苦橙花精油化學成分分析及其體外活性

董 雪,劉 霞,肖瑞欣,呂鵬飛,公衍玲*

(1.青島科技大學 化工學院,山東 青島 266042;2.濰坊護理職業學院,山東 濰坊 262500)

苦橙(Citrus AurantiumL.)是蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citr us)常綠小喬木植物,也被稱為酸橙,原產自阿爾及利亞、摩洛哥、突尼斯、西班牙等許多國家[1]。在我國,長江流域以南的湖南、浙江、江蘇、貴州、江西等地均有種植苦橙[2]?？喑鹊娜~、花、果實等均有不同的用途,被加工后在各個領域得到廣泛的應用[3]?？喑然ň褪峭ㄟ^蒸餾法從花瓣中提取的,主要成分為檸檬烯、芳樟醇等[4]。外觀呈接近透明的淺黃色,香氣濃郁、明快,帶有自然甜鮮的花香、清新的柑橘果香和淡淡的苦味、藥味的百合花香味,價格較高。柑橘屬類植物被認為具有抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性及預防癌癥的作用[5-8]?？喑然ň涂梢跃徑鈵盒?、消化不良、便秘等癥狀,還具有鎮靜和抑制食欲等作用[8-9]?？喑然ň驮诜枷阈袠I應用較廣泛,但關于其藥理活性的基礎研究較少。

因此,本研究擬分析苦橙花精油的化學成分并測定其體外活性,以期為苦橙花資源的開發利用提供參考。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

苦橙花精油,青島青竺生物科技有限公司。產地摩洛哥,用無菌花生油溶解,分別制成0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·mL－15個不同濃度的苦橙花精油溶液;透明質酸酶、酪氨酸酶,合肥博美生物公司;撲爾敏,湖北邁恩生物科技有限公司;熊果苷,成都曼思特生物科技有限公司;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙雷氏菌、無乳鏈球菌和枯草芽胞桿菌,青島市即墨區人民醫院;ELISA試劑盒,南京建成生物工程研究所;RA W 264.7巨噬細胞,上海富衡生物科技有限公司;脂多糖(LPS),碧云天生物技術有限公司;其他試劑均為市售分析純。

細胞培養箱,上海齊欣科學儀器有限公司;酶標檢測儀,TECANInfinite 200型,濟南友澤仁信貿易有限公司;超凈臺,VS-1300L-U型,蘇潔醫療器械(蘇州)有限公司;紫外分光光度計,UV-1801型,北京北分瑞利分析儀器有限責任公司;立式壓力蒸汽滅菌器,YXQ-LS-SII型,上海博訊實驗有限公司醫療設備廠;全溫振蕩器,HZQ-Q型,金壇精達儀器制造廠;氣質聯用儀,7890B/7000C型,美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 GC-MS分析苦橙花精油的化學成分

色譜條件:色譜柱是HP-5,載氣為高純氦氣,進樣口溫度為280℃,色譜柱初始溫度為50℃(程度升溫)保持2 min,以每分鐘10℃持續升至280℃,保持10 min,柱壓為10 psi,分流進樣,分流比為20∶1,進樣量為1μL。

質譜條件:離子源為電子轟擊離子源,電子能量為70 e V,接口溫度為250℃,質量掃描范圍為50～600,掃描間歇為1.0 s。所得圖譜采用儀器自帶的NIST14質譜數據系統自動檢索,同時結合智能化工搜索引擎,進行精油組分定性,各組分含量由色譜峰面積用歸一化法計算得到。

1.2.2 苦橙花精油的透明質酸酶抑制率測定

采用改良版的Morgan-Elson方法[10]檢測苦橙花精油對透明質酸酶的抑制率。配制5 mg·mL－1的透明質酸原液,4℃保存。將50μL透明質酸原液和100μL緩沖液添加到250μL水中。將含有0.2 mol·L－1甲酸鈉、0.1 mol·L－1NaCl和0.2 mg·mL－1牛血清白蛋白(BSA)的緩沖液用甲酸調節至合適的p H(2.0～5.0)。將混合物在37℃下孵育10 min,然后加入50μL透明質酸酶和100μL不同濃度的苦橙花精油進行反應。加入110μL的堿性硼酸鹽溶液,在沸水浴中加熱4.5 min,終止酶促反應。將17.3 g H3BO3和7.8 g KOH溶解在100 mL水中制成硼酸鹽溶液。向10 mL的堿性溶液中加入1 mL濃度為0.8 g·mL－1的K2CO3溶液。然后將試管置于冰水中20 min,之后加入1.5 mL的對二甲基氨基苯甲醛溶液(將20 g對二甲氨基苯甲醛溶于25 mL濃鹽酸和75 mL冰醋酸的混合物中,制備該試劑,用前以400 mL冰醋酸稀釋)。為了使反應混合物顯色最大化,將試管在37℃下孵育20 min。用離心機在4℃、6 000 r·min－1下處理10 min后,取上清液測吸光度。撲爾敏為本次實驗的陽性對照藥物。實驗重復進行3次,計算平均值。透明質酸酶抑制率y(%)計算見式(1)。

上式中:A是對照組溶液的吸光度(將苦橙花精油替換為醋酸緩沖液);B為對照組的空白溶液的吸光度(將透明質酸酶溶液/苦橙花精油替換為醋酸緩沖液);C為苦橙花精油組的吸光度;D為苦橙花精油空白溶液的吸光度(將透明質酸酶溶液替換為醋酸緩沖液)。

1.2.3 苦橙花精油的酪氨酸酶抑制率測定

根據文獻中的方法測定酪氨酸酶活性[11-12]。將50μL的苦橙花精油在25℃下孵育10 min后,然后在96孔板中加入50μL濃度為135 U·mL－1的酪氨酸酶和50μL、0.03%的L-多巴溶液。在室溫(25℃)下將上述混合物孵育5 min。在475 n m處,用酶標儀測定每個孔的吸光度。每次試驗重復3次,取平均值。酪氨酸酶抑制率y(%)計算見式(2)。

其中,A是具有酶,但不具有苦橙花精油的吸光度;B是不具有苦橙花精油或酶的吸光度;C是具有酶和苦橙花精油的吸光度;D是具有苦橙花精油,但不具有酶的吸光度。

1.2.4 苦橙花精油的體外抑菌活性測定

苦橙花精油的體外抑菌活性是采用抑菌圈方法測定的。將培養好的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、沙雷氏菌和枯草芽胞桿菌菌懸液倒入盛有固體培養基的錐形瓶中,充分震蕩混勻,迅速倒入無菌培養皿中,放冷,待培養基凝固后打孔,分別加入不同濃度的苦橙花精油和溶劑各20μL,然后放置在37℃的培養箱中,培養24 h后觀察并記錄所有抑菌圈的大小。每組實驗平行3次,計算平均值。

1.2.5 苦橙花精油的體外抗炎活性測定

1.2.5.1 細胞培養

RA W264.7細胞采用含有10%熱滅活胎牛血清的DMEM培養基,同時添加1%的青鏈霉素,培養于37℃、5%CO2,飽和濕度的培養箱中。

1.2.5.2 MTT法檢測苦橙花精油的細胞毒性

細胞分為6組,分別為空白組、苦橙花精油(0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·mL－1)組,每組設置3個復孔。取96孔板,向每個孔中加入100μL細胞懸液(1×105個·mL－1),然后分別吸取100 μL的DMEM完全培養基加到每個孔中,將孔板平放于于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養24 h。每孔加入0.5 mg·mL－1的MTT溶液100μL,繼續培養4 h。分別在每孔中加入150μL DMSO,使結晶物充分溶解,在490 n m處,用酶標儀檢測并記錄吸光度A,根據吸光度A來判斷不同濃度的苦橙花精油對細胞活性的影響。細胞存活率x(%)計算公式見式(3)。

式中:A0為空白組的吸光度;A1為實驗組的吸光度;A2為對照組的吸光度。

1.2.5.3 ELISA試劑盒檢測炎癥因子IL-β、IL-6、TNF-α的表達

將RA W264.7細胞(1×105個·mL－1)接種于96孔培養板中培養24 h。分為7個組,即空白組(加DMEM培養基)、炎癥模型組和5個給藥組。模型組和給藥組均用LPS(1μg·mL－1)誘導細胞炎癥。給藥組分別加濃度為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·mL－1的苦橙花精油,空白組和模型組分別給與等體積的DMEM培養基,繼續培養24 h。經消化、離心后,取細胞上清液,嚴格按照ELISA試劑盒的說明操作,測定細胞上清液中促炎細胞因子IL-β、IL-6、TNF-α的濃度。

2 結果與討論

2.1 苦橙花精油的GC-MS分析結果

苦橙花精油的GC-MS總離子圖見圖1?？喑然ň蜋z測的主要成分分析見表1?？喑然ň椭泄矙z測出36種化合物,其主要的化合物類別為醇類、萜烯類和酯類化合物,含量分別為49.77%、22.93%和24.22%。其中芳樟醇的含量占比最高,為24.72%,因此,芳樟醇是苦橙花精油的主要成分。其次,苦橙花精油中的相對含量較高的酯類化合物(乙酸芳樟酯),為11.56%,萜烯類化合物中檜烯含量最高,為7.01%。酚類、醛類和酮類化合物相對較少,分別為1種、2種和1種?？喑然ň统煞謴碗s,推測其藥理活性較廣泛,同時也在一定程度上限制了對其的進一步開發利用。

圖1 苦橙花精油的GC-MS總離子圖Fig.1 Total ion diagram of GC-MS of essential oil fr o m Citr us aur antiu m L.flowers

表1 苦橙花精油檢測的主要成分分析Table 1 Analysis of main co mponents of essential oil fro m Citr us aur antiu m L.flowers

2.2 苦橙花精油對透明質酸酶的抑制作用

苦橙花精油與撲爾敏濃度對透明質酸酶抑制率的影響見圖2。由圖2可見,隨著濃度的變化,苦橙花精油可以不同程度地抑制透明質酸酶的活性。在0.5 mg·mL－1到2.0 mg·mL－1濃度范圍內,苦橙花精油對透明質酸酶的抑制作用呈劑量依賴性。在2.0 mg·mL－1時,苦橙花精油對透明質酸酶的抑制率達到最大值,在2.5 mg·mL－1時抑制率不再升高,趨于平緩,機理有待進一步研究。在本研究中,苦橙花精油顯示出一定的抑制透明質酸酶活性,雖然活性低于同劑量的撲爾敏,但其來源于天然植物,安全范圍大,可能是一種潛在的抗過敏藥物。

圖2 苦橙花精油與撲爾敏濃度對透明質酸酶抑制率的影響Fig.2 Hyaluronidase inhibition rate of essential oil fr o m Citr us aur antiu m L.flowers and clor phena mine maleate

2.3 苦橙花精油對酪氨酸酶的抑制作用

苦橙花精油對酪氨酸酶的抑制作用見圖3。在各種美白靶標中,酪氨酸酶是黑色素生物合成中的主要酶,它催化從L-酪氨酸到3,4-二羥基苯基-L-丙氨酸(L-DOPA)和從L-DOPA到多巴醌的氧化反應。多巴醌通過氧化聚合產生黑色素。因此,具有酪氨酸酶并顯示出氧化抑制作用的試劑將是皮膚美白治療的合適靶標[13]。本研究發現,苦橙花精油可不同程度地抑制酪氨酸酶活性,從而抑制黑色素的形成,且呈現出劑量依賴關系。同時還發現,苦橙花精油對酪氨酸酶的抑制活性略優于同等劑量的熊果苷,而熊果苷作為美白劑在化妝品中廣泛應用。因此,苦橙花精油作為新型美白成分值得進一步開發研究。

圖3 苦橙花精油和熊果苷濃度對酪氨酸酶抑制率的影響Fig.3 Tyr osinase inhibition rate of essential oil fr o m Citr us aur antiu m L.flowers and ar butin

2.4 苦橙花精油的抑菌實驗結果

苦橙花精油具有清新、獨特的香味,同時也具有多種活性,如抑菌和消炎等。本研究檢測了苦橙花精油的體外抑菌活性,結果見圖4。

圖4 不同濃度的苦橙花精油對5種細菌的抑制效果圖Fig.4 Inhibitory effects of different concentrations of essential oil fro m Citr us aur antiu m L.flo wers on five kinds of bacteria

由圖4可以看出,苦橙花精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、沙雷氏菌和枯草芽胞桿菌均表現出不同程度的抑制作用。在革蘭氏陽性菌中,苦橙花精油對金黃色葡萄球菌的抑制能力最強,對大腸桿菌的抑制作用較弱。HSOUNA等[14]也報道了類似的結果,他們報道苦橙花精油對所有檢測到的革蘭氏陽性和陰性細菌均有抗菌活性。結果表明,革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌相比,前者對苦橙花精油更為敏感。這些差異可以部分歸因于革蘭氏陰性菌的雙膜細胞膜結構比革蘭氏陽性菌的單膜結構更加復雜。革蘭氏陰性細菌外膜中親水性多糖鏈的存在已被證明有助于抵抗疏水性植物油。

2.5 苦橙花精油對細胞活性的影響

圖5實驗結果顯示,經濃度為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·mL－1的苦橙花精油處理的RA W264.7細胞與空白對照組的RA W264.7細胞相比,細胞活性沒有顯著差異,說明苦橙花精油對RA W264.7細胞不具有細胞毒性。

圖5 苦橙花精油濃度對RA W264.7細胞活性的影響Fig.5 Effect of essential oil from Citr us aurantium L.flowers on the activity of RAW264.7 cells

2.6 苦橙花精油對LPS誘導的RAW264.7細胞分泌炎性因子的影響

RA W264.7是小鼠腹腔巨噬細胞細胞系,常用于建立炎癥細胞模型。在本實驗中,使用LPS誘導RA W264.7巨噬細胞炎癥模型,通過ELISA試劑盒測定IL-β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的含量,從細胞、分子水平探討苦橙花精油的抗炎作用,旨在為苦橙花的進一步開發和利用提供依據。

苦橙花精油對LPS誘導的RA W264.7細胞分泌IL-β、IL-6、TNF-α的影響見圖6。結果顯示,與空白組相比,LPS組中IL-β、IL-6、TNF-α水平顯著升高,其差異具有統計學意義(P＜0.01),提示LPS可誘導細胞發生炎癥。與LPS組比較,5個不同濃度的苦橙花精油均能明顯地抑制由LPS誘導的RA W264.7炎癥細胞中IL-β、IL-6、TNF-α的升高,且差異具有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01),且隨著濃度的增加,其抑制作用加強,表現出劑量依賴關系。

圖6 苦橙花精油濃度對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子表達的影響Fig.6 Effect of essential oil fr o m Citr us aur antiu m L.flowers on expression of infla mmator y cytokines in LPS-induced RA W264.7 cells

3 結 論

通過GC-MS分析,從苦橙花精油中共檢識出36種化合物,其主要的化合物類別為醇類、萜烯類和酯類化合物,含量分別為49.77%、22.93%和24.22%?？喑然ň湍茱@著抑制透明質酸酶和酪氨酸酶的活性,具有一定的抗過敏活性和較好的美白效果。同時,本研究結果顯示苦橙花精油具有廣譜抗菌活性,對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、沙雷氏菌和枯草芽胞桿菌這5個菌株均具有一定的抑制作用,同時還能抑制LPS引起的炎癥因子的分子,具有抗炎活性?？喑然ň偷捏w外活性可能與其含有的萜類、醇類等物質有關。實驗結果為苦橙花精油在天然美白劑、抗過敏以及抑菌抗炎劑的應用領域提供了一定了理論依據,考慮可以將其用于日化產品、功能性食品和醫藥領域。然而,為闡明苦橙花精油潛在的有效性,還需要對其體內效價和作用機制進行進一步的研究。