孫樂明 趙君 陳芝慧 王文淵
摘要:目的建立關節克痹丸定性定量檢測方法,為其質量標準提高提供依據。方法采用薄層色譜法,對制劑中麻黃和虎杖進行定性鑒別。通過高效液相色譜法測定了有效成分大黃素的含量。結果 TLC鑒別方法專屬性好,斑點清晰且分離度好;HPLC含量測定結果顯示,大黃素在12.217μg~28.507μg/mL,線性關系良好。儀器精密度、重復性、穩定性、加樣回收率的RSD值均符合要求。結論所建立的方法操作簡單,重復性較好,可用于關節克痹丸的質量控制研究。
關鍵詞:關節克痹丸;質量標準;薄層色譜法;高效液相色譜法
【中圖分類號】 R322.7+2 【文獻標識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306(2022)13--02
關節克痹丸的標準收載于衛生部部頒標準中成藥成方制劑第二十冊,為濃縮丸劑,主要成份由川烏(制)、虎杖、麻黃等15味中藥組成。具有祛風散寒、活絡止痛的功效,用于關節炎、四肢酸痛、伸展不利[1]。方中川烏(制)、草烏(制)等為主藥,起祛風止痛之效,配以防已、獨活等除濕止痛,配以桂枝、麻黃等溫陽利水化氣,再佐以黃芩等清熱并防止諸藥過于溫燥,全方配伍適宜,具有消除關節腫痛,調節免疫平衡,恢復關節功能等作用。其臨床使用有效、安全,不良反應極少且較輕[2]。原標準為衛生部98年標準,其內容只有1項粉末鑒別和1項麻黃的TLC鑒別以及丸劑常規檢查項目,難以有效的控制藥品質量。本次藥品標準提高研究,通過對原標準符合基礎上,重新對本品的性狀、鑒別、檢查以及含量測定進行了全面研究,并根據研究結果重新制訂了關節克痹丸藥品質量標準(草案)。增加了虎杖的TLC鑒別,并通過方法學研究,建立了有效成分大黃素的含量測定方法,以進一步提高該藥的質量控制水平。
1. 材料與儀器
薄層板1:硅膠G薄層板(薄層板,規格:100×200mm,);薄層板2:自制硅膠G薄層板(固定相:硅膠G,粘合劑:0.5%的CMC-Na,涂布厚度:0.3mm,規格:100×200mm); MS304s/01電子天平;P-1型薄層色譜展開缸;5μL點樣毛細管;SLD-1薄層色譜攝影儀;Waters2690高效液相色譜儀,waters2489雙波長紫外檢測器。
關節克痹丸(20151201,20151202,20151203,貴州信邦制藥股份有限公司);鹽酸麻黃堿對照品,中國藥品生物制品檢定所,批號為0714-9903;大黃素對照品,中國食品藥品檢定研究院,批號為110756-200110。甲醇、乙腈均為色譜純,其余試劑均為分析純,水為超純水。
2.方法與結果
2.1虎杖的TCL鑒別[3]
取3批本品各10粒,研碎,加甲醇10mL,超聲處理15min,濾過,濾液蒸干,殘渣加三氯甲烷1mL使其溶解,作為供試品溶液。取大黃素對照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作為對照品溶液。吸取對照品溶液5μL,供試品溶液各10μL。分別點于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(30~60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,置于紫外燈下檢視。供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點,置于氨蒸氣中熏后,斑點變為紅色。
2.2方法學驗證
2.2.1專屬性考察
吸取對照品溶液5μL,供試品溶液各10μL。點樣于同一硅膠G薄層板上,展開,取出,晾干,置于紫外燈下檢視。供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點,置于氨蒸氣中熏后,斑點變為紅色。表明該方法的專屬性良好。
2.2.2耐用性考察
(1)更換不同品牌薄層板
吸取對照品溶液5μL,供試品溶液各10μL。點樣,更換不同品牌的薄層板(薄層板1、薄層板2),展開,取出,晾干,置于紫外燈下檢視。供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點,置氨蒸氣中熏后,斑點變為紅色,且更換不同品牌薄層板后,各薄層板之間無顯著差異,表明更換不同品牌薄層板對虎杖的薄層鑒別無影響。
(2)更換不同溫度
吸取對照品溶液5μL,供試品溶液各10μL。點樣于同一硅膠G薄層板上,展開,取出,晾干,置于紫外燈下檢視。供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點,置氨蒸氣中熏后,斑點變為紅色,且更換不同溫度后,各薄層板之間無顯著差異,表明更換不同溫度對虎杖的薄層鑒別無影響。
(3)更換不同濕度
吸取對照品溶液5μL,供試品溶液各10μL。點樣于同一硅膠G薄層板上,展開,取出,晾干,置于紫外燈下檢視。供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點,置氨蒸氣中熏后,斑點變為紅色,且更換不同濕度后,各薄層板之間無顯著差異,表明更換不同濕度對虎杖的薄層鑒別無影響。
2.3大黃素的含量測定[4-5]
2.3.1色譜條件
Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm,5μm),柱溫35℃,甲醇-0.1%磷酸水(80:20)為流動相,流速為1.0mL/min,檢測波長254nm。
2.3.2系統適用性試驗
吸取對照品溶液20μL注入高效液相色譜儀測定,理論板數按大黃素計算大于4000。
2.3.3溶劑制備
對照品溶液的制備:精密稱取大黃素對照品適量,加甲醇制成每1mL含20μg的溶液,即得。
供試品溶液的制備:取本品適量,研細,取粉末1g,精密稱定,置燒瓶中,加三氯甲烷30ml和2.5mol/L硫酸20mL,置80℃水浴中加熱回流2h,冷卻至室溫,搖勻。分取三氯甲烷液,水層用三氯甲烷20mL振搖提取,合并三氯甲烷液,回收溶液至干,殘渣加甲醇適量使溶解,并轉移至25mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。
陰性制劑溶液的制備:取去除虎杖的陰性制劑,同供試品溶液的方法制備,即得。
2.3.4方法學考察
(1)空白試驗
取陰性制劑溶液20μL注入高效液相色譜儀測定,結果表明,在大黃素峰處基本無干擾。
(2)標準曲線及線性范圍
取大黃素適量,精密稱定,制成81.45μg/mL的標準貯備液,再精密吸取上述對照品溶液1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL,用甲醇定容至10mL,分別吸取20μL對照品溶液注入液相色譜儀測定。結果見表-1。
經回歸分析,得回歸方程:A=74085C+57076,相關系數r=0.9991,線性范圍12.217~28.507μg/mL。
(3)精密度試驗
吸取濃度為20.362μg/mL的對照品溶液20μL注入高效液相色譜儀測定,連續6次,結果見表-2。
(4)重復性試驗
配置供試品溶液(批號)共6份,分別吸取20μL溶液注入液相色譜儀測定,結果見表-3。
(5)加樣回收率試驗
取批號關節克痹丸,研碎的粉末約0.5g,精密稱定,共6份,精密加入81.45μg/mL大黃素對照品溶液3.1mL,混勻后,其他處理同含量測定。分別吸取20μL溶液注入液相色譜儀測定,結果見表-4。
(6)供試品穩定性試驗
取供試品溶液,于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h精密吸取20μL注入高效液相色譜儀,測定樣品12h的穩定性。結果表明,供試品在12h內穩定,見表-5。
(7)樣品含量測定
分別精密吸取20μL注入高效液相色譜儀測定,結果如表-6所示。
3. 結論
質量標準是中藥研究的重要內容之一,需要在中藥的處方組成、制備工藝和藥效物質等基礎上,運用現代科學技術,建立科學、合理、可行的質量標準,從而保障藥品的質量可控[6]。因此,本實驗對關節克痹丸中虎杖進行薄層鑒別,對有效成分大黃素的含量進行測定,制定關節克痹丸的質量標準,提高其質量控制水平,保證藥品的安全性和有效性。結果表明該方法操作簡單,結果準確,專屬性強,穩定性和重復性均較好,為關節克痹丸質量標準的提高提供依據。
參考文獻:
[1]中華人民共和國藥典委員會.衛生部藥品標準.中藥成方制劑,第20冊 [S].1998:87.
[2]殷生楠,殷勇,柳冬梅,等. 關節克痹丸的有效性和安全性臨床研究[J]. 現代醫藥衛生,2007,23(21):3176-3177. 67-2272.
[3]貴州信邦制藥股份有限公司. 關節克痹丸中虎杖的鑒別方法:CN201610752418.7[P]. 2017-02-01. 75.
[4]施惠塤. 高效液相色譜法測定關節克痹丸中大黃素含量[J]. 實用中醫藥雜志,2010,26(11):807.
[5]周紅,俞春芳,王金鋒. HPLC法測定關節克痹丸中大黃素含量[J]. 中國藥師,2007,10(5):474-4.
[6]郭靜,玄振玉,謝燕.中藥復方新藥藥學研究中的問題與思考[J].中草藥,2020,51(08):22.
作者簡介:孫樂明(1984-),男,碩士,助理研究員,研究方向為中藥材栽培與開發。