肉桂精油和肉桂醛的抑菌、抗氧化和酪氨酸酶抑制活性研究

路 露， 束成杰， 葛 翎， 潘潔塵， 朱 凱， 石寶俊*

(1.南京林業大學 化學工程學院，江蘇 南京 210037；2.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 211100；3.南京林業大學 江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心,江蘇 南京 210037)

精油是由芳香植物形成的具有強烈氣味的揮發性復合物。 目前已生產了大約3 000種精油，其中將近300種精油已用于保健、香料、化妝品、農業和食品工業[1-2]。肉桂為樟科樟屬植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干燥樹皮，又名玉桂、牡桂等，是世界上重要的香料和藥材之一[3]。肉桂中可以提取出豐富的肉桂油，其主要含肉桂醛等揮發性成分以及多糖、多酚、黃酮等非揮發性成分。近年來肉桂精油的生物活性研究備受關注。Chen等[4]研究發現，肉桂中的多酚類物質可對胰島素敏感性具有一定的影響；肉桂中黃酮類物質不僅可以延緩食物的變質，而且對自由基造成的損傷有抑制作用[5]。Ka等[6]發現肉桂醛能抑制癌細胞的增殖，同時還有報道肉桂醛具有抑菌[7-9]、抗氧化[10]和殺螨[11]的作用，而對于肉桂精油及其內在成分與生物活性構效關系的研究較少涉及。因此，本研究對比了肉桂精油及其主要成分肉桂醛的生物活性，以期為進一步開發肉桂在醫藥、食品、化妝品等行業的選擇應用奠定基礎。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

肉桂精油，購于廣西藤縣龍慶農業科技發展有限公司。肉桂醛(純度≥99%)、 2,2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉- 6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、 2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、丁基羥基茴香醚(BHA,純度98%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酪氨酸酶溶液、熊果苷(純度99%)，Sigma公司；左旋多巴(L-DOPA)溶液，Abcm公司；二甲基亞砜(DMSO,純度>99%)，分析純。大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa),南京野生植物資源綜合利用研究院提供。

LB培養基：胰蛋白胨1 g、酵母抽提物0.5 g、NaCl 1 g、瓊脂2 g、蒸餾水100 mL，121 ℃進行高壓滅菌20 min。YPD 培養基：酵母抽提物1 g、蛋白胨2 g、葡萄糖2 g、瓊脂2.5 g、蒸餾水100 mL，121 ℃進行高壓滅菌20 min。

氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用儀,安捷倫科技公司；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；SPX-150B-Z型生化培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；DZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海三申醫療器械有限公司。

1.2 肉桂精油GC-MS成分分析

色譜條件為：DB-5MS色譜柱，初溫80 ℃，保留時間為5 min，以5 ℃/min升溫至200 ℃，并保留5 min。進樣口溫度為250 ℃，FID檢測器溫度為280 ℃；以氦氣為載氣，進樣量為1μL。

質譜條件為：EI離子源230 ℃，四級桿150 ℃，電子能量70 eV，全程掃描。

1.3 抑菌試驗

1.3.1濾紙片試驗 參考文獻[12]的方法，稍作改動。100 μL的菌液均勻涂布在培養基表面，無菌鑷子夾取已滅菌的6 mm濾紙片放在對應培養基上。取10 μL樣品打在濾紙片上，丙酮作為對照，靜置10 min。放置培養箱中37 ℃培養24 h，每組做3個平行，用游標卡尺測量其抑菌圈直徑。

1.3.2最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定 根據Tu等[13]所使用的方法稍加修改。用丙酮配制0.04～10 g/L的肉桂精油和肉桂醛溶液，取1 mL液體培養基加入150 μL不同濃度的肉桂精油或肉桂醛溶液，同時加入500 μL菌液(2×108CFU/mL)，各試管在37 ℃，180 r/min搖床培養24 h。澄清無菌生長的最低濃度即為MIC；取澄清試管液體50 μL均勻涂布于對應固體培養基上，37 ℃培養24 h，無可見細菌生長即為MBC。每個試驗重復3次。

1.4 抗氧化活性測試

1.4.1ABTS自由基清除能力 按照參考文獻[14]的方法進行測定。在波長734 nm下測量樣品的吸光度(A1)，對照組(無水乙醇)的吸光度(A0)，BHA作陽性對照。重復3次實驗取平均值，ABTS自由基(ABTS+·)清除率(YABTS+·)按式(1)計算:

(1)

1.4.2總抗氧化能力 按照參考文獻[15]的方法進行總抗氧化能力實驗。在波長593 nm處測定吸光度，繪制標準曲線(FeSO4濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標)，Y=0.002 4X-0.013 8(R2=0.999 5)。通過FeSO4標準曲線，得到對應的鐵離子還原/抗氧化能力(FRAP)值。

1.5 抑制酪氨酸酶活性測試

將肉桂精油和肉桂醛溶于PBS，稀釋成不同質量濃度溶液，根據文獻[16]稍加修改，如表1所示向試管中分別加入肉桂精油或肉桂醛、PBS和酪氨酸酶溶液(100 U/mL)，混合均勻，置于37 ℃水浴中反應10 min，分別迅速加入1 mLL-DOPA 溶液(1.5 mmol/L)，混合均勻，置于37 ℃水浴中反應5 min，在475 nm處測定吸光度(A)，各反應組吸光度分別記作A1、A2、A3和A4，熊果苷為陽性對照。按照式(2)計算酪氨酸酶的抑制率(R):

表1 各反應液組成Table 1 Composition of each reaction solution

(2)

2 結果與分析

2.1 肉桂精油GC-MS成分分析

采用GC-MS對肉桂精油化學組成進行分析，結果如表2所示，肉桂精油的主要成分為86.07%肉桂醛和6.25%的2’-甲氧基肉桂醛。

表2 肉桂精油的化學組分Table 2 Chemical groups of Cinnamon essential oil

2.2 肉桂精油和肉桂醛的抑菌活性

2.2.1麥氏比濁法測定菌液濃度 根據試劑盒說明書在430 nm處測定吸光度，繪制標準曲線，公式為y=0.085 3x-0.01，R2=0.998 7。根據吸光度配制濃度為2×108CFU/mL菌液。

2.2.2MIC和MBC測定結果 由表3可知，肉桂精油和肉桂醛對真菌和細菌表現出不同的敏感性，MIC在0.08～1.25 g/L之間。肉桂精油對白色念珠菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌的MBC值分別為0.62、 2.5、 10、 5和5 g/L，而肉桂醛對以上5種菌的MBC值分別為0.31、 5、 5、 5和2.5 g/L?？梢钥闯?，二者對真菌的抑制效果最佳，MIC分別為0.31和0.08 g/L，MBC分別為0.62 和0.31 g/L。大量研究[17-19]發現肉桂精油對真菌的抑菌作用強于細菌，與本研究的結果一致。通過對比無菌生長的肉桂醛和肉桂精油的MIC和MBC值，肉桂醛對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和綠膿桿菌的抑菌效果優于肉桂精油，而肉桂精油對大腸桿菌的抑菌效果更好。Joris[20]研究發現肉桂精油中的甲氧基肉桂醛對大腸桿菌有很強的抑制作用，而本研究使用的肉桂精油有6.25%的2’-甲氧基肉桂醛。因此肉桂精油對大腸桿菌的抑制作用更強。

表3 肉桂精油和肉桂醛的最小抑菌濃度1)Table 3 Minimum inhibitory concentration of cinnamon essential oil and cinnamaldehyde

2.2.3濾紙片法結果 由表4可知，肉桂精油和肉桂醛抑制白色念珠菌的效果亦是最佳，金黃色葡萄球菌次之。當質量濃度為40 g/L時，肉桂醛對白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為(23.25±0.12)mm和(13.42±0.28)mm，而肉桂精油對2種菌種的抑菌直徑為(18.46±0.26)mm和(11.58±0.51)mm。由此可知,肉桂醛對白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果優于肉桂精油。

表4 肉桂精油和肉桂醛對供試菌種的抑菌圈直徑Table 4 The inhibition zone diameters of cinnamon essential oil and cinnamaldehyde mm

2.3 肉桂精油和肉桂醛的抗氧化活性

2.3.1ABTS+·清除能力 圖1為不同質量濃度肉桂精油、肉桂醛，以及BHA對ABTS+·的清除率變化曲線。由圖1可知，肉桂醛對ABTS+·的清除率隨質量濃度變化不大，在選擇的質量濃度范圍內清除率只保持在25%左右；而肉桂精油對ABTS+·的清除率隨著質量濃度的增加而增大，具有正相關性。當質量濃度為16 g/L時，肉桂精油對ABTS+·的清除率達到94.1%，是相同質量濃度肉桂醛的3倍，與4 mg/L BHA清除效果相當。

圖1 肉桂精油、肉桂醛和BHA對ABTS+·的清除率 圖2 肉桂精油和肉桂醛總抗氧化能力Fig.1 Scavenging rate of ABTS+of cinnamon essential oil,cinnamaldehyde and BHA Fig.2 Fe3+ reduction ability of cinnamon essential oil and cinnamaldehyde

2.3.2總抗氧化能力測定 肉桂精油和肉桂醛的總抗氧化能力測定結果見圖2。由圖可知，肉桂醛的總抗氧化能力隨質量濃度變化不大，而肉桂精油的總抗氧化能力隨著質量濃度的增加而增大。

16 g/L肉桂醛的總抗氧化能力與258.6 μmol/L FeSO4相當；16 g/L肉桂精油的總抗氧化能力與1 502 μmol/L FeSO4相當,是肉桂醛的5.8倍。由此可知，肉桂精油的抗氧化活性優于肉桂醛。這可能是由于含石竹烯的肉桂精油各抗氧化成分之間存在協同增效作用[21]。

2.4 肉桂精油和肉桂醛的抑制酪氨酸酶活性

眾所周知，酪氨酸酶的活性與黑色素的生產量有關[22]。由表5可知，肉桂精油和肉桂醛對酪氨酸酶抑制率隨著質量濃度的增加而提高，其中40 g/L的肉桂精油對酪氨酸酶抑制率為83.61%，而相同濃度肉桂醛對酪氨酸酶抑制率達87.34%，分別為同濃度陽性對照熊果苷的1.36和1.42倍。肉桂精油和熊果苷對酪氨酸酶的半數抑制質量濃度(IC50)為4.02 和19.80 g/L，而肉桂醛對酪氨酸酶的IC50小于1.25 g/L。由此可知，二者均對酪氨酸酶具有良好的抑制作用，而肉桂醛的抑制作用強于肉桂精油。

表5 肉桂精油和肉桂醛對酪氨酸酶的抑制效果Table 5 The inhibitory effect of cinnamon essential oil and cinnamaldehyde on tyrosinase

3 結 論

3.1通過濾紙片法、MIC和MBC對比肉桂精油和肉桂醛的抑菌活性，結果顯示：二者對真菌的抑制效果均強于細菌；肉桂醛對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和綠膿桿菌的抑制效果優于肉桂精油，二者對枯草芽孢桿菌的抑制效果相近，而肉桂精油對大腸桿菌的抑菌效果優于肉桂醛。

3.2當質量濃度為16 g/L時，肉桂精油的ABTS+·清除率為94.1%，是相同濃度肉桂醛的3倍；FRAP值為1 502 μmol/L，是相同濃度肉桂醛的5.8倍。肉桂精油的抗氧化活性優于肉桂醛。

3.3肉桂精油對酪氨酸酶的半數抑制質量濃度(IC50)為4.02 g/L，而肉桂醛對酪氨酸酶的IC50小于1.25 g/L。由此可知，相對于肉桂精油，肉桂醛具有更好的酪氨酸酶抑制效果。