最高，達到141.77 mg/L，其余原酒中含量在98.29～116.17 mg/L之間。2-丁醇在下層二段原酒中含量最高，達到177.15 mg/L，其余原酒中含量在57.59～75.90 mg/L 之間，呈現麥芽香、烤堅果香。2-己醇僅在上層酒醅二、三段原酒中檢測到，其含量分別為3.91 mg/L、1.47 mg/L。分析發現正戊醇、正己醇、正丁醇、3-甲基丁二醇、2，3-丁二醇等醇類物質均是上層酒醅原酒高于下層酒醅原酒，高級醇主要與釀酒酵母的生長代謝有關，主要集中在主發酵過程中產生，由于上層酒醅氧氣更充足，酵母菌代謝旺盛，有氧呼吸產生的熱量高，發酵溫度升高促進高級醇的合成，導致上、下兩層原酒中高級醇含量存在差異。

酸類物質同醇類物質一樣，也是酯類物質形成的前體物質。主要是由發酵過程中微生物利用淀粉、蛋白質、脂肪等物質通過一系列生化反應生成。白酒中的酸類物質不僅可以助香、維持酯類物質合成平衡、改善白酒風味，同時還具有提升白酒健康成分的作用。乙酸和己酸是上、下醅層原酒中的主要酸類物質，同時也是己酸乙酯、乙酯類物質的前體物質。乙酸主要是由醋桿菌代謝產生，呈現刺鼻的醋香味，是白酒中重要的呈味物質。乙酸在上層二段、三段原酒中含量分別為55.14 mg/L、126.15 mg/L，在下層二段、三段原酒中的含量分別為45.14 mg/L、55.14 mg/L，上層酒醅三段原酒的乙酸含量和其余原酒差異顯著。己酸主要由窖泥中的梭菌屬細菌代謝產生，具有酸臭味和汗味，能對白酒起到助香作用。該物質的含量在相同段次原酒中呈現下層酒醅原酒高于上層酒醅原酒的情況，其上層二段、三段原酒中的含量分別為14.78 mg/L、23.97 mg/L，在下層二段、三段原酒中的含量分別為25.24 mg/L、32.93 mg/L。

在其他類化合物中的醛酮類化合物也是白酒中重要的呈香呈味物質，主要是由脂肪氧化和氨基酸降解形成。乙縮醛由乙醇和乙醛縮合而成，帶有清香味，是本次檢測原酒中的主要醛類物質，其含量在不同醅層原酒中差異顯著，在下層二段原酒中含量最高，為200.62 mg/L，在上層三段原酒中含量最低，為109.56 mg/L。2-庚酮僅在上層二段、三段原酒中檢測到，含量分別為1.22 mg/L、0.54 mg/L。1,2-二甲酰氧基丙烷僅在下層二段、三段原酒中檢測到，含量分別為2.72 mg/L、3.54 mg/L。

2.3 不同發酵醅層原酒風味成分的差異貢獻度分析

偏最小二乘判別分析（PLS-DA）在樣本數量低于變量數時，仍具備較高的操作性與辨識度。對不同醅層原酒進行PLS-DA 分析，結果如圖3 所示。通過變量投影重要度（VIP）來表征對白酒風味具有重要作用的風味物質，通常認為VIP 值大于1的變量在不同樣本組之間的區分起重要作用。VIP 值越大，說明該風味對區分不同醅層原酒的差異貢獻度越大，VIP值＞1的風味物質如表1所示。

表1 基于PLS-DA篩選不同醅層原酒差異風味物質

圖3 不同醅層原酒PLS-DA 散點圖

由圖3可見，4種酒樣分別位于4個不同象限并且上層酒樣均在X 軸的正半軸，下層酒樣均在X 軸的負半軸;Y軸正半軸均是二段原酒，三段原酒均在Y 軸負半軸。結果表明，PLS-DA 能有效區分不同醅層不同段次的原酒。上、下兩層原酒分區明顯，說明樣本間差異較大，可能是酒醅在窖池中所處的空間位置不同，導致不同醅層酒醅的發酵狀態不同。

通過VIP 值＞1 篩選出33 種對于不同醅層原酒差異具有重要影響的風味物質，包括酯類24 種、醇類6種、酮類1種、酚類1種、酸類1種。這些風味物質是造成不同醅層原酒差異的主要變量，其中酯類物質的VIP 值相比于醇類、酮類等物質稍高。除了丁酸乙酯（VIP=1.21453）、庚酸乙酯(VIP=1.11091)、乳酸乙酯(VIP=1.09544)、辛酸乙酯(VIP=1.08512)、己酸乙酯(VIP=1.04101)等高含量的酯類物質能表征不同醅層原酒的差異性，棕櫚酸乙酯、己酸戊酯、乙酸戊酯、己酸己酯等低含量的風味物質VIP 值也較高，說明微量化合物對于不同醅層原酒差異性的體現同樣具有重要意義。

2.4 不同醅層原酒特征風味物質分析

為進一步分析對原酒風味起重要貢獻作用的關鍵香氣化合物成分，對已定量的香氣成分進行OAV 計算分析，得到32 種OAV＞1 的風味物質，包括酯類16 種、醇類9 種、酸類4 種、醛類1 種、酚類1種、呋喃類1種，結果如表2所示。

由表2 可知，有5 種風味成分OAV＞100，分別是己酸乙酯、辛酸乙酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯；有13 種風味成分OAV 在10～100 之間，分別是乙酸乙酯、庚酸乙酯、苯乙酸乙酯、己酸己酯、己酸丁酯、正戊醇、正己醇、正丁醇、2-丁醇、2，3-丁二醇、己酸、乙縮醛、4-甲基苯酚，以上18 種化合物可認為是對不同醅層原酒香氣特征具有重要貢獻的風味物質。

表2 不同醅層原酒中OAV＞1的風味物質

分析發現己酸乙酯的OAV 值在各原酒中均最高，符合濃香型白酒的主體香氣特征。同時，己酸乙酯（甜香、窖香）、辛酸乙酯（荔枝香）、戊酸乙酯（水果香）、丁酸乙酯（水果香）、3-甲基丁酸乙酯（水果香）均是不同醅層原酒中OAV＞100 的風味物質，并且其OAV 值明顯高于其余風味物質，初步認為這5 種酯類物質是不同醅層原酒的共有特征香氣成分，說明不同醅層原酒的酒體風格具有一定的相似性。戊酸乙酯在上層酒醅二段原酒中的OAV值高于辛酸乙酯，其他原酒均是辛酸乙酯的OAV值高于戊酸乙酯，說明戊酸乙酯對上層二段原酒的酒體香氣特征的貢獻度更大。乙酸乙酯、乳酸乙酯、庚酸乙酯、正己醇、正丙醇、3-甲基丁醇、2-丁醇、乙酸等是在不同醅層原酒中含量相對較高的物質，由于其閾值大，香氣活度值均較??；3-甲基丁酸乙酯等含量低，閾值大的風味物質，香氣活度值卻很高。己酸丁酯在下層二、三段原酒中的OAV 值分別為49.68、41.33，在上層酒醅二、三段原酒中的OAV 值分別為18.59、13.60；苯乙酸乙酯在上層酒醅二、三段原酒中OAV 值分別為23.58、33.91，在下層酒醅二、三段原酒中OAV 值分別為5.94、8.33；乙縮醛在上層酒醅二段、三段原酒中的OAV 值分別為81.78、52.42，在下層酒醅二、三段原酒中的OAV值分別為95.99、66.31，說明上、下兩層酒醅原酒中同種風味物質對酒體香氣特征的貢獻度存在一定差異。將OAV 值＞10 和VIP 值＞1 的風味物質結合分析，發現不同醅層酒醅原酒的關鍵特征物質存在一定差異，其中庚酸乙酯、己酸己酯、己酸為下層酒醅原酒的關鍵特征風味物質，苯乙酸乙酯為上層酒醅原酒的關鍵特征風味物質；此外，己酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、己酸丁酯為不同醅層原酒共有的關鍵特征風味物質。

3 結論

本研究以不同醅層濃香型原酒為研究對象，應用GC-MS/MS 技術對其進行檢測分析，共鑒定出54 種風味物質，其中酯類29 種、醇類12 種，酸類4種、其他類9 種。研究發現酯類物質在不同醅層原酒中占比均最大且存在一定差異，在上層酒醅二段酒、三段酒的占比分別為73.81%、70.73%，在下層酒醅二段酒、三段酒的占比分別為70.55 %、67.75%。不同醅層原酒的風味物質的總含量存在差異，上層酒醅二段、三段原酒的風味物質總含量分別為3.55 g/L、3.06 g/L，下層酒醅二段、三段原酒的風味物質總含量分別為5.06 g/L、3.47 g/L。不同醅層風味物質含量差異的主要原因是：黃水富集了一部分風味物質，且酒醅下層厭氧功能菌代謝更為活躍，從而促進了下層酒醅風味成分的積累。

利用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）提取了對不同醅層原酒具有差異貢獻的特征風味物質，通過VIP 值共篩選出33 種對不同醅層原酒具有差異貢獻的風味物質，發現酯類物質是對不同醅層原酒的差異貢獻最大的風味物質?；谙銡饣疃戎担∣AV）篩選出32 種OAV＞1 的對白酒風味具有貢獻的物質，其中有5 種風味成分OAV＞100，有13種風味成分OAV 在10～100 之間。將OAV 值＞10和VIP 值＞1 的風味物質結合分析，發現庚酸乙酯、己酸己酯、己酸為下層酒醅原酒的關鍵特征風味物質，苯乙酸乙酯為上層酒醅原酒的關鍵特征風味物質，己酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、己酸丁酯為不同醅層原酒共有的關鍵特征風味物質。此外，2-己醇、2-庚酮、1，2-二甲酰氧基丙烷等不同醅層原酒中特有的風味成分是否會對原酒的風味造成影響還需進一步驗證。

濃香型白酒的風味受到原料特性、釀造方式、環境微生物、氣候環境等多種因素影響。本次研究也存在一定不足：由于樣本數量相對較少，不能完全反映樣本間的差異性；由于檢測條件有限，對于樣本中的微量成分解析還有待深入研究；對于不同發酵醅層原酒風味成分差異的原因及其與微環境、微生物的關系還有待進一步探究。