桂蠶H9黃繭絲素肽的提取工藝及其護手霜的功效品質評價

肖瀟，陸春霞，劉開莉，徐雯雯，莫炳巧，唐永飛，梁貴秋

（廣西壯族自治區蠶業技術推廣站，南寧市 530007）

蠶絲作為一種天然的動物蛋白纖維，長久以來憑借其極佳的光澤和質感成為高檔紡織面料。近年來國內外學者就蠶絲蛋白的物理以及化學特性在生物醫學、光學、電子、傳感、食品、化工領域的應用都展開了一定的研究，并取得了較好的進展［1］。隨著現代蛋白組學技術的進步，研究者發現蠶絲蛋白的多種生物活性（如抗菌性、抗氧化性、抑制細胞衰老等），不僅和獨特的結構與組成有關，也受包裹的蠶絲多種功能酶類、活性肽類影響［2］。在蠶絲蛋白護膚品的研發上，應更注重保護蠶絲蛋白的生物活性，采用溫和、安全無殘留、經濟簡便的蠶絲蛋白提取方法。

在不同的脫膠、溶解體系中，蠶絲蛋白的分子量、結構等都存在差異［3］。由于國內外很多學者已經對脫膠工藝參數和熟絲的微觀表征、力學性能都進行了探索，本文就多篇文獻中絲素蛋白分子量、絲素纖維結構與性能、脫膠程度等綜合考慮［4-6］，選擇幾種脫膠效果較好、絲素蛋白損傷少且無毒副物質殘留的脫膠、溶解方法。絲素蛋白的分子量大小、結構性能也與溶解體系有關［7-9］，不同極性的鹽類對絲素蛋白分子力的破壞不同，使之溶解速率有差異，溶解的蛋白分子量有差異［10］。

天然彩色蠶繭由于富含葉黃素、胡蘿卜素、類黃酮而呈黃色、綠色等［11］，其抗氧化活性、抗菌性等高于白色繭［12-13］，但成本略高，因此本研究將其一同比較絲素肽的護膚性能?？紤]到成本、有毒試劑殘留的問題，采用酶法制備絲素肽，不僅生產成本低、條件溫和、安全性高，還能將內部的活性肽釋放出來［14-15］，更好地保護了原料相關的護膚特性。近幾年國內外關于絲素肽的提取主要針對生物材料的制作，鮮少與護膚相關，且蠶絲蛋白應用于化妝品類的文獻和專利都比較陳舊，因此需要整合出一套新的化妝品用絲素肽提取方法。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與試劑

白色削口繭殼來自桂蠶5號家蠶品種，黃色削口繭殼來自桂蠶H9家蠶品種，由廣西壯族自治區蠶業技術推廣站提供。無水氯化鈣、無水乙醇、碳酸氫鈉、溴化鋰等試劑為分析純；碳酸二辛脂、乳木果油、丙二醇等化妝品級試劑購于廣州寶隆國際化妝品原料貿易有限公司；透析袋14 kDa 購于上海生工生物工程股份有限公司，堿性蛋白酶（20 萬U/g）、木瓜蛋白酶（10萬U/g）購于南京斯拜科實業有限公司；羥自由基測試試劑盒、蛋白定量（TP）測試盒購于南京建成生物科技有限公司。鐵離子還原能力測試試劑盒、超氧陰離子測試試劑盒購于上?；菡\生物科技有限公司。

1.2 試驗儀器

HH-2 型恒溫水浴鍋購于金壇市富瑞儀器有限公司；AXTD4 臺式低速自動平衡離心機購于上海趙迪生物科技有限公司；FS3520 真空抽濾裝置購于上海研豐電子科技有限公司；Multiskan FC酶標儀購于美國Thermo賽默飛世爾科技有限公司；DHG-9030A電熱鼓風干燥箱購于上海一恒科學儀器有限公司；CM3600A臺式色差儀購于日本KONICA MINOLTA；TA1 質構儀購于英國勞埃德；R-3001 電動升降旋轉蒸發儀購于鄭州長城科工貿有限公司。

1.3 絲素肽溶液的制備方法

1.3.1 蠶繭的脫膠處理 稱取黃繭殼和白繭殼各10 g，如表1 所示，分別于4 個脫膠條件下進行脫膠。并將絲素于鼓風干燥箱中40 ℃烘干，稱取重量，計算脫膠率，重復3次取平均值。

表1 蠶繭的不同脫膠條件

1.3.2 用色差計計算絲素色彩品質 打開色差計附帶的PCQC 色彩品質控制軟件，進行黑盒零位校正、反射率校正后，開始測試。標準品為樣品：蒸餾水相同處理的熟絲。色度用Lab色度系統表示，計算綜合色差值，重復3次取平均值。

式中，△a為樣品的紅綠色度與標準品的紅綠色度之差；

△b為樣品的黃藍色度與標準品的黃藍色度之差；

△L為樣品的明亮度與標準品的明亮度之差。

1.3.3 絲素的溶解方法 將經過以上條件脫膠后的絲素剪成2 cm×2 cm大小的碎片。分別置于如表2所示的溶解條件中。

表2 蠶繭絲素的不同溶解條件

1.3.4 絲素溶解情況的觀察 將溶解液搖均勻后取3滴于蓋玻片上，用偏光顯微鏡觀察不同溶解條件下的樣品組絲素溶解情況。記錄絲素溶解情況，評價標準如表3所示。

表3 絲素的溶解情況評價表

1.3.5 絲素肽溶液的制備 經過溶解處理所得的蠶絲蛋白溶液經紗布過濾雜質，注入截留分子量為14 kDa的透析袋中，再于4 ℃的去離子水中透析3 d，期間第1 d 時每0.5 d 更換一次去離子水，剩余2 d 隔天更換1 次去離子水。將透析袋埋于葡聚糖G-100中，于4 ℃進行濃縮2 h。

將濃縮后的溶液經過4 000 rpm 離心5 min。取上清液加入底物質量0.3%的復合酶（堿性蛋白酶∶木瓜蛋白酶的質量比為3∶1），75 ℃酶解40 min 至溶液呈淡黃色、澄清透明，再將酶解液煮沸5 min 滅活。將酶解液注入截留分子量為2 kDa 的透析袋中透析3 d 除鹽。再經過0.45 u 真空微孔膜抽濾除雜即得小分子絲素肽溶液。溶液再經過12 000 rpm 離心5 min 取上清液，最后經121 ℃高溫高壓滅菌20 min后即可使用。

1.3.6 絲素肽溶液含肽量的檢測 試驗方法為雙縮脲法，參考蛋白定量（TP）測試盒的說明書，用酶標儀讀取540 nm處吸光值。實驗用的蛋白標準液濃度為56.3 g/L。計算公式為：

1.4 絲素肽溶液護膚特性的檢測方法

1.4.1 絲素肽溶液吸濕性、保濕性的檢測 吸濕性試驗：設置梯度稀釋度的絲素肽溶液：稀釋倍數1、2、3、4、5，對照組為按1∶1 質量比配制的甘油—水溶液。將樣品各稱量10 g，放在相同的表面皿中，置于培養箱中，設置溫度27 ℃、濕度96%，放置12 h，記錄質量變化m。

保濕性試驗：量取1 mL、5 mL、10 mL、15 mL、20 mL絲素肽溶液加蒸餾水至50 mL，置于相同表面皿中，記錄初始樣品質量A0。將樣品放于40℃電熱鼓風干燥箱，間隔4 h、8 h、12 h后稱量樣品質量A。

1.4.2 絲素肽抗紫外線能力的檢測 取適量的白繭、黃繭絲素肽溶液，于酶標儀記錄在280～400 nm區間可見光的吸光值，空白組為純水。

1.4.3 絲素肽活性成分的檢測 將樣品委托給廣西分析測試中心檢測總黃酮、總酚項目，檢測方法依照GB/T8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》、SN/T4592—2016《出口食品中總黃酮的測定》。

1.4.4 絲素肽溶液抗氧化性的檢測 經預實驗得到，當白繭絲素肽溶液稀釋300 倍、黃繭絲素肽溶液稀釋200倍作為樣品原液，所得的抑制率在梯度濃度下有明顯的線性變化規律。因此用上述樣品進行以下抗氧化性檢測試驗。

超氧陰離子O2抑制率試驗：參考NBT 方法試劑盒說明書，對照組為去離子水。

DPPH 自由基清除力試驗：方法試劑盒說明書，對照組為不添加DPPH試劑的體系，空白組為不添加樣品的體系。

總還原能力測試試驗：方法為FRAP 法，參照試劑盒說明書。標準物為1 mg/mL 的維生素C。樣品總還原能力以相同OD值的維生素C的濃度來表示。

1.4.5 絲素肽美白性的檢測 方法依照標準T/SHRH 015—2018《化妝品—酪氨酸酶活性抑制實驗方法。

1.5 蠶絲蛋白護手霜的制作方法與理化性質

1.5.1 蠶絲蛋白護手霜的制作 依照表4基料的配方添加，先配油相、乳化劑基料，于75 ℃攪拌融化；再配制水相基料，加熱至70 ℃至充分后溶解混合上述油相基料，于75 ℃攪拌乳化2 h；待自然冷卻后加入黃原膠，均質后使之充分溶解，過夜放置使之自然增稠。分別加入防腐劑、法國305 乳化劑（聚丙烯酰胺—聚氧乙烯醚）后勻質30 min即可。

表4 100 g蠶絲蛋白護手霜配方

續表4

1.5.2 蠶絲蛋白護手霜延展性的檢測 打開質構儀配套的軟件，選擇涂布實驗模式，設置起始力0.05 N，檢測速度60 nm/min，擠壓距離3 nm，回程速度60 nm/min，回程距離30 nm。探頭對樣品接觸面積為10 cm2。記錄樣品的最大擠壓力做功值、最大粘附力做功值，試驗重復3次。

1.5.3 蠶絲蛋白護手霜安全衛生指標的檢測 將樣品委托給廣西分析測試中心檢測重金屬（鉛、汞、砷、鎘）、微生物（菌落總數、霉菌、酵母菌）、有機殘留物（甲醛）項目。根據《化妝品安全技術規范》2015版的規范要求進行判定。

2 結果與分析

2.1 蠶繭的脫膠和溶解情況

如表5所示，黃色蠶繭經過不同的脫膠方法處理后，脫膠率從高到低依次為2 組＞3 組＞4 組＞1 組；色差變化上各組間差異不大，處理后黃繭的顏色變淡且暗淡。而白繭脫膠率從高到低依次為2組＞4組＞3組＞1組，色差變化各組間差異大，處理后白繭顏色變黃、暗淡無光，顏色變化較多的為3 組和4 組。以脫膠率高且色差變化小為優。綜合得出2 組0.2 M Na2CO3處理的脫膠率均較高，且色差小，絲素蛋白損失較少，為最優組。

表5 不同脫膠方法下的熟絲脫膠率和色度值

不同品種的蠶繭絲膠蛋白含量不同，通常桑蠶絲膠含量在20%～30%［16］，但不同脫膠方法造成絲素纖維不同程度的破壞，部分絲素蛋白溶出而造成脫膠率較高。

這4種方法中，脫膠溶液顏色最淺的為高溫高壓組，WANG F 等［17］研究后認為高溫蒸汽只能破壞絲素纖維外層的絲膠，不能有效去除附著在絲素纖維上的內層絲膠蛋白。有研究指出，相對于其他方法，堿法沸水浴對絲素纖維的力學性能、微觀結構影響更為明顯，隨著水浴時間的延長，絲素晶體抗拉強度減小，溶解后絲素肽分子量更小，且30 min內可實現完全脫膠［18-19］。Dou 等［20］經研究得出無論Na2CO3的濃度如何，絲素蛋白的二級結構不受影響，脫膠時只有非重復、無定形區域和N-、C-端結構遭破壞。

由表6得出，評分高于等于50分的有白繭A1、B3組，黃繭A1、B1、B3、B4、C3、C4組。白繭肽濃度最高的為B3組0.5 mgprot/mL，黃繭肽濃度最高的為B3組0.6 mgprot/mL。在絲素溶解試驗中，發現黃繭溶解得更快，溶解程度更充分，且溶解液的顏色更深，絲素肽含量更高。王林［21］對不同顏色繭絲有研究解釋：天然黃色蠶絲的內部孔隙較多，雖然分子結構、構象方式與白色繭絲相似，但結晶度偏小，更易溶解。兩種蠶繭均在A1、B3組中絲素溶解效果較好，但考慮到工業高溫高壓的成本和耗時，B3組略優于A1組。

表6 不同溶解方法下的絲素溶解程度評分和肽濃度

續表6

綜上所述，經過0.2 M Na2CO3脫膠和CaCl2-C2H5OH-H2O 體系溶解所得的絲素肽較適合作為化妝品原材料。

2.2 絲素肽溶液的護膚特性檢測結果

2.2.1 絲素肽保濕性和抗紫外性能檢測結果 由圖1所示，白繭和黃繭的絲素肽均有一定吸濕能力且隨著稀釋倍數增加而減小，但均低于對照組的甘油水溶液。由于脫膠后吸水性更強的絲膠蛋白被去除，而絲膠蛋白中的極性氨基酸占75%［22］，因此試驗獲得的絲素肽吸濕效果不明顯。

圖1 兩種繭絲素肽的吸濕能力

由圖2所示，兩種顏色的蠶繭絲素肽配制成梯度質量分數的溶液后，失水率隨著質量分數的增大而減少，且隨著時間的延長，失水趨勢漸陡。則提取的絲素肽具有一定保濕性，兩種顏色繭殼的絲素肽保濕性能相近。

圖2 兩種繭的絲素肽失水情況

而對人皮膚造成曬黑、曬傷、促老化的主要為UVA（316～400 nm）、UVB（280～315 nm），因此本研究檢測絲素肽對波長在280～400 nm 區間內的紫外光的吸收能力，如圖3 所示。對比空白組，兩種蠶繭的絲素肽溶液均對紫外光有吸收，具有抗紫外性。在紫外波長280～300 nm 內白繭的抗紫外性略強于黃繭，在紫外波長200～400 nm 內卻相反，這可能于黃繭所含的著色物質有關。

圖3 兩種絲素肽的抗紫外線檢測

2.2.2 絲素肽活性成分、抗氧化性能檢測結果 如表7 所示，兩種繭色絲素肽的黃酮含量均低于檢出限，活性成分物質主要為酚類物質。天然黃色繭的呈色物質主要有葉黃素、類胡蘿卜素、黃酮類組成，主要分布在絲膠，且從繭殼外層至內層逐步變淡［23］。研究證實，天然黃色蠶繭中黃酮含量占0.9 mg/g［24］，但在脫膠后，由于黃繭大部分的呈色物質溶于脫膠液中，絲素肽溶液中含量很少［25］。

表7 兩種繭的絲素肽活性成分含量 mg/100 g

由圖4可以看出，黃繭的絲素肽超氧陰離子抑制率略強于白繭絲素肽。超氧陰離子抑制率隨著稀釋程度增加而降低。抑制率最高均為99.33%。

圖4 兩種繭的絲素肽超氧陰離子抑制率情況

超氧陰離子是生物體內主要氧自由基，是導致細胞衰老的主要原因。而用NBT法測試超氧陰離子清除能力是應用于化妝品的主要抗氧化性評價方法。但由于不同體外檢測方法反應的抗氧化能力不同，各有優缺點，因此本研究用3 種抗氧化活性檢測方法綜合評價。

由圖5 可以看出，黃繭絲素肽在較高濃度時DPPH 清除率高于白繭，在稀釋度大于50 倍后反之。DPPH 清除率隨著稀釋程度增加而降低。黃繭最高清除率為36.02%，白繭32.32%。DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）本身是一種穩定的固體自由基，對所有的還原劑都有作用，包括黃酮、酚類，用于綜合評價絲素肽的抗氧化活性。

圖5 兩種繭的絲素肽DPPH清除率情況

將圖6 中白繭絲素肽和黃繭絲素肽原液的OD值帶入圖7標準曲線中，得白繭絲素肽總還原能力相當于2 187.92 μg/mL的維生素C標準物，黃繭絲素肽總還原能力相當于1 517.53 μg/mL 的維生素C 標準物；參考試劑盒說明書，若以1 mg/mL 的維生素C 標準物為1個Fe3+總還原能力度量單位，則白繭絲素肽總還原能力為2.19 mg/mL，黃繭絲素肽總還原能力為1.52 mg/mL?？傻冒桌O絲素肽總還原能力高于黃繭絲素肽。

圖6 兩種繭的絲素肽總還原能力情況

圖7 維生素C總還原能力測試標準曲線

綜上所述兩種繭色絲素肽抗氧化能力大致相同，且隨著原液的稀釋度增加，其OD值減小，抗氧化能力減弱。由此可得，就獲取化妝品級的絲素肽原料而言，優選白色家蠶繭，更廉價易得；若為了獲取化妝品級的絲膠肽原料，優選天然黃色家蠶繭，其活性成分更高，護膚性能更好。

2.2.3 絲素肽美白性能檢測結果 由圖8 可得，黃繭絲素肽抑制酪氨酸酶能力整體略強于白繭。在樣品稀釋倍數為50 時，兩種繭的絲素肽酪氨酸酶抑制率均最高，其中白繭為44.14%，黃繭為54.16%。由圖9 可得β—熊果苷隨著濃度增加其酪氨酸酶抑制率呈曲線上升。將濃度和抑制率建立變量，用SPSS進行Probit 分析可求出IC50為7.288 μg/mL。而絲素肽IC50在25～30 μg/mL，因此得提取得絲素肽美白性均高于β—熊果苷。

圖8 兩種繭的絲素肽酪氨酸酶抑制情況

圖9 β-熊果苷抑制酪氨酸酶標準曲線

抑制酪氨酸酶的活性與絲素肽氨基酸攜帶的-OH 基團有關，趙山［26］經研究發現絲素低聚肽是通過抑制酪氨酸酶活性來抑制黑色素生成的，對細胞活性、基因相關表達影響很小，推測可能是-OH與二價金屬離子發生絡合反應而影響酪氨酸酶的活性。

2.3 蠶絲蛋白護手霜的延展性和衛生指標

添加梯度絲素肽溶液制備的蠶絲蛋白護手霜，得到膏霜涂抹性如圖10 所示。膏霜的稠度越大，內聚力越強，探頭下壓做的功則越大。經儀器測試值可以看出添加2%、3%、4%的絲素肽溶液對于護手霜的稠度幾乎沒有影響，且兩種顏色的蠶繭絲素肽所制備的護手霜稠度相似。膏霜的粘性越大，粘附力做功越多，越難推開。圖中隨著絲素肽溶液的添加量增加，兩種蠶絲蛋白護手霜的粘附力增加，推測原因可能為大量的絲素肽與卡波、法國305 乳化劑（聚丙烯酰胺—聚氧乙烯醚）這類大分子交聯劑發生乳化、增稠作用。由于在受試者涂抹護手霜的試用體驗中，4%添加量的蠶絲蛋白護手霜明顯難推開，且涂后殘留的油脂膜吸收慢，有搓泥現象，因此試驗優選3%的絲素肽添加質量分數。

圖10 兩種絲素肽制備的護手霜延展性能

如表8 所示，經過分析測試中心的檢測得出，此方法制作的蠶絲蛋白護手霜的衛生指標均在檢出限內，安全無毒害。

3 結論和討論

綜上所述，天然黃繭、白色家蠶繭經過0.2 M Na2CO3脫膠和CaCl2-C2H5OH-H2O 體系溶解所得的絲素肽較適合作為化妝品基料，其中白繭肽濃度最高為0.5 mgprot/mL，黃繭肽濃度最高的為0.6 mgprot/mL。提取的絲素肽具有一定保濕性、抗紫外線、美白性，酪氨酸酶抑制率白繭為44.1%，黃繭為54.2%。兩種繭絲素肽溶液所含的黃酮成分極少，總酚含量相近，約100～111 mg/100g。兩種繭絲素肽均具有抗氧化性，其中超氧陰離子清除力抑制率相近，約99.1%～99.3%；黃繭DPPH清除率為36.0%，白繭32.3%；白繭絲素肽總還原能力為2.2 mg/mL，黃繭為1.5 mg/mL。

絲素蛋白結構組成、力學性能與其提取方法關系密切，例如利用靜電紡絲制備的納米纖維絲素肽可作為皮膚組織工程材料［27］、通過離子交聯誘導得到絲素—黃原膠凝膠可作為填充假體、藥物緩釋載體［28］，因此為了獲取特定功能的絲素肽需要在制備方法上深入研究。受新冠疫情的影響和民族美妝品牌的崛起，消費者對于本土的天然生物活性成分護膚產品的追捧度越來越高，而這些與傳統相關且科技含量高的有效成分也是各大化妝品品牌商的著力推銷點。中國作為繭絲生產大國，在蠶絲蛋白的綜合利用方面具有豐富的資源優勢和深入研發的空間。在今后絲素肽用于護膚品的研發方向，一方面可以改進提取方法，利用輔助手段和精簡流程得到純度更高、分子量更小、生物活性更高的絲素肽；另一方面是分離提取出發揮功效的絲素寡肽，研究二級結構、作用機理、序列等，以期通過化學合成制備絲素寡肽，節省制備成本。