一株膠凍樣芽孢桿菌培養條件的優化及其解鉀活性

葉偉偉 楊曉燕 魏善強 張龍 黃俊

摘要 ?[目的]優化該膠凍樣芽孢桿菌培養條件及測定其解鉀活性。[方法]用火焰光度計法測定膠凍樣芽孢桿菌的解鉀量;通過大白菜的田間試驗驗證解鉀功能;通過培養基成分及培養條件的優化，獲得最佳培養基和培養條件。[結果]用火焰光度計法測定膠凍樣芽孢桿菌的解鉀量為121.3 mg/L，其解鉀率為12.06%;將其應用到喜鉀作物大白菜上，通過大白菜的田間試驗，與K0（空白對照）組相比大白菜產量增加了15.5%，與只加硫酸鉀的K1相比，產量差異不大;通過培養基成分及培養條件的優化，獲得最佳培養基配比為蔗糖1.0%、酵母浸粉0.1%、硫酸鎂0.02%、磷酸氫二鉀0.05%，最適培養條件為溫度30 ℃、pH 7.0、轉速200 r/min，發酵結果有效活菌數達到17.5×108 CFU/mL，芽孢率≥95%，解鉀率提高到23.02%。[結論]該膠凍樣芽孢桿菌可以將土壤中不可直接被作物吸收利用的鉀素分解為作物可以直接利用的速效鉀形態。

關鍵詞 膠凍樣芽孢桿菌;火焰光度計法;培養條件;優化;解鉀率;有效活菌數;芽孢率

中圖分類號 Q93-335? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）12-0011-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.003

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Optimization of the Culture Condition of a Jelly-like Bacillus Strain and Its Potassium-releasing Activity

YE Wei-wei，YANG Xiao-yan，WEI Shan-qiang et al

（Shandong Jinniu Biotechnology Co.， Ltd.， Jinan， Shandong 250000）

Abstract [Objective] To optimize the culture conditions of the jelly-like Bacillus strain and determine its potassium-releasing activity.[Method] The potassium solubilization amount of Bacillus jelly was determined by flame photometer;the potassium solubilization function was verified by the field test of Chinese cabbage;the best medium and culture conditions were obtained through the optimization of medium composition and culture conditions.[Result] The amount of potassium release of Bacillus jelly measured by flame photometer was 121.3 mg/L， and the potassium release rate was 12.06%. It was applied to the potassium-loving crop Chinese cabbage，through the field test of Chinese cabbage，compared with the K0 （blank control） group， the yield of Chinese cabbage increased by 15.5%;compared with K1 with only potassium sulfate， there was little difference in yield. Through the optimization of the medium composition and culture conditions， the best medium ratio was obtained sucrose 1%， yeast extract 0.1%， magnesium sulfate 0.02%， dipotassium hydrogen phosphate 0.05%， the most suitable culture conditions were temperature 30 ℃， pH 7.0， rotation speed 200 r/min， the effective number of viable bacteria reaches 17.5×108 CFU/mL as a result of fermentation， the spore rate was ≥95%， and the potassium solution rate was increased to 23.02%.[Conclusion] The Bacillus jelly can decompose the potassium in soil that cannot be directly absorbed by crops into quick-acting potassium forms that can be directly used by crops.

Key words Bacillus jelly;Flame photometer method;Culture condition;Optimization;Potassium solution rate;Effective number of viable bacteria;Spore rate

鉀是農作物生長所必需的營養元素之一，其以離子態或可溶性鹽類被吸附在原生質表面上而存在于高等植物中，起著促進蛋白質的合成、光合作用的進行和催化重要的酶促反應等重要作用。我國耕地土壤中蘊含著豐富的鉀元素，但95%的鉀存在于鉀長石和云母這兩類礦物中，不能被植物直接有效利用[1]。近年來隨著土壤養分的失衡，耕地中的速效鉀含量也以2 mg/（kg·a）的速度損耗;又因化肥的過量施用，造成一些鉀被土壤固結，形成各種化學鹽分，在土壤中積累，造成土壤養分結構失調、物理性狀變差。鉀元素已經成為農作物生長的限制因子[2-4]，因此，如何讓土壤中含鉀硅酸鹽礦物轉化為可被作物直接吸收利用的速效鉀形態，從而提高土壤中的速效鉀含量，成為未來農業科技研究的發展方向之一。

1939年，亞歷山大羅夫從土壤中分離篩選出一種可以分解正長石和磷灰石并釋放出鉀元素和磷元素的細菌，將其命名為硅酸鹽細菌，一些研究學者又稱為鉀細菌或膠質芽孢桿菌[5-6]，后來我國一些學者把這些解鉀菌統稱為解鉀微生物。解鉀微生物（potassium-solubilizing microorganism）是能夠在土壤中或純培養條件下，將含鉀礦物如長石、云母等不能被農作物吸收利用的礦物態鉀分解產生水溶性鉀的微生物[7]。土壤中的解鉀微生物在世界各地不同土壤中分布廣泛，研究報道較多的有環狀芽孢桿菌（Bacilluscirculans）、膠質芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）和土壤芽孢桿菌（B.daphicus），其中最常見的為膠質芽孢桿菌。膠質芽孢桿菌又稱膠凍樣芽孢桿菌，一些分類學學者將膠凍樣芽孢桿菌歸為芽孢桿菌屬，1993年Ash等[8]通過對芽孢桿菌屬51個種的16S rRNA基因序列及其他相關研究發現膠凍樣芽孢桿菌歸為另一新屬，并命名為類芽孢桿菌屬（Paenibacillus），因此膠凍樣芽孢桿菌又稱為膠凍樣類芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosus）。Ross等[9]研究認為膠凍樣類芽孢桿菌可以在含有鉀長石粉的無氮培養基上生長，說明膠凍樣芽孢桿菌具有解鉀功能。

筆者前期從土壤中篩選到一株膠凍樣芽孢桿菌，通過火焰光度計法測得該菌株的解鉀率，并通過種植喜鉀作物的田間試驗再次驗證了該菌株的解鉀功能;然后采用單因素試驗和正交試驗對其培養基成分、發酵工藝條件進行優化，獲得了最佳培養基及發酵條件，并通過50 L發酵罐進行中試驗證。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）由山東勁牛集團股份有限公司分離并保存。礦物材料購買鉀長石粉。

1.2 培養基

斜面培養基為無氮培養基，其組成成分為葡萄糖10 g/L、磷酸氫二鉀0.2 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、氯化鈉0.2 g/L、硫酸鉀0.2 g/L、碳酸鈣5 g/L、瓊脂粉18 g/L?；A培養基為無氮培養基，其組成成分為葡萄糖10 g/L、磷酸氫二鉀0.2 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、氯化鈉0.2 g/L、硫酸鉀0.2 g/L、碳酸鈣5 g/L。

1.3 試驗方法

1.3.1 膠凍樣芽孢桿菌菌種活化及發酵培養方法。

（1）斜面活化培養。將-20 ℃保存的菌種轉接到斜面培養基，30 ℃，培養48 h。

（2）搖瓶發酵培養。無菌條件下將活化好的菌種接入發酵培養基，30 ℃、200 r/min振蕩培養20 h即為種子液，同樣無菌條件下，將種子液以2%的接種量接入500 mL三角瓶中，搖瓶裝液量為20%，30 ℃，200 r/min振蕩培養，每隔12 h檢測一次，48 h結束培養，重復培養3次。

（3）50 L發酵罐發酵培養。以5%的接種量將種子液（搖瓶發酵20 h）接種于發酵罐中，30 ℃培養，轉速200 r/min，通氣量為3.3 L/min，發酵60～72 h，芽孢率≥95%視為發酵結束。

1.3.2 活菌計數及芽孢率分析方法。

活菌計數采用平板計數法[10-11]，芽孢率采用芽孢染色后顯微鏡下計數計算。

1.3.3 實驗室解鉀率的測定。

依據王珣玨等[12]解鉀菌解鉀效率檢測方法的比較發現，經過6%H2O2消煮后，用火焰光度計所測鉀含量包括菌體吸附鉀、部分細胞內鉀及溶液中游離態鉀[13]所測得的溶液中K+質量濃度和解鉀率是4種處理方法中得到的結果最準確的，因此選用培養基經H2O2處理后測鉀的方法用火焰光度計測定該菌株的解鉀能力。首先配制好系列鉀標準溶液，繪制鉀標準曲線，再在火焰光度計上測定待測液的速效鉀含量[14]。將搖瓶發酵種子液以2%的接種量接種到100 mL含1 g鉀長石粉的缺鉀培養基中，以加入等量無菌水為空白對照，30 ℃，200 r/min，搖床振蕩培養7 d;取培養液10 mL，加入2 mL 6%H2O2，在沸水浴中消化1 h，取消化液13 000 r/min離心5 min，取上清在火焰光度計上測定K+濃度。解鉀率計算公式如下：

解鉀率=X1-X0M×W×2×104×100%（1）

式中，X1為待測液速效鉀含量（mg/L）;

X0為空白對照鉀含量（mg/L）;

M為鉀長石粉重量（g）;

W為鉀長石中鉀含量（%）[15]。

研究顯示天然鉀長石中的鉀含量約為12%[16]。

1.3.4 膠凍樣芽孢桿菌發酵培養條件優化。

1.3.4.1 碳源篩選及含量優化試驗。

不同碳源對不同微生物菌種發酵的影響不同，碳源選擇原則是既能快速被菌體吸收利用，又能提高有效活菌數及芽孢率，但微生物工業化發酵生產中，培養基用量大，所以在選用碳源時要使用價格低廉且易于獲得的碳源;因蔗糖、糖蜜、可溶性淀粉相對價格低廉且易制取和獲得而被作為首選。該研究以培養膠凍樣芽孢桿菌的經典培養基無氮培養基為基礎培養基，選取常見碳源蔗糖、淀粉、糖蜜進行碳源單因子篩選及含量優化試驗，見表1。

1.3.4.2 氮源篩選及含量優化試驗。

培養基氮源有無機氮源和有機氮源2種，研究表明無機氮源和有機氮源在菌體發酵的不同階段作用不同，在發酵前期無機氮源更有利于被菌體快速吸收利用，而有機氮源則是在菌體生長一定階段后才被菌體重復利用[17]。該研究以培養膠凍樣芽孢桿菌的經典培養基無氮培養基為基礎培養基，綜合原料成本及獲取難易程度，選取常見氮源酵母浸粉、牛肉膏、豆粕、硫酸銨進行氮源單因子篩選及含量優化試驗，見表2。

1.3.4.3 溫度、初始pH及轉速發酵條件優化試驗。

培養溫度、初始pH及轉速是影響菌株生長的主要條件，利用單因素試驗確定培養基最佳培養條件，試驗設計見表3。

1.3.5 正交試驗。

利用單因素試驗確定的最佳碳源、氮源和中心水平，選取蔗糖、酵母浸粉、硫酸鎂和磷酸氫二鉀含量進行4因素3水平正交試驗，獲得最優發酵配方，正交試驗因素和水平見表4。

1.3.6 發酵罐試驗。

采用正交試驗獲得的最佳培養基配方及單因素試驗確定的最佳發酵工藝條件，以5%的接種量將種子液接種于裝液量為70%的50 L發酵罐中，30 ℃培養，轉速200 r/min，通氣量為3.3 L/min，48 h發酵結束，發酵液先離心再進行噴霧干燥得到菌粉，測定相關指標及單位濃度內菌的解鉀活性。

1.3.7 田間試驗。

選取喜鉀作物大白菜為試驗材料，品種為西星秋王。試驗地土壤類型為褐土、表層質地為輕壤，土壤肥力較高，排灌條件良好。試驗設4個處理，處理①（K0），空白處理即不施加任何東西;處理②（K1），不加菌液加硫酸鉀;處理③（K2），加菌液不加硫酸鉀;處理④（K3），加菌液加硫酸鉀。每個處理重復3次，每個處理的小區面積為45 m2，隨機排列，小區設立保護行2 m;網室栽培，定期澆水，保持試驗田濕度，網室有遮雨篷防止因下雨而導致養分流失。試驗時間8月1日至10月31日。試驗期間田間管理措施一致，白菜采收按小區單獨采收、稱重、計產。

2 結果與分析

2.1 實驗室解鉀率測定

將菌株種子液接種到以鉀長石粉為唯一鉀源的培養基中，振蕩培養7 d后，取培養液經6%H2O2消化處理，測定該菌株的解鉀量為121.3 mg/L，空白對照組解鉀量為1.5 mg/L，計算可得其解鉀率為12.06%。

2.2 膠凍樣芽孢桿菌發酵培養條件優化

2.2.1 碳源篩選及含量優化。

有研究表明，可溶性淀粉、糖蜜有利于菌體生長和芽孢的形成，而蔗糖有利于菌體生長但抑制芽孢形成[18]。從表5可以看出，隨著蔗糖添加量的增多，有效活菌數并沒有隨之增多，反而下降，雖然蔗糖有利于菌體生長，但是大量的蔗糖也抑制了芽孢的形成，從而降低了菌的存活率，所以隨著蔗糖添加量的增多，有效活菌數沒有一直增多，反而下降。隨著糖蜜添加量的增多，有效活菌數增多，但1.0%和2.0%糖蜜的添加量的有效活菌數并沒有顯著區別，而且在添加量相同的情況下，添加糖蜜的有效活菌數和芽孢數均低于添加蔗糖的有效活菌數和芽孢數，所以添加蔗糖優于糖蜜;選取最優1.0%蔗糖添加量和不同比例淀粉組合作為復合碳源的有效活菌數和芽孢數也低于單獨添加蔗糖的有效活菌數和芽孢數，綜合有效活菌數和芽孢形成情況，選取最佳碳源為蔗糖，1.0%為最佳用量進行下一步試驗。

2.2.2 氮源篩選及含量優化。從表6可以看出，除豆粕外，酵母浸粉、硫酸銨、牛肉膏這幾種氮源對膠凍樣芽孢桿菌芽孢的形成影響并不大。當分別用酵母浸粉、豆粕、牛肉膏作為單一氮源時，酵母浸粉作為單一氮源的有效活菌數均高于其他2種單一氮源，尤其是酵母浸粉添加量為0.10%時，有效活菌數最高（8.5×108 CFU/mL），也均高于0.10%酵母浸粉和不同比例硫酸銨組合作為復合氮源的有效活菌數。綜合芽孢形成情況、成本等因素，選取最佳氮源為酵母浸粉及其添加量為0.10%進行下一步試驗。

2.2.3 溫度、初始pH及轉速發酵條件優化。由圖1可知，該膠凍樣芽孢桿菌在30 ℃培養時有效活菌數最多（9.2×108 CFU/mL），同一發酵周期內較37 ℃培養時有效活菌數（3.2×108 CFU/mL）高出65%，試驗得出的該培養溫度與赫玲玲等[19]解鉀膠凍樣芽孢桿菌的液態發酵培養基及條件優化中的培養溫度（37 ℃）不同，經分析可知，其發酵初期的溫度是在28～32 ℃，發酵后期溫度升至37 ℃，是因為在較高發酵溫度下菌體易形成芽孢，所以膠凍樣芽孢桿菌菌體生長增殖期和芽孢形成期的溫度不同，與趙志浩等[1]的膠質芽孢桿菌的發酵工藝研究和田間應用結果相符，也說明相同菌種不同的培養目的有不同的發酵溫度[20]。

由圖2可知，不同的初始pH對菌種的發酵結果有不同的影響，但是合適的初始pH可以縮短菌體的生長周期，加快菌體的生長繁殖速度[21]。當培養基初始pH在6.0、6.5的弱酸性環境時，有效活菌數相對較低，當培養基初始pH在7.0～8.0中性至弱堿環境時，有效活菌數增加，初始pH在7.5時，有效活菌數最高，為8.9×108 CFU/mL，由此可得出該膠凍樣芽孢桿菌適合在中性至弱堿性條件下生長。

有研究表明，膠質芽孢桿菌為好氧菌，且臨界氧濃度也很高，不同的轉速會有不同的通氣量，因此轉速也是影響膠凍樣芽孢桿菌菌量的重要因素[22]。從圖3可以看出，在一定范圍內，膠凍樣芽孢桿菌的菌量隨著轉速的增加而增加，在200 r/min的轉速下，菌量最高，為9.1×108 CFU/mL，但是在200～220 r/min的轉速下，菌量隨著轉速的增加而降低，由此可以得出該膠凍樣芽孢桿菌的最適轉速為200 r/min。

2.3 正交試驗

根據單因素試驗的結果，選取蔗糖、酵母浸粉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀進行4因素3水平正交試驗，正交試驗結果見表7，從正交試驗的結果分析可知，影響膠凍樣芽孢桿菌發酵總菌數的因素由主到次依次為A（蔗糖）>B（酵母浸粉）>C（硫酸鎂）>D（磷酸氫二鉀）;培養基的最佳組合是A2B2C1D1，即蔗糖1.0%、酵母浸粉0.10%、硫酸鎂0.02%、磷酸氫二鉀0.05%，并在最佳配比條件下進行了3次驗證試驗，有效活菌數平板計數結果顯示總菌數平均為17.5×108 CFU/mL，比優化前（16.5×108 CFU/mL）提高了6.1%。

2.4 發酵罐發酵

在正交試驗獲得的最佳培養基配方及單因素試驗確定的最佳發酵工藝條件的基礎上，進行50 L發酵罐發酵試驗。試驗以5%的接種量，pH 7.0～8.0，轉速200 r/min，通氣量為3.3 L/min，30 ℃培養，發酵時長為72 h，每12 h取一次樣，平板計數法測總菌數，油鏡下觀察芽孢大小狀態及脫落情況。由圖4可知，發酵至48 h有效活菌數最高，此后，隨著時間的延長，有效活菌數逐漸減少;在油鏡觀察下，在發酵24 h取樣鏡檢時，發現有菌體形狀大小整齊，有孢囊出現，48 h鏡檢時，55%左右的芽孢脫落，大小一致，同步率95%左右，因此，在此次試驗優化的培養基及培養條件下，該膠凍樣芽孢桿菌在未補料且單批次發酵培養的發酵周期為48 h左右，如需一定的有效活菌數和芽孢率，還需要進行補料試驗或再次優化培養條件，以達到工業化生產需求。通過火焰光度計法再次測定優化培養基后培養的該菌的解鉀量為231.5 mg/L，空白對照組解鉀量為1.5 mg/L，計算可得單位濃度內該菌的解鉀率為23.02%，說明優化培養基和培養條件后單位濃度內的有效活菌數增多，所以再次測定單位濃度菌的解鉀率提高了。

2.5 田間試驗

該研究通過田間試驗觀察解鉀菌對植物生長的影響。8月1日進行田間試驗并觀察大白菜生長期內的生物學性狀，包括株高、單株重、球莖大小，10月31日采收，統計各小區產量，結果如表8所示。

根據表8中數據，分別對K0與K1、K2、K3在株高、單株重、球莖和小區產量方面進行單樣本雙側t檢驗，結果顯示，株高、單株重、球莖和小區產量均在0.05水平差異顯著。K1與K0相比，在株高、單株重、球莖和小區產量上均高于K0，可見K1中大白菜利用了硫酸鉀中的鉀素，提高了大白菜產量;K2比K1在株高、單株重、球莖和小區產量上均有所提高，且K1施加硫酸鉀，K2未施加硫酸鉀，說明K2施加的菌液有效促進了土壤中鉀素的利用，使K2組中大白菜產量明顯提高。從表8還可以看出，K3在株高、單株重、球莖和小區產量上均比施加了硫酸鉀的K1有明顯提高，從而也可以得出K3中施加的菌液提高了土壤中鉀素的利用率;而且在實驗室中應用火焰光度計也測出了該菌的解鉀量，綜上所述可以得出該膠凍樣芽孢桿菌具有解鉀功能，可以使土壤中不可被直接吸收利用的鉀素形態分解為大白菜可以吸收利用的速效鉀形態，使得大白菜在生長過程對鉀素的需求得到滿足。

3 討論與結論

膠凍樣芽孢桿菌根據不同來源、不同貯藏條件及不同的研究目的，其發酵培養基配方和發酵條件不同[23]，發酵結果也會存在一定的差異。該研究對膠凍樣芽孢桿菌液體培養基的碳源、氮源種類進行了單因素含量優化試驗，對發酵最適溫度、最佳pH、最適轉速進行了優化試驗，并且依據單因素和發酵條件優化的試驗結果，進行了4因素3水平的正交試驗，正交試驗結果顯示最佳培養基配比為蔗糖1.0%、酵母浸粉0.10%、硫酸鎂0.02%、磷酸氫二鉀0.05%，發酵結果測得有效活菌數為17.5×108 CFU/mL，結果比優化前提高了6.1%，且發酵結果比王金玲等[24]進行發酵條件優化后有效活菌數達到3.47×108 CFU/mL、吳向華等[22]對發酵條件優化后有效活菌數達到9.58×108 CFU/mL都有一定程度的提高。

該研究選用培養基經H2O2處理后測鉀的方法，經測定該膠凍樣芽孢桿菌的解鉀率為12.06%，通過對其培養基和培養條件優化后，再次測定單位濃度內該菌的解鉀率提高到23.02%，但與李海龍等[25]從土壤中分離的芽孢桿菌QL21的解鉀率為25.1%、趙飛等[26]從鉀礦物表面分離篩選出來的2株菌的解鉀率分別為29.8%、25.4%相比，該菌株的解鉀能力仍存在一定的差距，因此需要進一步馴化、改良該菌株的解鉀能力;與賀積強等[27]從紫色土壤中分離篩選出的40株解鉀菌的解鉀率為0.66%～7.90%相比，該菌株的解鉀能力也具有較大的優勢。由此可知，不同的菌株及處于不同生境的解鉀菌，因其生態演化機制不同，其解鉀能力也不同，解鉀量也是有限的，因此分離、篩選出高效解鉀菌株或者通過基因工程及誘變育種等技術手段獲得高繁殖力、高解鉀能力的優良菌株是今后解鉀菌的研究方向之一。

綜上所述可知該膠凍樣芽孢桿菌具有一定的解鉀能力，如果實現生產含有該菌的生物菌肥并將其應用到農業生產，為土壤提供充足的鉀素，滿足農作物生長，還需要進行進一步優化和改良該菌株。

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