珍珠龍膽石斑魚豆粕誘導型腸炎腸道潛在生物標志物篩選

張 衛，譚北平，龐奧博，鄧君明，楊奇慧，張海濤

（1.廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088；2.農業部南方水產與畜禽飼料重點實驗室，廣東 湛江 524074）

魚粉（FM）價格上漲迫使尋找新的替代物，大豆制品產量高且氨基酸組成較平衡，是目前應用最廣的植物型替代蛋白源。但飼料中添加高劑量豆粕（SBM）易引起魚類腸炎反應[1]，這與其含有大豆抗原蛋白、蛋白酶抑制劑、植酸鹽、皂苷、凝集素、植物甾醇和低聚糖等抗營養因子有關[2]。目前，關于SBM 誘導的魚類腸炎（SBMIE）確切原因和機制尚不完全清楚，對于腸炎形成的分子機制仍缺乏系統研究。醇溶性抗營養因子，尤其是大豆皂苷極可能是主要的潛在致病因素[3]。但大豆皂苷直接作用復雜。單獨喂食或與玉米面筋、向日葵、菜籽或蠶豆蛋白聯用時，未見或幾乎無炎癥，然而大豆皂苷與豌豆蛋白合用時，組織學和轉錄水平發生了顯著變化[4]。皂苷引起的腸炎有劑量依賴性，較高含量的皂苷（2～4 g/kg）可引起大西洋鮭（Salmo salar）腸炎，與基礎飼料蛋白源種類無關[3]。此外，低水平皂苷似對一些魚類生長還有促進作用，可能與皂素佐劑特性的免疫促進作用有關[5]。豆粕引發的腸炎也可能是大豆皂苷膜干擾特性的次要作用[6]。新的組學技術對研究魚類營養與免疫間復雜關系有巨大潛力[7]。

珍珠龍膽石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂）是典型的海水肉食性魚類，有生長快、市場價值高、抗病性強等優點，在養殖過程中也發現SBM 引起的腸道黏膜受損及腸炎癥狀[1]。本研究對珍珠龍膽石斑魚腸道組織進行非靶向代謝組學分析，以篩選與飼料SBM 模式相關的差異代謝物，從綜合性視角在SBM 飼料替代魚粉模式下，篩選SBM 誘導的腸炎候選生物標志物，為魚類腸道健康研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

實驗飼料組成見表1。分別配制3 種等氮（粗蛋白質量分數約50%）和等脂（粗脂肪質量分數約10%）的實驗飼料（20 kJ/g），以相應的SBM 蛋白替代質量分數0%、20%和40%的FM 蛋白，分別命名為FM（對照組）、SBM20 和SBM40。在實驗飼料中加入賴氨酸和蛋氨酸進行氨基酸配平。飼料原料磨成細粉，過250 μm 篩，并根據配方準確稱量。用造粒機制備粒徑為2.0、3.0 mm 的顆粒飼料，陰涼處風干，分裝，在-20℃儲存備用。飼料中必需氨基酸含量（四川威爾檢測技術股份有限公司檢測）見表2。

表1 飼料配方和基本組成質量分數 (干物質)Table 1 Formulation and proximate composition of experimental diets (dry matter) %

表2 飼料中17 種必需氨基酸質量分數Table 2 Mass fraction of 17 amino acids in diets %

1.2 實驗過程

平均體質量約9 g 的健康石斑魚幼魚購自湛江市。在實驗條件馴養1 周，喂食商品飼料。實驗前停飼24 h，用丁香酚（體積分數0.01%）麻醉，分組。規格相似幼魚隨機分配至1 000 L 圓柱形玻璃鋼桶中，每桶60 尾，每組4 個重復。每日8:00、16:00投喂至表觀飽腹水平，實驗周期10 周。實驗過程中記錄飼料消耗。室內靜水養殖，所有養殖桶用氣石連續充氣，自然光照，溫度（29 ± 1）℃，氨和硝酸鹽低于0.03 mg·L-1，溶解氧不少于7 mg·L-1。前2周每天每桶換水量為60%；后期每桶每天換水量約100%，為減少魚的應激，用保證魚自由游動的最低水位流水式換水，待水足夠清澈時加至原有水位。

1.3 樣品收集

養殖實驗結束時，停飼24 h，統計石斑魚數量和體質量。每桶隨機取魚6 尾，取血清，置-80 ℃，以分析血清酶活力；取后腸和肝臟，清除腸系膜和脂肪組織，置液氮中，取樣后移至-80 ℃以備酶活性分析；部分腸道組織剪碎，置于裝有RNAlater的試管，置4 ℃下12 h，移至-80 ℃用于基因表達測定。

在最后攝食時間點前對實驗魚腸道組織進行代謝組學取樣。剖取腸道，輕輕擠出糞便，用去離子水沖洗干凈。每處理組取12 個樣本（同一桶3尾魚腸道組織等量為一個樣本）。樣品置凍存管，液氮速凍后，移至 -80 ℃以備代謝組學分析。

1.4 生長生理指標

1.4.1 生長性能 選用增重率（Weight gain rate，WGR，%）、特定生長率（Specific growth rate，SGR，%/d）、肝體指數（Hepatosomatic index，HIS，%）和存活率（Survival rate，SR，%）作為生長性能指標，計算公式：

式中，m0，初始體質量；mt，終末體質量，t試驗時間，d。

1.4.2 腸道免疫基因表達 用 Trizol 試劑盒（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）參照說明書提取腸道組織總RNA。取質量合格的RNA 樣品，用Evo M-MLV 反轉錄試劑盒（Takara,Japan）制備cDNA，于-20 ℃下保存待用。用Primer Premier 5.0 設計il1β、il12、tnfα促炎相關基因和il10、igm、cd4抗炎相關基因的引物（表3）[8]，內參為β-actin。通過實時熒光定量PCR 檢測基因表達量。所用引物模板均來自廣東海洋大學水產動物營養與飼料實驗室珍珠龍膽石斑魚2 代和3 代全長轉錄組測序結果，原始數據的NCBI 登錄號分別是PRJNA664623、PRJNA66441。

表3 珍珠龍膽石斑魚腸道免疫相關基因PCR 引物Table 3 PCR primers for intestinal immune related genes of grouper

1.4.3 組織切片及炎癥指標分析 每缸隨機取魚3尾，剖取適宜長度后腸，置于體積分數4%多聚甲醛通用組織固定劑（武漢塞維爾生物技術有限公司，武漢，中國）中24 h，制作H&E 切片。根據半定量方法，對H&E 染色切片進行光學顯微鏡隨機盲評，后腸SBM 誘導型腸炎程度評價方法見文獻[9]。

1.5 代謝組學分析

1.5.1 代謝物提取及UPLC-MS 分析 腸道樣品經液氮充分研磨，用預冷的體積分數80%甲醇和體積分數0.1%甲酸再懸浮。冰上孵育5 min，于15 000 r/min、4 ℃條件下離心5 min。部分上清液用LC-MS級水稀釋至甲醇體積分數60%。將樣品移至有0.22 μm 過濾器的新鮮Eppendorf 管，于15 000g、4 ℃條件下離心10 min。將濾液注入LC-MS/MS 系統。

1.5.2 質量控制 為控制樣本質量，在樣品處理的同時制備質量控制（QC）樣品。QC 樣品是實驗樣品的等份混合樣品，用于平衡色譜-質譜系統，監測系統性能，并在整個實驗過程中評價系統穩定性。QC 樣本相關性越高（越接近1），整個方法穩定性越佳。在PCA 分析圖中反映的是QC 樣品的分布聚集在一起[10]。同時建立空白樣品去除背景離子。

1.5.3 數據處理和代謝物鑒定 用Compound Discoverer 3.0（CD 3.0,Thermo Fisher）處理UPLC-MS/MS的原始數據，對每種代謝物進行峰對齊、峰提取和定量。主要參數：保留時間耐受性為0.1 min，實際質量公差為5×10-6，信號強度公差為30%，信噪比為3，最低強度為100 000。將峰值強度歸一化為總光譜強度。利用歸一化數據根據添加劑離子、分子離子峰和碎片離子預測分子式。將峰值與數據庫進行比對，以獲得準確的定性和相對定量結果。將所選數據導入EZinfo 軟件用于主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLS-DA）。統計分析前對數據進行Pareto 標度處理，用PCA 分析評價數據集的可靠性（包括QC 樣本），并提供所有樣本可視化總體分離結果。為更好區分不同群體，建立PLS-DA模型。此外，為避免PLS-DA 模型過度擬合，用SIMCA-P+14.0 軟件（Umetrics AB,Umea,Sweden）對200 個隨機排列進行7 次交叉循環檢驗。用PLS-DA 模型變量在投影中的重要性（VIP）值和t檢驗的P值尋找差異代謝產物。VIP 值反映每個變量對模型的貢獻。VIP 值較大則可區分對照組和實驗組主要潛在生物標志物。VIP >1，P<0.05，對數值差異倍數（Fold change，FC）≥2 或FC≤0.5 的代謝產物視為差異性代謝物[11]。

1.5.4 差異代謝物分析 用火山圖篩選代謝物的log2(FC) 和-lgP，用z-Score 圖展示同一水平代謝物的相對含量，用cor.mtest() 函數計算不同代謝物間協同或互斥關系，顯著相關的閾值水平為P<0.05。

1.6 統計分析

統計分析用SPSS 22.0 進行，結果以平均±標準差表示。為檢驗各組間的差異，同質方差檢驗后進行單因素方法分析。顯著性閾值為P<0.05。對代謝物進行受試者工作特征曲線（ROC）分析以確定曲線下面積（AUC），比較代謝物預測能力。

2 結果

2.1 生長性能

與對照組相比，隨著SBM 替代水平的增加，各實驗組增重率和特定生長率依次顯著降低（P<0.05）；各組肝體比和存活率無顯著變化（P>0.05）（表4）。

表4 不同水平豆粕蛋白替代魚粉蛋白對珍珠龍膽石斑魚生長的影響Table 4 Effects of different levels of soybean meal protein substitute for fish meal protein on growth of pearl gentian grouper

2.2 免疫相關基因表達

表5 顯示，與對照組相比，隨著替代水平的增加，各實驗組促炎相關基因il1β、il12、tnfα表達量總體上呈顯著增加趨勢（P<0.05），SBM40 組表達量最高；隨著替代水平的增加，與對照組相比，抗炎相關基因il10、igm、cd4表達量呈顯著下降趨勢（P<0.05），SBM40 組表達量最低。

表5 豆粕替代魚粉蛋白對珍珠龍膽石斑魚后腸免疫相關基因表達的影響Table 5 Effects of soybean meal protein substitute for fish meal protein on immune related gene expression in hindgut of pearl gentian grouper

2.3 組織切片和炎性指標

組織切片和半定量分析表明，與對照組相比，不同替代水平的SBM 均引起珍珠龍膽石斑魚后腸炎癥反應，有顯著差異（P<0.05）。其中SBM40組炎癥最嚴重，SBM20 組次之，有較明顯的炎癥表征，如腸道黏膜皺襞縮短、固有膜腫脹及各種炎性細胞浸潤等（圖1 和表6），說明本研究SBM 替代水平誘發了珍珠龍膽石斑魚的腸炎癥狀。

表6 腸道切片半定量組織學腸炎評估得分Table 6 Semi-quantitative histological evaluation of intestinal sections

圖1 珍珠龍膽石斑魚后腸Fig.1 Hindgut of pearl gentian grouper

2.4 腸道組織UPLC-MS 代謝譜分析

2.4.1 UPLC-MS 代謝譜分析 腸道組織的代謝譜圖如圖2。圖3 展示LC-MS 正負離子兩種模式下腸道組織樣本的PCA 得分。QC 樣本位于中心，聚類緊密，表明數據質量好，模型穩定可靠。圖4 展示QC 樣本的相關性。

圖2 正、負離子模式下后腸組織的典型UPLC-MS 光譜Fig.2 Representative UPLC-MS spectra of the distal intestine tissues in positive and negative modes

圖3 正、負離子模式下后腸總樣本主成分分析(PCA)Fig.3 Total sample PCA score plots resulting from UPLC-MS spectra of distal intenstine in positive and negative modes

圖4 正離子和負離子模式下后腸組織質控樣品相關性Fig.4 Correlation of QC samples of distal intestine tissues in positive and negative modes

圖5 展示正、負離子模式下腸道組織差異代謝物PLS-DA 模型的結果。兩組間分離清晰，各組樣本基本在95%置信橢圓內。用正、負兩種離子模式進行置換檢驗，以防止模型過度擬合 (圖6)。FM 和SBM20 組的置換檢驗R2Y 和Q2Y 參數在正離子模式中為分別0.73和0.67，在負離子模式中分別為0.61和0.73；FM 和SBM40 組的置換檢驗R2Y 和Q2Y參數在正離子模式中為分別0.67 和0.62，在負離子模式中分別為0.57 和0.65。其值均大于0.5，左邊的紅線(Q2Y)和藍線(R2Y)比右邊起始點低，表明這些模型過擬合風險低。

圖5 正離子(A,C)和負離子(B,D)模式下后腸組織總樣本PLS-DA 評分Fig.5 Total sample PLS-DA score resulting from the UPLC-MS spectra of distal intestine tissues in positive (A,C) and negative modes (B,D)

圖6 正離子（A,C）和負離子（B,D）模式下后腸組織PLS-DA模型置換檢驗Fig.6 Permutation test result of the PLS-DA models of distal intestine tissues in the positive (A,C) and negative (B,D) modes

2.4.2 差異代謝物分析 差異代謝物的PLS-DA 得分圖（圖5）顯示，FM 組與SBM20 組和SBM40 組之間可明顯分離，且未過擬合。與FM 對照組相比，正離子和負離子模式下，SBM20 組和SBM40 組中，從腸道組織中各鑒定2 260 種差異代謝物(正離子模式1 404 種，負離子模式856 種)。所鑒定物質的保留時間、質/荷比（m/z）和碎片模式與標準物質比較，正離子模式下，SBM20 組差異代謝物中有53 種代謝物顯著上調，120 種代謝物顯著下調（圖7）；SBM40 組差異代謝物中有69 種代謝物顯著上調，293 種代謝物顯著下調。同時，負離子模式下，SBM20組差異代謝物中有52 種代謝物顯著上調，77 種代謝物顯著下調；SBM40 組差異代謝物中有46 種代謝物顯著上調，190 種代謝物顯著下調。

圖7 正離子（A,C）、負（B,D）離子模式下組間P 值火山圖Fig.7 Volcano plot of P values between FM,SBM20 and SBM40 groups in positive (A,C) and negative (B,D) modes

2.4.3 潛在生物標志物篩選 根據VIP >1，|log2(FC)| >1，P<0.05，在正離子模式下，在SBM20 組中，篩選的前10 種可區分FM 和SBM20 組最有影響差異代謝物分別為染料木素、大豆黃酮、染料木素-4'-O葡萄糖醛酸酯、癸二酸、雞黃豆素、2-O-乙基抗壞血酸、檸檬苦素、吲哚-3-丙烯酰甘氨酸、2-苯基-1,4-二羥基萘和白三烯B4 二甲胺；在SBM40 組中，篩選的前10 種可區分FM 和SBM40 組最有影響差異代謝物分別為2-氨基-3,4-二甲基咪唑（4,5-F）喹啉、檸檬苦素、吲哚-3-丙烯酰甘氨酸、N-甲基蒽酰胺、N,N-二甲基甲氧基噻吩、染料木素、染料木素-4’-O 葡萄糖醛酸酯、白三烯B4 二甲胺、大豆黃酮和5-羥基吲哚-3-乙酸。

在負離子模式下，在SBM20 組中，篩選的前10種可區分FM和SBM20組最有影響差異代謝物分別為染料木素、維生素C、雞黃豆素、黃芩苷、大豆黃酮、葡萄糖二酸、大豆皂苷Ⅰ、苜蓿酸3-O-三葡萄糖苷、小肽（Leu-Gly-Pro）和戊基-4-羥脯氨酸；在SBM40組中，篩選的前10 種可區分FM 和SBM40組的最有影響差異代謝物分別為維生素C、染料木素、葡萄糖二酸、大豆黃酮、黃芩苷、小肽、戊基-4-羥脯氨酸、大豆皂苷Ⅰ、雞黃豆素和磷酸肌酸。SBM20 組替代水平下，正負離子模式下的20 種潛在腸炎標志物中，有3 種是共有的；SBM40 組替代水平下，正負離子模式下的20 種潛在腸炎標志物中，有2 種是共有的。因此，SBM20 和SBM40 組分別選出17 種和18 種代謝物作為珍珠龍膽石斑魚腸道組織豆粕誘導型腸炎（SBMIE）的潛在生物標志物。

為進一步明確潛在生物標志物特征，圖8 展示差異代謝物正負離子模式下的z-得分（z-score）。表7 展示正、負離子模式下，SBM20 組潛在腸炎標志物的離子強度；表8 展示正、負離子模式下，SBM40組潛在腸炎標志物的離子強度。與FM 組對比，SBM20 組癸二酸、檸檬苦素、吲哚-3-丙烯酰甘氨酸、小肽Leu-Gly-Pro、戊基-4-羥脯氨酸和磷酸肌酸離子強度顯著降低（P<0.05），而其他12 種代謝物的強度顯著增加（P<0.05）；SBM40 組2-氨基-3,4-二甲基咪唑（4,5-F）喹啉、檸檬苦素、吲哚-3-丙烯酰甘氨酸、N-甲基蒽酰胺、N,N-二甲基甲氧基噻吩、小肽Leu-Gly-Pro、戊基-4-羥脯氨酸和磷酸肌酸的離子強度顯著下降（P<0.05），其他10 種代謝物強度顯間內，代謝物AUC 均超過0.9（圖9），表明對潛在生物標志物預測能力較佳。

圖8 正離子（A,C）和負離子（B,D）模式下FM 與SBM20、SBM40 組間潛在生物標記物的z-Score 評分Fig.8 z-Score plot of potential biomarkers for comparison between FM and SBM20 and SBM40 in positive and negative modes

表7 SBM20 組正負離子模式下腸炎潛在標志物的離子強度Table 7 Intensities of metabolites identified as the potential biomarkers of SBM20 vs.FM in positive and negative modes

表8 SBM40 組正負離子模式下腸炎潛在標志物的離子強度Table 8 Intensities of metabolites identified as the potential biomarkers of SBM20 vs FM in positive and negative modes

2.4.4 潛在生物標志物篩選 圖9 表明，SBM20 組中，正離子模式下，檸檬苦素、吲哚-3-丙烯酰甘氨酸與染料木素-4'-O 葡萄糖醛酸酯、2-O-乙基抗壞血酸、2-苯基-1,4-二羥基萘、白三烯B4 二甲胺呈顯著負相關；吲哚-3-丙烯酰甘氨酸與大豆黃酮呈顯著負相關，白三烯B4 二甲胺與癸二酸呈顯著負相關。其他潛在腸炎生物標志物間呈顯著正相關；負離子模式下，小肽（Leu-Gly-Pro）和戊基-4-羥脯氨酸與其他標志物大部分呈顯著負相關。正、負離子模式中，其他生物標志物間呈顯著正相關（空白處除外）。

圖9 正離子（A,C）和負離子（B,D）模式下組間潛在生物標志物的ROC 分析Fig.9 ROC analysis of potential biomarker metabolites between groups and FM in positive (A,C) and negative (B,D) modes

SBM40 組中，正離子模式下，染料木素-4′-O葡萄糖醛酸酯、白三烯B4 二甲胺、5-羥基吲哚-3-乙酸與2-氨基-3,4-二甲基咪唑（4,5-F）喹啉、檸檬苦素、吲哚-3-丙烯酰甘氨酸、N,N-二甲基甲氧基噻吩呈顯著負相關；此外，檸檬苦素還大豆黃酮呈顯著負相關。負離子模式下，除戊基-4-羥脯氨酸和磷酸肌酸外，小肽（Leu-Gly-Pro）與其他其中標志物呈顯著負相關。戊基-4-羥脯氨酸與維生素C、染料木素、葡萄糖二酸、黃芩苷、大豆皂苷Ⅰ呈顯著負相關。磷酸肌酸與維生素C、葡萄糖二酸、大豆皂苷Ⅰ呈顯著負相關。正離子和負離子模式中，其他生物標志物間呈顯著正相關（空白處除外）。

對比不同SBM 蛋白替代水平腸炎潛在生物標志，發現SBM20 組和SBM40 組有13 種標志物較為保守，稱之為核心生物標志物（表9）。除核心生物標志物外，SBM20 組特有的標志物包括癸二酸、2-O-乙基抗壞血酸、2-苯基-1,4-二羥基萘和苜蓿酸3-O-三葡萄糖苷；SBM40 組特有的標志物包括磷酸肌酸、5-羥基吲哚-3-乙酸、N，N-二甲基甲氧基噻吩、N-甲基蒽酰胺、2-氨基-3,4-二甲基咪唑（4,5-F）喹啉。

表9 不同替代水平腸道組織腸炎潛在生物標志物對比Table 9 Comparison of potential biomarkers of enteritis in intestinal tissues at different substitute levels

3 討論

SBMIE 在水產養殖中普遍存在，對魚類生長和飼料利用有明顯的負面影響，如顯著降低養殖對象的增重率、特定生長率，增加飼料系數等。SBMIE為非感染性亞急性腸炎，其組織學特征主要表現為黏膜褶皺縮短，固有膜和黏膜下層腫脹，各種炎性細胞浸潤，腸上皮細胞吸收，空泡減少[12]。腸炎主要發生在后腸部分，后腸是依靠胞吞作用吸收蛋白質的主要部位，這種特殊的吸收方式，導致對各種外源抗原的接觸更加密切，因此更易誘發食物感染引起的腸道疾病[13]。本研究發現，實驗水平的SBM引起了珍珠龍膽石斑魚腸炎的產生，生長性能和腸道生理結構的變化也證實這一結果。

本研究中，珍珠龍膽石斑魚后腸組織代謝表型在FM 組和實驗組之間表現出顯著的模式差異。在PLS-DA 評分圖中，FM 組與SBM20、SBM40 組明顯分離，表明飼料中SBM 的添加引起了后腸組織代謝譜變化，SBMIE 在代謝水平上有一定差異表征。

VIP 值反映變量的重要性，在代謝組學中常用來篩選潛在的生物標志物[14]。本研究中，在SBM20和SBM40 替代水平下，分別根據VIP 值篩選到17和18 種代謝產物作為珍珠龍膽腸道組織SBMIE 的潛在生物標志物，其中有13 種為保守的核心生物標志物。與FM 組相比，SBM 替代FM 后腸道組織中異黃酮和皂苷等明顯增加。

異黃酮在結構上與天然雌激素相似，在動物體內有類似雌激素的生物學效應[15]。SBM 富含植物雌激素（稱為異黃酮）。目前，普遍認為大豆異黃酮主要由12 種化合物組成，可分為游離型苷元和結合型糖苷兩種類型。游離型苷元主要包括染料木素、大豆苷元和大豆黃素；結合型糖苷主要包括染料木苷、大豆苷、丙二酰染料木苷和丙二酰大豆苷等。本研究的13 種潛在核心生物標志物中，有5 種屬于黃酮類化合物，包括染料木素、大豆黃酮、染料木素-4′-O-葡萄糖醛酸酯、雞黃豆素和黃芩苷。大豆異黃酮也被稱為生長促進劑，用于家禽養殖以提高產量。然而，大豆異黃酮對魚類生長性能、飼料利用和免疫反應的影響是有爭議的，可能與其類型、用量及實驗對象性別等有關[16-17]。當大豆異黃酮在飼料中添加量（質量分數）達到 0.8%時，牙鲆（Paralichthys olivaceus）后腸完整性受到損害；SBM中大豆異黃酮質量分數為0.10%～0.35%，當大豆異黃酮添加量不超過 0.4% 時，對異育銀鯽（Allogynogentic silver crucian carp）和牙鲆的生長和腸道生理幾乎無負面影響[18-19]。然而，當SBM 以原料形式整體添加以取代FM 時，大豆異黃酮的負面影響不能被排除，因為飼料中的抗營養因子之間可能存在協同作用，如本研究圖10 顯示，大豆皂苷與其他抗營養因子之間存在這種現象。

圖10 正離子（A,C）和負離子（B,D）模式下組間潛在生物標志物相關性分析Fig.10 Correlation analysis of the potential biomarkers between groups and FM in positive (A,C) and negative (B,D) modes

在水產養殖中，大豆皂苷是一種研究較為廣泛的抗營養因子。本研究中，二替代組中大豆皂苷I含量均顯著增加。SBM 的皂苷質量分數為5～7 g/kg[20]。在大西洋鮭中，大豆皂苷是引起腸炎的主要抗營養因子[21]。但是，大豆皂苷引起腸炎的直接作用是復雜的，不同抗營養因子間的協同或拮抗作用亦較為重要[3]。Zhang 等[19]發現，雖然用SBM 代替FM 飼喂異育銀鯽的負面效應可能與大豆異黃酮無關，但大豆皂苷與大豆異黃酮之間存在協同效應。本研究中，不同潛在生物標志物與腸炎之間的關系有待進一步研究。

13 種潛在核心生物標志物中剩余7 種分別是檸檬苦素、吲哚-3-丙烯酰甘氨酸、白三烯B4 二甲胺、維生素C、葡萄糖二酸、小肽Leu-Gly-Pro 和戊基-4-羥脯氨酸。檸檬苦素是一類三萜類化合物，有抗炎、抑菌、抗氧化、解毒和生物除蟲等多種生物活性[22]，在治療潰瘍性結腸炎方面有顯著的療效[23]。吲哚類化合物有抗炎、抗癌、抗菌、抗病毒、清除自由基和保護神經等作用[24]。吲哚-3-丙烯酰甘氨酸可能是色氨酸生物合成過程中的代謝中間體，由色氨酸經吲哚丙酸和吲哚乙酸合成。Bull 等[25]研究發現，吲哚-3-丙烯酰甘氨酸可作為診斷自閉癥譜系障礙的尿液標記物。白三烯B4 是一種與炎性反應有關的白三烯類物質。受病原感染后，組織釋放的白三烯B4 可提高巨噬細胞和中性粒細胞對病原菌的吞噬和殺傷功能，并促進其釋放抗菌性活性介導物[26]。但相關研究也指出，過量的白三烯B4 合成與釋放，可能會導致各種炎性疾病，如支氣管哮喘和關節炎等[27]。小肽有多種生物學功能，如保護腸道結構和功能、促進蛋白質的吸收利用、改善動物的生長性能、提高動物免疫性能及抗氧化作用等。體外實驗發現，沙丁魚肌肉水解小肽（如Val-Tyr、Ile-Tyr、Tyr-Val、Trp-His）可誘導收縮主動脈的松弛，用以預防動脈粥樣硬化[28]。也發現Ile-Arg-Trp、Ile-Gln-Trp（蛋），Val-Pro-Pro、Ile-Pro-Pro、Leu-Pro-Pro（發酵豆粕）、Val-Pro-Tyr（豆粕）等食物來源的小肽有抗炎、降壓、降糖和改善腎功能等作用[29]。羥脯氨酸在FM 中含量豐富，而在植物原料中含量極少甚至幾乎不存在。以往研究指出，羥脯氨酸除可改善魚類生長性能外，還有清除氧化劑、調控細胞凋亡的作用，且游離的羥脯氨酸可下調炎性基因的表達[30]。本研究發現，SBM 替代FM 后，檸檬苦素、吲哚-3-丙烯酰甘氨酸、白三烯B4 二甲酸、小肽Leu-Gly-Pro 和戊基-4-羥脯氨酸的含量顯著降低，提示這些物質的缺乏與腸炎的發生有密切關系。維生素C 是魚類必需的水溶性維生素，不僅影響生長和飼料利用，還有免疫調節作用，是與水生動物免疫、鐵代謝和血液學相關的營養素之一[31]。維生素C 對魚類免疫有有益影響，如溶菌酶及補體活性、吞噬活性、抗糖化、呼吸爆發和黏膜免疫反應等[32]。葡萄糖二酸是一種無毒的葡萄糖衍生物，通常以手性化合物D-葡萄糖二酸的形式存在。葡萄糖二酸天然存在于櫻桃、柑橘和豆類等水果和蔬菜中，少量哺乳動物和人體內也有分泌[33]。葡萄糖二酸在水產養殖中的應用鮮有報道，在哺乳動物中發現，與葡萄糖二酸可相互轉化的葡萄糖-1,4-內酯有很強的解毒和抗氧化能力，還可緩解腸道黏膜損傷[34]。尿液中葡萄糖二酸在人類藥物性肝炎診斷和鑒別中也視為一種標志物[35]。本研究中，SBM 替代FM 后，維生素C 和葡萄糖二酸的含量顯著升高，提示腸炎狀態下，魚類可能通過增加某些物質的含量緩解腸道損傷或炎癥。

不同替代水平下，珍珠龍膽腸道組織中篩選的潛在生物標志物中，SBM20 組特有的是癸二酸、2-O-乙基抗壞血酸、2-苯基-1,4-二羥基萘和苜蓿酸3-O-三葡萄糖苷，SBM40 組特有的是磷酸肌酸、5-羥基吲哚-3-乙酸、N,N-二甲基甲氧基噻吩、N-甲基蒽酰胺和2-氨基-3,4-二甲基咪唑（4,5-F）喹啉。通過本研究，可將此類物質作為判定珍珠龍膽石斑魚SBMIE 程度的標志性物質。但在魚類SBM 誘導的腸炎研究中，對這些代謝物與腸炎關系鮮有報道。從本研究結果看，雖然這些潛在腸炎標志物之間相關性較高，但在實際生理過程中，其對腸炎的作用是獨立的、協同的還是拮抗的，尚不完全清楚，仍有待于進一步研究。

4 結論

基于代謝組學分析，本研究在20%和40%SBM替代水平下，從珍珠龍膽腸道組織中分別篩選到17和18 種SBMIE 的潛在生物標志物；有13 種較為保守的核心生物標志物為兩實驗組共有，反映了珍珠龍膽石斑魚SBMIE 的典型表征；兩組分別特有的潛在腸炎標志物可作為腸炎嚴重程度的判定依據。不同替代水平下，大部分生物標志物間存在顯著的正相關或負相關作用，但其與腸炎之間的關系和作用機制仍需進一步實驗驗證。