斜紋夜蛾取食Cry1Ca蛋白后中腸組織病理變化

姚 雪，劉 臣，段云鵬，魏紀珍*，梁革梅

（1.河南農業大學植物保護學院，鄭州 450002；2.中國農業科學院植物保護研究所/植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

轉一種蘇云金芽胞桿菌（Bacillusthuringiensis，Bt）蛋白或多種Bt蛋白的作物不但有效地控制了害蟲的暴發，也帶來了極大的經濟效益和環境效益[1-4]。因此，到2019年，Bt作物已經在全球29個國家被批準種植，其年種植面積也超過了1.904億hm2[5]。然而，大面積的種植Bt作物，也使得昆蟲在巨大的選擇壓力下，抗性水平顯著增加，甚至威脅到轉Bt作物的種植和Bt的長期使用[6]。

目前，延緩抗性的一個重要策略是多基因策略，即在作物中表達多個不同作用靶標的抗蟲Bt基因[7]。目前應用最廣的是在作物中同時表達Cry1A和Cry2A用于防治棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)等重要農業害蟲。Cry1Ca也是Cry1家族的Bt蛋白，前期的研究表明Cry1C特異性受體與Cry1A類沒有或存在較低的競爭結合[8-10]。并且Cry1Ca能用于防治對Cry1A類蛋白產生抗性的害蟲[11-13]。除此之外，Cry1Ca蛋白對鱗翅目害蟲的殺蟲活性與其他Bt蛋白存在明顯差異，該蛋白應用到轉多Bt基因作物中能在很大程度上擴大殺蟲譜[14]。事實上，Cry1Ca已被嘗試轉入到作物中用于防治害蟲和延緩抗性[15-18]。

轉Cry1A蛋白的棉花有效地遏制了棉鈴蟲的猖獗，但是其他鱗翅目害蟲，如甜菜夜蛾Spodopteraexigua和斜紋夜蛾Spodopteralitura等仍然不能被有效控制。其中，斜紋夜蛾是一種為害嚴重的，世界性的農業害蟲，它寄主植物廣泛，生殖力強，而且具有很強的遷飛習性，給農業生產帶來了巨大的危害[19]。目前對斜紋夜蛾的防治主要是化學防治，長期化學農藥的使用，已使斜紋夜蛾對傳統的化學殺蟲劑產生了很高的抗性，包括有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農藥；甚至對一些新型殺蟲劑如多殺菌素、吲哚沙卡、氯蟲腈和阿維菌素等也產生了抗性[20-25]。我們的前期研究表明，Cry1Ca 對斜紋夜蛾具有很好的防治效果[14]，然而目前Cry1Ca 在斜紋夜蛾中的毒理作用和作用機制還缺乏相應的研究。

昆蟲幼蟲取食 Bt蛋白后會對中腸組織造成嚴重的損傷，如亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis和粘蟲Mythimnaseparata取食Cry1F蛋白后，中腸細胞微絨毛腫脹、脫落；細胞核變形，質膜和核膜界限不清晰；染色質發生固縮、貼近核膜；線粒體拉伸變形、數量減少，嚴重的發生空泡化；內質網腫脹與斷裂、數量減少[26]。本研究通過斜紋夜蛾幼蟲取食Cry1Ca蛋白、解剖其中腸制備組織切片、通過透射電鏡觀察斜紋夜蛾取食Cry1Ca不同時間后中腸細胞組織的生理病變過程，為進一步研究Cry1Ca殺蟲蛋白的作用機理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源和Cry1Ca蛋白

斜紋夜蛾采集于湖北省武漢市，之后在實驗室人工氣候箱內用人工飼料飼喂，溫度為（26±1）℃、相對濕度為（60±10）%、光周期為16L:8D。

Cry1Ca毒蛋白由中國農業科學院植物保護研究所抗蟲生物技術組饋贈，純化濃縮后的蛋白圖譜見文獻[14]。

1.2 中腸組織取樣

將4齡斜紋夜蛾幼蟲接于24孔養蟲盒內，饑餓處理24 h，對照轉移到正常的飼料上飼養，試驗組轉移到含0.44 μg/g（該劑量為初孵幼蟲LC95的濃度）的Cry1Ca蛋白飼料上飼養，取食2 h、6 h、12 h、24 h和36 h后分別解剖幼蟲中腸，對照和Cry1Ca處理各24頭，重復3次。

1.3 中腸組織超薄切片制作和電鏡觀察

采用雙固定法制備玻片。解剖后的中腸先用3%戊二醛前固定，后用1%鋨酸對中腸樣品進行后固定。經過0.1 mol/L的磷酸緩沖液脫水、置換、滲透、包埋、聚合、超薄切片、切片染色后，具體玻片的制備參考文章[27,28]。利用日產Hitachi-500透射電子顯微鏡，80 kV加速電壓下拍照觀察。

2 結果與分析

2.1 斜紋夜蛾中腸杯狀細胞微絨毛變化

斜紋夜蛾中腸正常的杯狀細胞微絨毛排列密致整齊，數量眾多（圖1A）；取食Cry1Ca 2 h后，杯狀細胞微絨毛出現嚴重脫落（圖1B），6 h后，杯狀細胞微絨毛明顯發生腫脹和扭曲（圖1C）；12～36 h，微絨毛變形、斷裂和脫落情況逐步加?。▓D1D，1E，1F），36 h時杯狀細胞的微絨毛幾乎脫落完畢（圖1F）。

圖1 取食含Cry1Ca蛋白的人工飼料不同時間后斜紋夜蛾中腸組織中杯狀細胞變化Fig.1 Histopahtological changes of S.litura midgut goblet cells after feeding on artificial diets incorporated with Cry1Ca toxins

2.2 斜紋夜蛾中腸柱狀細胞微絨毛變化

斜紋夜蛾中腸正常的柱狀細胞的微絨毛細長、排列整齊，數量眾多（圖2A）；取食Cry1Ca 2 h后，柱狀細胞的微絨毛數量開始變少，斷裂情況嚴重（圖2B）；6 h后，微絨毛已經基本被全部破壞（圖2C），柱狀細胞微絨毛也明顯表現出腫脹和扭曲（圖2D，2F）；隨時間延長，脫落情況進一步加劇，到24和36 h時完全脫落（圖2E，2F）。

圖2 取食含Cry1Ca蛋白的人工飼料不同時間后斜紋夜蛾中腸組織中柱狀細胞變化Fig.2 Histopahtological changes of S.litura midgut columnar cells after feeding on artificial diets incorporated with Cry1Ca toxin

2.3 斜紋夜蛾中腸細胞細胞核變化

斜紋夜蛾中腸細胞正常的細胞核是圓形的、飽滿、圓潤、核膜完整、邊界清晰可見，染色質分布均勻（圖3A）；取食Cry1Ca 2 h后，細胞核略有變形，呈現橢圓形（圖3B）；6 h 后，細胞核變形加劇，圓潤的細胞核呈現皺縮，染色質聚集一側（圖3C）；12 h和24 h后，細胞核繼續變形或畸形（圖3D，3E），染色質進一步聚集；36 h時，核膜破壞，邊界模糊，細胞質流出（圖3F）。

圖3 取食含Cry1Ca蛋白的人工飼料不同時間后斜紋夜蛾中腸組織中細胞核變化Fig.3 Histopahtological changes of S.litura midgut cell nucleus after feeding on artificial diets incorporated with Cry1Ca toxin

2.4 斜紋夜蛾中腸細胞線粒體變化

斜紋夜蛾中腸細胞正常的線粒體為橢圓形或紡錘形，內脊清晰（圖4A）；取食Cry1Ca 2 h后，線粒體內脊開始模糊（圖4B）；6 h后，線粒體內脊更加模糊、變形、發生空泡化（圖4C）；12 h、24 h和36 h后，細胞線粒體繼續拉長變形，空泡化加劇，數量減少（圖4D，4E，4F）。

圖4 取食含Cry1Ca蛋白的人工飼料不同時間后斜紋夜蛾中腸組織中細胞線粒體變化Fig.4 Histopahtological changes of S.litura midgut mitochondria after feeding on artificial diets incorporated with Cry1Ca toxin

2.5 斜紋夜蛾中腸細胞內質網變化

斜紋夜蛾中腸細胞正常的內質網發達，呈線狀整齊排布于細胞質中（圖5A）；取食Cry1Ca 2 h后，內質網排列逐漸雜亂無章、腫脹變形，隨時間的推移病狀加??；密集的內質網在6 h后開始變得稀疏，24 h和36 h后基本完全消解（圖5B～5F）。

圖5 取食含Cry1Ca蛋白的人工飼料不同時間后斜紋夜蛾中腸組織中內質網變化Fig.5 Histopahtological changes of S.litura midgut endoplasmic reticulum after feeding on artificial diets incorporated with Cry1Ca toxin

3 討論

通過不同時間點取樣觀察斜紋夜蛾取食Cry1Ca后的中腸組織病變情況，我們發現中腸組織的病變情況與取食其他Bt蛋白后的癥狀類似[14,27-30]，都會出現中腸細胞微絨毛的腫脹、扭曲、斷裂和脫落（圖1，2），細胞核會出現拉長或畸形、核膜模糊、染色質不均勻和聚集（圖3），線粒體變形、發生空泡化、內脊模糊不清并隨時間推移癥狀加重（圖4）；內質網變得雜亂無章、腫脹變形和數量減少（圖5）。在中腸組織中，昆蟲中腸柱狀細胞的質膜的充分折疊大大增加了細胞吸收和分泌的面積，進而達到對營養物質充分消化吸收的目的；杯狀細胞具有調節血淋巴和腸腔中K+和H+平衡的作用。分析Bt的作用模型表明昆蟲取食Cry1類蛋白后，在中腸堿性環境中Bt原蛋白被蛋白酶活化成為65 kDa左右有殺蟲活性的活化片段，這些活化的Bt片段與中腸受體結合，經過構象變化，插入于中腸上皮細胞膜內，進而形成細胞孔洞，導致細胞膨脹，滲透壓失衡，最終造成昆蟲死亡[31]，這些中腸病變可能是與受體的結合或者穿孔作用引起的。本研究結果說明，Cry1Ca與其他Bt蛋白引起的中腸病變過程相似，推測其與其他Bt蛋白在中腸內的生理作用機制類似。

然而，不同Bt蛋白作用靶標害蟲后，造成中腸病理變化的時間具有差異，Cry1Ac（0.5 μg/g）作用2 h后，棉鈴蟲中腸已發生明顯的病理變化，且隨著時間推后，影響越劇烈；Vip3Aa（50 μg/g）對棉鈴蟲的作用則較慢，在取食12 h后才可以觀察到有明顯的組織病理變化[28]，盡管Vip3Aa的濃度高于Cry1Ac濃度的100倍，但是Cry1Ac的作用速度要更快，這一結果與Cry1Ac對棉鈴蟲的毒力高于Vip3Aa對棉鈴蟲毒力是一致的[14,32]。類似的，使用較低濃度的Cry1Ac（0.97 μg/g）對棉鈴蟲的作用速度快于較高濃度的 Cry2Ab（8 μg/g）對棉鈴蟲的作用速度[28]，這與Cry1Ac對棉鈴蟲的毒力高于Cry2Ab對棉鈴蟲的毒力也是一致的[33]。這些結果表明病變速率的快慢一方面跟劑量有關，但是更多地反映出毒力的高低。4齡亞洲玉米螟和粘蟲取食Cry1F蛋白（初孵幼蟲LC90的劑量）48 h后中腸組織發生明顯的病變[26]。本研究中，斜紋夜蛾4齡幼蟲取食Cry1Ca（初孵幼蟲LC95的濃度）后2 h中腸各組織就開始出現病理變化，這與Cry1Ca對斜紋夜蛾較高的殺蟲活性一致[14]。斜紋夜蛾目前是農業生產上的重要害蟲，對棉花、玉米、大豆、多種蔬菜等造成嚴重為害[19]。前期報道的Cry1Ca特異性受體與Cry1A不存在競爭結合[8-10]，Cry1Ca能用于防治對Cry1A類蛋白產生抗性的害蟲[11-13]。這里我們發現Cry1Ca作用于斜紋夜蛾的中腸組織在2 h就能有明顯的病變暗示著其較高的毒力效果，綜上研究表明Cry1Ca是多基因策略轉基因作物的重要潛力殺蟲蛋白。

然而，在其他農業害蟲中的研究報道結果表明，對Cry1C產生抗性的小菜蛾品系對Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F和Cry1J也產生了抗性[34]，對Cry1Ab產生了抗性的甜菜夜蛾品系同時對Cry1Ca 也產生了抗性[35]。同時，甜菜夜蛾的鈣黏蛋白被鑒定為Cry1Ca和Cry1Ac的共同受體[36-38]。這些研究給我們也提出了預警，對于Cry1Ca在斜紋夜蛾中的受體和作用機理需要進行深入的研究，以便于制定合理有效的抗性治理措施。

致謝：試驗得到中國農業科學院原子能研究所郝宏京老師和王瑩老師的幫助，特此表示感謝!