麻瘋樹油體鈣蛋白JcCale26.8基因克隆及序列分析

蒲芝雨 黃建輝 李國澤 丁勇

摘要 [目的]克隆麻瘋樹（Jatrapha curcas）油體鈣蛋白基因JcCale26.8全長cDNA序列，探究麻瘋樹油體鈣蛋白及其基因的結構與功能。[方法]應用RNA-seq測序和PCR技術，從麻瘋樹種子中克隆獲得1個油體鈣蛋白家族基因JcCale26.8，并進行測序和序列分析。[結果]JcCale26.8基因序列含有6個外顯子和5個內含子，內含子剪接位點符合真核生物基因的GT-AG法則。JcCale26.8基因mRNA序列的完整開放閱讀框長717 bp，推測編碼由238個氨基酸組成、相對分子量為26.8 kD的油體鈣蛋白JcCale26.8。JcCale26.8蛋白主要由α-螺旋和無規則卷曲結構構成，并具有油體鈣蛋白典型結構特征，與來自蓖麻、川桑和異色山黃麻等多個不同物種的Caleosin蛋白具有較高的同源相似性。[結論]該研究可為麻瘋樹油體鈣蛋白基因的表達調控與功能研究奠定基礎。

關鍵詞 種子;油體;麻瘋樹;油體鈣蛋白;基因克隆

中圖分類號 S 794.9? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）12-0086-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.022

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Cloning and Sequence Analysis of Caleosin Gene JcCale26.8 in Jatropha curcas

PU Zhi-yu，HUANG Jian-hui，LI Guo-ze et al

（Key Laboratory of Forest Biotechnology in Yunnan，Southwest Forestry University，Kunming，Yunnan 650224）

Abstract [Objective]To clone the full-length cDNA sequence of JcCale26.8 gene from J.curcas and investigate the structure and function of caleosin and its gene in J.curcas seeds.[Method]This study used RNA-sequencing and PCR technology to clone a caleosin family gene JcCale26.8 from J.curcas seeds.Then the sequence of gene JcCale26.8 were sequenced and analyzed.[Result]The DNA sequence of JcCale26.8 gene contains 6 exons and 5 introns.The splicing sites of introns conform to the GT-AG rule of eukaryotic genes.The full-length mRNA comprised 717 bp nucleotides consisting of an open reading frame encoded a putative JcCale26.8 comprising 238 amino acid residues with molecular weight of 26.8 kD.JcCale26.8 protein is mainly composed of α-helix and random coil structure，and has the typical structural characteristics of caleosin.It has high homology and similarity with caleosin proteins from many different species such as Ricinus communis，Morus notabilis and Trema orientalis.[Conclusion]The? study can lay the experimental foundation for the study of the expression regulation and function of caleosin gene in J.curcas.

Key words Seed;Oil body;Jatropha curcas;Caleosin;Gene cloning

油體是脂質（主要是三酰甘油）儲存庫，主要存在于種子和衰老的葉片中[1]。油體不僅在植物生長發育過程中發揮重要作用，還能參與脅迫響應和激素信號通路等過程[2]。油體由外部完整的磷脂單分子層和圍繞著疏水核心的膜蛋白組成[3]，這些膜蛋白包括油質蛋白（Oleosin）、油體鈣蛋白（Caleosin）和油體固醇蛋白（Steroleosin）[4]。Oleosin是植物油體特有，且最為豐富的結合蛋白[5-6]，與油體大小和種子萌發率密切相關，并能增強植物種子的抗凍性[4]。Caleosin作為油體上的微量結合蛋白，最早發現于水稻（Oryza sativa）穎果發育時期的細胞膜上[7]，其在植物種子萌發過程中參與脂質降解[8]、油體形成[9]及維持油體的穩定[10]，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）的非種子組織中，Caleosin還表現出過氧羥基脂肪酸羥化環氧化酶活性[11]，參與抵抗逆境脅迫[11]和植物開花調節[12]等過程。

麻瘋樹（Jatrapha curcas）又名黃腫樹（廣東）、芙蓉樹、假花生（廣西）、高桐（云南）、嗎哄罕（傣名）、桐油樹（臺灣）、南洋油桐（日本），為大戟科（Euphorbiaceae）麻瘋樹屬（Jatropha）植物，主要分布于熱帶和亞熱帶地區，在我國半野生或栽培種植面積較廣，資源豐富[13]。成熟麻瘋樹種子的含油量高達36%[14]，野生麻瘋樹種仁的最高含油量約60%，超過油菜和大豆等常見的油料作物[15]，因此開展麻瘋樹油體結合蛋白及其基因結構與功能研究對于其在油供工業方面的開發利用具有重要意義。而基因克隆與序列分析是開展不同生物目標基因功能研究的前提[16-18]。目前，Oleosin和Caleosin油體結合蛋白基因已經在水稻[7]、芝麻（Sesamum indicum）[9]、油菜（Brassica napus）[19]、擬南芥[20]和蓖麻（Ricinus communis）[21]等不同植物成熟種子中被克隆獲得。有關麻瘋樹中Oleosin及其基因序列和結構特征已有研究[22-24]，但關于麻瘋樹Caleosin及其基因的研究鮮見報道。筆者以麻瘋樹種子為材料，應用RNA-seq和PCR技術克隆麻瘋樹Caleosin基因序列并進行分析，為完善對麻瘋樹油體膜蛋白的認識及后續解析Caleosin在麻瘋樹中的基因表達特征和功能發揮奠定試驗基礎。0D9E048B-6BF5-4DF0-A58B-5397006E25A7

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 試驗材料為3年生麻瘋樹植株發育40 d的麻瘋樹種子，取自西雙版納熱帶植物園，液氮速凍后放置于-80 ℃冰箱中保存備用。

RNA提取Trizol試劑和新型快速植物基因組DNA提取試劑盒為OMEGA公司產品，反轉錄（5 × All-In-One RT MasterMix）和PCR（Kodaq 2 × PCR MasterMix with dye）試劑盒為愛必夢（abm）公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 核酸提取與檢測。

將麻瘋樹種子種殼去除，取種仁于液氮中研磨并用于核酸提取?？俁NA的提取按照Trizol試劑使用說明書進行，基因組DNA的提取按照OMEGA公司新型快速植物基因組DNA提取試劑盒使用說明書進行;基因組DNA和總RNA的完整性和純度分別用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和Nano Photometer分光光度計（IMPLEN CA USA）檢測。

1.2.2 麻瘋樹種子RNA-seq測序及目標基因挖掘。

檢測合格的總RNA樣本送至安諾優達基因科技（北京）有限公司，構建文庫后利用Illumina平臺進行RNA-seq測序，原始下機序列（Raw Reads）通過去低質量序列、去接頭污染等過程完成數據處理得到高質量的序列（Clean Reads）。對質控后的高質量序列進行組裝，再基于組裝序列結果進行ORF及功能預測分析，從RNA-seq數據庫中挖掘具有潛在Caleosin功能結構域的目標cDNA序列。

1.2.3 麻瘋樹JcCale26.8基因cDNA序列克隆驗證。

在目標基因cDNA序列ORF區兩側設計特異性引物對F（5′-AGATGGCTACTAGAACGGACG-3′）和R（5′-GCCACCATTGCTTTACATTCT-3′），并委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。取總RNA樣品為模板，按照反轉錄試劑盒說明書進行第一鏈cDNA的合成。取反轉錄產物cDNA 模板2.0 μL，R和F引物（10 μmol/μL）各0.5 μL，Kodaq 2 PCR MasterMix 12.5 μL，Nuclease-free H2O 9.5 μL，建立25 μL PCR反應體系。PCR反應程序：94 ℃ 預變性3 min，94 ℃變性30 s，53.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，38個循環，72 ℃延伸10 min。

1.2.4 麻瘋樹JcCale26.8基因DNA序列克隆。

取“1.2.1”步驟中提取的高質量gDNA樣品3 μL為模板，R和F為引物對，進行JcCale26.8基因DNA序列的PCR擴增，反應體系和擴增條件同“1.2.3”。

1.2.5 PCR產物檢測回收與克隆測序。步驟“1.2.3”和“1.2.4”中PCR產物采用1.0%瓊脂凝膠電泳檢測，目的片段回收后與pMD19-T載體連接，轉化DH5a感受態細胞，經復蘇后涂布在LB固體培養基上（含Amp、IPTG和X-Gal）培養，藍白斑篩選陽性克隆，委托上海生工生物技術服務有限公司測序。

1.2.6 JcCale26.8基因的生物信息學分析。應用表1顯示的網站對JcCale26.8基因及推導編碼的蛋白質序列進行對應項目內容的分析。

2 結果與分析

2.1 總RNA提取和JcCale26.8基因的cDNA序列克隆分析

植物組織總RNA樣品的純度和完整性是基因克隆等分子生物學試驗成功的關鍵因素[25-26]。該試驗獲得的發育40 d 麻瘋樹種子總RNA完整性好，顯示28S和18S rRNA條帶清晰，點樣孔無亮斑，無彌散拖尾，且前者條帶的亮度約為后者的2倍（圖1）;總RNA的A260/A280比值在1.8～2.0，說明純度好且無蛋白質、多糖和酚類物質等雜質污染[27]。符合RNA-seq建庫測序和基因克隆試驗要求。試驗構建的麻瘋樹種子RNA-seq數據庫共獲得33 902個Unigene，GC含量占40.72%，總堿基數達33 168 384個，從中挖掘獲得2條cDNA序列具有潛在Caleosin功能結構域（表2），序列S1和S2均具有完整ORF區域。以具有較長ORF區的序列S1為目標進行克隆驗證分析。按“1.2.3”進行RT-PCR擴增反應，瓊脂糖凝膠電泳結果（圖2）顯示，在對應DL2000分子量標準的750 bp條帶處出現1條符合預期大小的主條帶，經膠回收T/A克隆測序，獲得與轉錄組數據庫Unigene序列S1引物間完全一致的長738 bp的cDNA序列。長1 026 bp的目標序列S1推導編碼分子量為26.8 kD的Caleosin蛋白，因此命名為JcCale26.8基因。該試驗獲得JcCale26.8基因cDNA序列全長1 026 bp，1～43 bp為5′UTR，761～1 026 bp為3′UTR，位于826～831 bp的一致性序列AATAAA和2個U-rich單元（位于957～964 bp和1 016～1 021 bp處）為預測的PolyA信號位點;44～760 bp為完整ORF，推測編碼由238個氨基酸組成的Caleosin蛋白JcCale26.8。

2.2 JcCale26.8基因DNA序列克隆與分析 該試驗提取的麻瘋樹種子基因組DNA完整性好、純度高。DNA樣品條帶清晰單一（圖3），點樣孔無亮斑，無彌散拖尾，其A260/A280值為1.96。以提取的高質量DNA樣品為模板，按“1.2.4”進行PCR擴增獲得大于2 000 bp的DNA條帶（圖4），克隆測序結果為2 018 bp的JcCale26.8基因組DNA序列。經DNA和mRNA序列比對分析（圖5）顯示，JcCale26.8基因含有6個外顯子和5個內含子。內含子位于JcCale26.8基因DNA序列116～395、546～1 008、1 095～1 271、1 367～1 464、1 591～1 674 bp，每個內含子序列5′端為GT、3′端為AG，均符合真核生物基因內含子剪接位點的GT-AG規則。0D9E048B-6BF5-4DF0-A58B-5397006E25A7

2.3 JcCale26.8基因序列分析

通過 NCBI 網站 Blast 工具和CD-Search服務器對麻瘋樹JcCale26.8基因編碼的238個氨基酸序列進行相似性搜索分析和功能域分析，結果（圖6）表明，目的基因編碼的麻瘋樹28.6 kD的Caleosin蛋白為Caleosin蛋白超家族成員，具有典型的Caleosin功能結構域。該蛋白序列與NCBI登錄的來自麻瘋樹的未知蛋白JCGZ 02382（KDP40384.1）和過氧羥基脂肪酸羥化環氧化酶（Peroxygenase，POG） 異構體X1 （XP 012069904.1）的氨基酸序列具有100%的一致性，表明該試驗成功克隆獲得的麻瘋樹Caleosin蛋白可能具有POG酶活性。

JcCale26.8和其他物種Caleosin蛋白或具有POG酶活性的Caleosin蛋白具有較高的同源性（表3），與來自蓖麻（Ricinus communis）（XP_002528367.1）、川桑（Morus notabilis）（XP_010089211.1）、愛玉子（Ficus pumila var.Awkeotsang）（ABV72237.1）、異色山黃麻（Trema orientalis）（PON94834.1）等17個不同物種間的Caleosin蛋白同源相似性均達70%以上，其中與蓖麻的同源相似度最高，達87.07%?；贛EGA-x軟件構建的系統進化樹（圖7）顯示，愛玉子（ABV72237.1）、楊梅（Myrica rubra）（KAB1219333.1）和川桑（XP_010089211.1）聚為一個分支，且與JcCale26.8的親緣關系最遠;JcCale26.8與蓖麻（XP_002528367.1）、野大豆（Glycine soja）（KHN30721.1）的Caleosin蛋白聚為一個分支，表明JcCale26.8與蓖麻和野大豆中具有POG酶活性的Caleosin蛋白親緣關系較近。

蛋白質理化性質分析結果顯示，JcCale26.8蛋白分子式為C1218H1829N317O350S10，相對分子量26.83 kD，等電點5.50;JcCale26.8蛋白由除天冬酰胺（Asn，N）外的19種常見氨基酸組成，亮氨酸（Leu，L）含量最高為8.8%，半胱氨酸（Cys，C）含量最低為0.8%，其他氨基酸含量在2.1～8.0%，氨基酸組成差異較小;負電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）有28個，正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）有22個;摩爾消光系數（extinction coeffificients）為45 505，不穩定系數（Instability index）為52.01。蛋白信號肽分析顯示，無信號肽酶酶切位點（圖8），推測JcCale26.8屬于不穩定的非分泌性酸性蛋白質。

疏水作用在維持蛋白質高級結構穩定中發揮著重要作用，較高正值的氨基酸具有較強的疏水性，而較低負值的氨基酸則具有較強的親水性。通過在線軟件ExPASy對JcCale26.8進行蛋白質親疏水性分析，結果（圖9）顯示，大部分氨基酸為負值，表現為親水性，尤其是N-末端、127～150位氨基酸殘基和C-末端表現為較明顯的親水區，第46位氨基酸殘基處親水性最強（-2.144）;87～107位和182～201位氨基酸殘基處表現出較明顯的疏水性，99和100位氨基酸殘基疏水性最強（3.067），推測JcCale26.8為兩親性蛋白?；赥MHMM在線軟件分析結果顯示，JcCale26.8蛋白無明顯的跨膜結構域（圖10），推測該蛋白可能以中間疏水區域錨定在油體膜表面而發揮作用。

二級結構預測結果顯示，JcCale26.8主要由無規卷曲（46.64%）和α-螺旋（35.29%）結構構成，還含有少量的延伸鏈（10.92%）和β-轉角（7.14%）等二級結構。無規卷曲主要位于第3～7、13～27、31～38、42～59、80～83、107～122、128～138、146～149、160～168、179～184、207～210位氨基酸殘基區域，α-螺旋結構主要位于第8～12、60～67、84～89、94～105、150～159、169～177、185～207、211～218、234～238位氨基酸殘基區域，延伸鏈主要位于第68～70、77～79、103～104、123～127、139～141、198～202、222～225位氨基酸殘基區域，β-轉角主要位于第72～75、90～91、143～145、205～206、219～220、231～232位氨基酸殘基區域（圖11）。

蛋白質三級結構預測（圖12）顯示，JcCale26.8主要由9個α-螺旋和無規卷曲結構構成，模型置信度為97.7%，符合二級結構預測結果。根據三維結構預測結果，并結合親疏水性、跨膜結構和二級結構預測結果，預測麻瘋樹JcCale26.8蛋白符合油體鈣蛋白典型結構特征，包括可結合鈣離子的N端親水區，中間含有脯氨酸的疏水區和C端的磷酸化位點[28]，可能在油體的形成及調動中傳遞信號，在種子萌發過程中通過信息轉運來啟動分解油體內中性脂肪產生能量。

3 結論與討論

Caleosin是一種與植物油體發育發生密切相關的油體結合蛋白之一，其編碼基因已從水稻[7]、芝麻[9]和擬南芥等[21]多種植物中克隆得到，不同植物的Caleosin蛋白序列具有較高的同源性，尤其是具有結合單一鈣離子的EF-hand保守域，并類似主要油體結合蛋白 Oleosin 能與油體相結合等特性[29]。該試驗通過RNA-seq和PCR技術從麻瘋樹成熟種子中成功克隆了編碼26.8 kD Caleosin蛋白的JcCale26.8基因mRNA和對應基因組DNA序列，推測編碼的JcCale26.8蛋白明顯具有Caleosin蛋白結構特征，并與已知多種植物Caleosin蛋白具有較高的序列相似性。0D9E048B-6BF5-4DF0-A58B-5397006E25A7

對JcCale26.8基因序列進行生物信息學分析發現，該序列早期在Zhang等[30]對鹽脅迫下麻瘋樹幼苗葉片的基因組測序數據庫中（PRJNA63485）分析拼接獲得，并被注釋為未知蛋白JCGZ_02382（KDP40384.1），而Jalali等[31]對麻瘋樹基因組進行測序獲得的數據庫（PRJNA673911）進行分析拼接獲得了該序列，并根據同源性自動被注釋為POG （XP_012069904.1） 基因蛋白，但并未得到研究。有研究發現，Caleosin在非種子組織中表現出POG活性[32]，因而目前在NCBI數據庫中具有Caleosin功能結構域的Caleosin蛋白序列多數被注釋為POG蛋白。為了探究麻瘋樹油體鈣蛋白及其基因的結構與功能，筆者從麻瘋樹種子中克隆分離了JcCale26.8基因mRNA和DNA序列，序列特征分析結果表明JcCale26.8基因表達產物為植物Caleosin蛋白家族成員，而在麻瘋樹中JcCale26.8基因表達產物JcCale26.8蛋白是否具有POG酶活性仍需要深入研究。

Caleosin在植物中通常由多基因家族編碼，分子量一般在25～35 kD。目前已至少在15種植物中鑒定出了84個Caleosin基因[33]，如擬南芥基因組中鑒定出了8個Caleosin基因[34]，榛子（Corylus avellana L.）基因組中鑒定出5個Caleosin基因[35]，油菜（Brassica napus）中至少包含25.0、27.0、28.1 kD 的 3 個Caleosin 蛋白成員[29]。推測在麻瘋樹中至少存在4個Caleosin家族異構體蛋白。該試驗克隆分離了26.8 kD的Caleosin基因序列，同時該試驗麻瘋樹種子轉錄組數據庫結果中還顯示有另一具有Caleosin功能結構域的119個氨基酸殘基組成的推測13.7 kD的Caleosin基因序列;根據對NCBI登陸的麻瘋樹基因組數據庫PRJNA673911顯示的另外2個POG酶蛋白序列XP_020534220.1和XP_012072291.2分析顯示， XP_020534220.1（NCBI注釋為peroxygenase isoform X2）序列蛋白為206個氨基酸殘基組成的22.9 kD的Caleosin，XP_012072291.2（NCBI注釋為probable peroxygenase 4）序列蛋白為249個氨基酸殘基組成的28.7 kD的Caleosin。因此，推測以上4個序列對應的蛋白均屬于Caleosin超家族成員。這可為后期開展麻瘋樹Caleosin家族蛋白的深入研究提供參考。

參考文獻

[1]

SHIMADA T L，HAYASHI M，HARA-NISHIMURA I.Membrane dynamics and multiple functions of oil bodies in seeds and leaves[J].Plant physiology，2018，176（1）：199-207.

[2] CHAPMAN K D，DYER J M，MULLEN R T.Biogenesis and functions of lipid droplets in plants[J].Journal of lipid research，2012，53（2）：215-226.

[3] LAIBACH N，POST J，TWYMAN R M，et al.The characteristics and potential applications of structural lipid droplet proteins in plants[J].Journal of biotechnology，2015，201：15-27.

[4] ITABE H.Intracellular lipid droplet-associated proteins：Unique members and their biological functions[J].Biological and pharmaceutical bulletin，2010，33（3）：341.

[5] CAPUANO F，BEAUDOIN F，NAPIER J A，et al.Properties and exploitation of oleosins[J].Biotechnology advances，2007，25（2）：203-206.

[6] 孫靜，姜宇，陶俊.植物油質蛋白的結構、功能及應用[J].植物生理學報，2018，54（3）：363-369.

[7] FRANDSEN G，MLLER-URI F，NIELSEN M，et al.Novel plant Ca2+-binding protein expressed in response to abscisic acid and osmotic stress[J].The journal of biological chemistry，1996，271（1）：343-348.

[8] POXLEITNER M，ROGERS S W，LACEY SAMUEL A，et al.A role for caleosin in degradation of oil-body storage lipid during seed germination[J].The plant journal，2006，47（6）：917-933.

[9] CHEN J C F，TSAI C C Y，TZEN J T C.Cloning and secondary structure analysis of caleosin，a unique calcium-binding protein in oil bodies of plant seeds[J].Plant and cell physiology，1999，40（10）：1079-1086.0D9E048B-6BF5-4DF0-A58B-5397006E25A7

[10] JIANG P L，TZEN J T C.Caleosin serves as the major structural protein as efficient as oleosin on the surface of seed oil bodies[J].Plant signaling behavior，2010，5（4）：447-449.

[11] PARTRIDGE M，MURPHY D J.Roles of a membrane-bound caleosin and putative peroxygenase in biotic and abiotic stress responses in Arabidopsis[J].Plant physiology and biochemistry，2009，47（9）：796-806.

[12] BLE E，BOACHON B，BURCKLEN M，et al.The reductase activity of the Arabidopsis caleosin RESPONSIVE TO DESSICATION 20 mediates gibberellin-dependent flowering time，abscisic acid sensitivity，and tolerance to oxidative stress[J].Plant physiology，2014，166（1）：109-124.

[13] 韋劍鋒，韋冬萍，吳炫柯，等.麻瘋樹種子特性及其影響因素研究進展[J] .種子，2013，32（2）：51-55.

[14] LIU H，WANG C P，KOMATSU S，et al.Proteomic analysis of the seed development in Jatropha curcas：From carbon flux to the lipid accumulation[J].Journal of proteomics，2013，91：23-40.

[15] 鄧志軍，程紅焱，宋松泉.麻瘋樹種子的研究進展[J].云南植物研究，2005，27（6）：605-612.

[16] 鄭元，羅婭娜，羅瑪妮婭，等.牛樟芝羊毛甾醇合成酶基因AcLSS的克隆和表達分析[J].西南林業大學學報（自然科學），2021，41（3）：94-99.

[17] 陽江華，張希財，鄒智.橡膠樹捕光葉綠素 a/b 結合蛋白基因CAB2的克隆與分析[J].西南林業大學學報（自然科學），2019，39（1）：88-94.

[18] 徐志文，任雪敏，趙滿，等.黃粉甲儲存蛋白hexamerin基因的克隆及表達分析[J].西南林業大學學報（自然科學），2019，39（4）：96-102.

[19] NSTED H，FRANDEN G I，JAUH G Y，et al.Caleosins：Ca2+-binding proteins associated with lipid bodies[J].Plant molecular biology，2000，44（4）：463-476.

[20] JOLIVET P，ROUX E，DANDREA S，et al.Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS[J].Plant physiology and biochemistry，2004，42（6）：501-509.

[21] HYUN T K，KUMAR D，CHO Y Y，et al.Computational identification and phylogenetic analysis of the oil-body structural proteins，oleosin and caleosin，in castor bean and flax[J].Gene，2013，515（2）：454-460.

[22] 熊宏，陳海濤，宋健，等.麻風樹油質蛋白JcOle16.6基因克隆及序列分析[J].江蘇農業科學，2016，44（6）：84-89.

[23] 宋健，熊宏，余進德，等.麻瘋樹油質蛋白JcOle14.3基因克隆及序列分析[J].中南林業科技大學學報，2016，36（6）：15-22.

[24] 余進德，熊宏，宋健，等.麻瘋樹種子發育過程中JcOle14.3和JcOle16.6基因的表達模式研究[J].廣西植物，2017，37（9）：1096-1100.

[25] 徐秋紅，章鎮，佟兆國，等.山梨醇對李果肉組織總RNA提取的影響[J].江蘇農業學報，2010，26（2）：390-394.

[26] 張君堂，陶承光，王志剛，等.Trizol-A+試劑法提取百合總RNA[J].江蘇農業科學，2009（2）：35-36.

[27] 丁勇，李濤，龔秀會，等.3種杜仲枝葉總RNA提取方法的比較[J].江蘇農業科學，2011，39（5）：29-31.

[28] 向蘭舟，胡婭晴，謝涵，等.擬南芥油體鈣蛋白基因CALEOSIN 3對脅迫環境及ABA誘導的響應[J/OL].分子植物育種，2021-01-22[2021-04-27].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.2021，20210122.1218.004.html.

[29] 丁勇，陳慶波，徐春雷，等.油菜油體鈣蛋白基因BnClo1的克隆和表達[J].作物學報，2008，34（11）：1921-1928.0D9E048B-6BF5-4DF0-A58B-5397006E25A7

[30] ZHANG L，ZHANG C，WU P Z，et al.Global analysis of gene expression profiles in physic nut （Jatropha curcas L.） seedlings exposed to salt stress[J].PLoS One，2014，9（5）：1-9.

[31] JALALI K，KANCHARLA N，YEPURI V，et al.Exploitation of Hi-C sequencing for improvement of genome assembly and in-vitro validation of differentially expressing genes in Jatropha curcas L.[J].3 Biotech，2020，10（5）：307-321.

[32] HANANO A，ALKARA M，ALMOUSALLY I，et al.The peroxygenase activity of the Aspergillus flavus caleosin，AfPXG，modulates the biosynthesis of aflatoxins and their trafficking and extracellular secretion via lipid droplets[J].Frontiers in microbiology，2018，9：1-19.

[33] SONG W L，QIN Y J，ZHU Y，et al.Delineation of plant caleosin residues critical for functional divergence，positive selection and coevolution[J].BMC evolutionary biology，2014，14（1）：1-14.

[34] SHEN Y，XIE J，LIU R D，et al.Genomic analysis and expression investigation of caleosin gene family in Arabidopsis[J].Biochemical and biophysical research communications，2014，448（4）：365-371.

[35] LAMBERTI C，NEBBIA S，BALESTRINI R，et al.Identification of a caleosin associated with hazelnut （Corylus avellana L.） oil bodies[J].Plant biology，2020，22（3）：404-409.0D9E048B-6BF5-4DF0-A58B-5397006E25A7