尼莫地平調控IRS-1對人腦血管外膜成纖維細胞活力和凋亡的影響①

袁 崗 肖宗宇 李文輝 曹立新 惠超杰 （青海大學附屬醫院神經外科，西寧 810001）

血管外膜成纖維細胞是組成血管外膜的主要成分，抑制血管外膜成纖維細胞增殖及促進其凋亡對防治心血管疾病具有重要作用［1-3］。IFN-α可促進血管內皮細胞凋亡［4］。目前關于人腦血管外膜成纖維細胞增殖及凋亡的分子機制尚未完全闡明，因而探究其分子機制及積極探尋心腦血管增殖性疾病的治療藥物具有重要意義。研究表明尼莫地平可抑制谷氨酸誘導的神經細胞增殖［5］。胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）表達上調可能改善人腦血管內皮細胞功能及促進細胞增殖［6］。但尼莫地平是否可通過調控IRS-1 的表達從而影響人腦血管外膜成纖維細胞活力及凋亡尚未可知。因此，本研究主要探討尼莫地平對人腦血管外膜成纖維細胞活力、凋亡的影響及其對IRS-1 的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人腦血管外膜成纖維細胞購自美國ScienCell公司。

1.1.2 藥品與試劑 尼莫地平，含量/規格：50 ml/10 mg，生產批號：J20140105，購自拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司；IFN-α 購自北京三元基因工程有限公司；DMEM、胎牛血清購自美國Gibco 公司；MTT、DMSO 購自上海碧云天生物技術有限公司；凋亡試劑盒購自美國Sigma公司；Lipofectamine2000與Trizol 購自美國Invitrogen 公司；反轉錄與實時熒光定量PCR 試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；si-IRS-1、si-con購自上海吉瑪制藥技術有限公司；兔抗人p21、CyclinD1 抗體購自美國CST 公司；兔抗人Bax、Cleaved caspase-3、Bcl-2 抗 體 購 自 美 國Santa Cruz 公司；兔抗人IRS-1 抗體購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.1.3 儀器 7500 型ABI 熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司；FACSCalibur 流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 NC 組：正常培養的人腦血管外膜成纖維細胞；IFN-α 組：用2×106U/L IFN-α 培養人腦血管外膜成纖維細胞；共同處理組：人腦血管外膜成纖維細胞分為IFN-α+Nimo 50 μg/ml組、IFN-α+Nimo 100 μg/ml 組、IFN-α+Nimo 200 μg/ml 組，其中IFN-α 濃度為2×106U/L［7］，尼莫地平濃度分別為50、100、200 μg/ml［8］。后續研究將人腦血管外膜成纖維細胞分為IFN-α+pcDNA 組、IFN-α+pcDNA-IRS-1組、IFN-α+Nimo+si-con組、IFN-α+Nimo+si-IRS-1組，其中尼莫地平濃度為200 μg/ml，IFN-α 濃度為2×106U/L。

1.2.2 MTT 檢測細胞活力［9］收集各組對數生長期人腦血管外膜成纖維細胞接種至96 孔板（5×103個/孔），分別于轉染24 h、48 h、72 h 時加入MTT 試劑（20 μl/孔），繼續培養4 h，棄上清，加入DMSO（150 μl/孔），檢測各孔在波長490 nm 處的相對吸光度（OD）值。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率［10］收集各組對數生長期人腦血管外膜成纖維細胞，預冷PBS 洗滌，4 ℃、3 000 r/min 離心6 min，棄上清，加入500 μl結合緩沖液重懸細胞，按照凋亡試劑盒說明書檢測各組細胞凋亡率。

1.2.4 qRT-PCR 檢測細胞中IRS-1 mRNA 的表達水平［11］采用Trizol法提取各組細胞總RNA。根據反轉錄試劑盒說明書操作將總RNA反轉錄合成cDNA。以cDNA 為模板進行qRT-PCR 反應，參照試劑盒說明書計算IRS-1 mRNA的表達水平。

1.2.5 Western blot 檢測IRS-1、p21、Bax、Cleaved caspase-3、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達［12］提取各組細胞總蛋白，SDS-PAGE 分離蛋白，轉膜，封閉2 h，孵育（IRS-1 稀釋比1∶800、p21 稀釋比1∶1 000、Bax 稀釋比1∶1 000、Cleaved caspase-3 稀釋比1∶1 000、CyclinD1 稀釋比1∶800、Bcl-2 稀釋比1∶800）一抗稀釋液，孵育IgG 稀釋液（1∶5 000），TBST 洗滌，滴加ECL，應用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統計學處理 應用SPSS21.0統計學軟件分析數據，計量資料均符合正態分布，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組內比較采用LSD-t檢驗，數據均以±s表示，以P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 尼莫地平對IFN-α 對人腦血管外膜成纖維細胞活力的影響 與NC 組比較，IFN-α 組細胞活力降低（P<0.05），p21 蛋白水平升高（P<0.05），CyclinD1蛋白水平降低（P<0.05）；與IFN-α 組比較，IFN-α+Nimo 50 μg/ml組、IFN-α+Nimo 100 μg/ml組、IFN-α+Nimo 200 μg/ml組細胞活力升高（P<0.05），p21蛋白水平降低（P<0.05），CyclinD1 蛋白水平升高（P<0.05），見圖1、表1。

表1 尼莫地平對IFN-α對人腦血管外膜成纖維細胞活力（±s，n=3）Tab.1 Effects of nimodipine on IFN-α on cell viability of human cerebral adventitia fibroblasts（±s，n=3）

表1 尼莫地平對IFN-α對人腦血管外膜成纖維細胞活力（±s，n=3）Tab.1 Effects of nimodipine on IFN-α on cell viability of human cerebral adventitia fibroblasts（±s，n=3）

Note：Compared with NC group，1）P<0.05；compared with IFN-α group，2）P<0.05.

Cell viability/%Groups p21 CyclinD1 48 h 0.74±0.06 0.45±0.031）0.53±0.042）0.61±0.052）0.66±0.042）18.632 0.000 72 h 1.16±0.09 0.71±0.071）0.88±0.062）0.96±0.082）1.03±0.112）12.081 0.001 NC IFN-α IFN-α+Nimo 50 μg/ml IFN-α+Nimo 100 μg/ml IFN-α+Nimo 200 μg/ml F P 0.15±0.04 0.67±0.061）0.48±0.052）0.45±0.052）0.32±0.042）45.581 0.000 0.74±0.04 0.22±0.031）0.35±0.042）0.48±0.062）0.54±0.072）46.048 0.000 24 h 0.32±0.04 0.29±0.03 0.32±0.03 0.30±0.04 0.31±0.04 0.386 0.814

圖1 Western blot 檢測人腦血管外膜成纖維細胞中p21和CyclinD1蛋白表達Fig.1 Western blot was used to detect p21 and CyclinD1 protein expressions in human cerebral vascular adventitia fibroblasts

2.2 尼莫地平對IFN-α 對人腦血管外膜成纖維細胞凋亡的影響 與NC 組比較，IFN-α 組細胞凋亡率升高（P<0.05），Bax、Cleaved caspase-3 蛋白水平升高（P<0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P<0.05）；與IFN-α組 比 較，IFN-α+Nimo 50 μg/ml 組、IFN-α+Nimo 100 μg/ml 組、IFN-α+Nimo 200 μg/ml 組細胞凋亡率降低（P<0.05），Bax、Cleaved caspase-3 蛋白水平降低（P<0.05），Bcl-2 蛋白水平升高（P<0.05），見圖2、表2。

表2 尼莫地平對IFN-α對人腦血管外膜成纖維細胞Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表達及細胞凋亡的影響（±s，n=3）Tab.2 Effects of nimodipine on IFN-α on Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 protein expressions and apoptosis of human cerebral adventitia fibroblasts（±s，n=3）

表2 尼莫地平對IFN-α對人腦血管外膜成纖維細胞Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表達及細胞凋亡的影響（±s，n=3）Tab.2 Effects of nimodipine on IFN-α on Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 protein expressions and apoptosis of human cerebral adventitia fibroblasts（±s，n=3）

Note：Compared with NC group，1）P<0.05；compared with IFN-α group，2）P<0.05.

Cell apoptosis rate/%3.51±0.32 21.84±2.231）14.39±1.152）9.18±1.032）8.37±0.942）87.331 0.000 Groups NC IFN-α IFN-α+Nimo 50 μg/ml IFN-α+Nimo 100 μg/ml IFN-α+Nimo 200 μg/ml FP Bax 0.25±0.03 0.72±0.071）0.58±0.062）0.48±0.052）0.43±0.052）31.844 0.000 Bcl-2 0.64±0.04 0.25±0.031）0.37±0.042）0.46±0.052）0.52±0.052）36.049 0.000 Cleaved caspase-3 0.13±0.02 0.67±0.061）0.51±0.052）0.38±0.042）0.28±0.042）66.696 0.000

圖2 Western blot 檢測人腦血管外膜成纖維細胞中Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表達Fig.2 Western blot was used to detect protein expressions of Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 in human cerebral vascular adventitia fibroblasts

2.3 尼莫地平對IFN-α 對人腦血管外膜成纖維細胞IRS-1 表達的影響 與NC 組比較，IFN-α 組IRS-1 mRNA 及蛋白水平降低（P<0.05）；與IFN-α 組比較，IFN-α+Nimo 50 μg/ml組、IFN-α+Nimo 100 μg/ml組、IFN-α+Nimo 200 μg/ml 組IRS-1 mRNA 及蛋白水平升高（P<0.05），見圖3、表3。

表3 尼莫地平對IFN-α 對人腦血管外膜成纖維細胞IRS-1 mRNA和蛋白表達的影響（±s，n=3）Tab.3 Effects of nimodipine on IFN-α on IRS-1 mRNA and protein expression of human cerebral adventi?tia fibroblasts（±s，n=3）

表3 尼莫地平對IFN-α 對人腦血管外膜成纖維細胞IRS-1 mRNA和蛋白表達的影響（±s，n=3）Tab.3 Effects of nimodipine on IFN-α on IRS-1 mRNA and protein expression of human cerebral adventi?tia fibroblasts（±s，n=3）

Note：Compared with NC group，1）P<0.05；compared with IFN-α group，2）P<0.05.

IRS-1 protein 0.67±0.06 0.19±0.031）0.33±0.042）0.47±0.052）0.59±0.062）46.230 0.000 Groups NC IFN-α IFN-α+Nimo 50 μg/ml IFN-α+Nimo 100 μg/ml IFN-α+Nimo 200 μg/ml FP IRS-1 mRNA 1.05±0.08 0.21±0.031）0.42±0.052）0.73±0.082）0.87±0.092）71.160 0.000

圖3 Western blot 檢測人腦血管外膜成纖維細胞中IRS-1蛋白表達Fig.3 Western blot was used to detect expression of IRS-1 protein in human cerebral vascular adventitia fibroblasts

2.4 過表達IRS-1對IFN-α對人腦血管外膜成纖維細胞活力和凋亡的影響 與IFN-α+pcDNA 組比較，IFN-α+pcDNA-IRS-1 組細胞活力升高（P<0.05），細胞凋亡率降低（P<0.05），p21、Bax、Cleaved caspase-3蛋白水平降低（P<0.05），CyclinD1、Bcl-2 蛋白水平升高（P<0.05），見圖4、表4。

圖4 人腦血管外膜成纖維細胞中IRS-1、p21、CyclinD1、Bax、Bcl-2 和Cleaved caspase-3 蛋白表達以及細胞凋亡情況Fig.4 Protein expressions of IRS-1，p21，CyclinD1，Bax，Bcl-2，Cleaved caspase-3 and apoptosis of human cerebral vascular adventitia fibroblasts

表4 過表達IRS-1 對IFN-α 對人腦血管外膜成纖維細胞活力、p21、CyclinD1、Bax、Bcl-2 和Cleaved caspase-3 蛋白表達及細胞凋亡的影響（±s，n=3）Tab.4 Effect of overexpression of IRS-1 on IFN-α on cell viability，p21，CyclinD1，Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 pro?tein expressions and cell apoptosis of human cerebral vascular adventitia fibroblasts（±s，n=3）

表4 過表達IRS-1 對IFN-α 對人腦血管外膜成纖維細胞活力、p21、CyclinD1、Bax、Bcl-2 和Cleaved caspase-3 蛋白表達及細胞凋亡的影響（±s，n=3）Tab.4 Effect of overexpression of IRS-1 on IFN-α on cell viability，p21，CyclinD1，Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 pro?tein expressions and cell apoptosis of human cerebral vascular adventitia fibroblasts（±s，n=3）

Note：Compared with IFN-α+pcDNA group，1）P<0.05.

Cell apopto?sis rate/%20.754±2.07 11.35±1.431）6.474 0.003 Groups IRS-1 p21 CyclinD1 Bax Bcl-2 Cleaved caspase-3 0.65±0.05 0.41±0.041）6.492 0.014 Cell viability/%24 h 0.31±0.04 0.34±0.03 1.039 0.357 48 h 0.54±0.04 0.67±0.051）3.517 0.025 72 h 0.76±0.06 1.04±0.071）5.260 0.006 IFN-α+pcDNA IFN-α+pcDNA-IRS-1 t P 0.38±0.04 0.52±0.051）3.787 0.019 0.74±0.06 0.41±0.041）7.926 0.001 0.32±0.04 0.58±0.051）7.033 0.001 0.64±0.06 0.25±0.031）10.070 0.000 0.27±0.04 0.43±0.051）4.328 0.028

2.5 沉默IRS-1 部分逆轉尼莫地平對人腦血管外膜成纖維細胞的作用 與IFN-α+Nimo+si-con 組比較，IFN-α+Nimo+si-IRS-1 組細胞 活力降 低（P<0.05），細 胞 凋 亡 率 升 高（P<0.05），p21、Bax、Cleaved caspase-3蛋白水平升高（P<0.05），CyclinD1、Bcl-2蛋白水平降低（P<0.05），見圖5、表5。

圖5 人腦血管外膜成纖維細胞中IRS-1、p21、CyclinD1、Bax、Bcl-2 和Cleaved caspase-3 蛋 白表達及維細胞凋亡情況Fig.5 Protein expressions of IRS-1，p21，CyclinD1，Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 and apoptosis of human cerebral vascular adventitia fibroblasts

表5 尼莫地平對IFN-α對人腦血管外膜成纖維細胞活力、p21、CyclinD1、Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表達及細胞凋亡的影響（±s，n=3）Tab.5 Effects of nimodipine on IFN-α on cell viability，p21，CyclinD1，Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 protein expres?sions and cell apoptosis of human cerebral vascular adventitia fibroblasts（±s，n=3）

表5 尼莫地平對IFN-α對人腦血管外膜成纖維細胞活力、p21、CyclinD1、Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表達及細胞凋亡的影響（±s，n=3）Tab.5 Effects of nimodipine on IFN-α on cell viability，p21，CyclinD1，Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 protein expres?sions and cell apoptosis of human cerebral vascular adventitia fibroblasts（±s，n=3）

Note：Compared with IFN-α+Nimo+si-con group，1）P<0.05.

Cell apopto?sis rate/%10.75±1.08 15.36±1.251）4.834 0.008 Groups IRS-1 p21 CyclinD1 Bax Bcl-2 Cleaved caspase-3 0.23±0.02 0.41±0.041）6.971 0.002 Cell viability/%24 h 0.34±0.04 0.31±0.03 1.039 0.357 48 h 0.72±0.05 0.61±0.041）2.976 0.041 72 h 1.03±0.09 0.79±0.061）3.843 0.018 IFN-α+Nimo+si-con IFN-α+Nimo+si-IRS-1 t P 0.67±0.06 0.45±0.051）4.879 0.008 0.31±0.04 0.49±0.061）4.323 0.012 0.54±0.05 0.25±0.031）8.614 0.001 0.31±0.04 0.75±0.031）15.242 0.000 0.71±0.08 0.36±0.031）7.095 0.002

3 討論

血管增殖性疾病與血管重構的發展有關，而人腦血管外膜成纖維細胞與心腦血管疾病密切相關［13-14］。但仍有部分藥物對血管增殖性疾病的治療及其作用機制尚未闡明。

尼莫地平可通過抑制炎癥反應從而減輕神經功能損傷［15］。尼莫地平可保護多巴胺能神經元，其作用機制可能是抑制炎癥因子表達而發揮作用［16］。尼莫地平能夠降低炎癥因子水平而減輕炎癥反應從而恢復神經功能［17］。但尼莫地平在治療神經相關疾病中的作用機制尚未完全闡明，本研究結果顯示IFN-α 處理后人腦血管外膜成纖維細胞活力降低，與上述研究結果相似，而不同濃度的尼莫地平處理后細胞活力升高，提示尼莫地平可增強IFN-α誘導的腦血管外膜成纖維細胞活力。本研究結果顯示IFN-α 處理后腦血管外膜成纖維細胞中p21 表達上調，CyclinD1表達下調，而不同濃度的尼莫地平處理后p21 表達下調，CyclinD1 表達上調，與相關報道結果相似，提示尼莫地平可能通過調控細胞周期從而增強腦血管外膜成纖維細胞活力［18］。本研究結果顯示IFN-α 處理后腦血管外膜成纖維細胞凋亡率升高，Bax、Cleaved caspase-3 表達上調，Bcl-2 表達下調，而尼莫地平處理后細胞凋亡率降低，Bax、Cleaved caspase-3 表達下調，Bcl-2 表達上調，提示尼莫地平可抑制腦血管外膜成纖維細胞凋亡。

miR-126 可通過靶向IRS-1 而在神經膠質瘤中發揮抑癌作用［19］。本研究結果顯示IFN-α 處理后腦血管外膜成纖維細胞中IRS-1 表達下調，尼莫地平處理后可促進IRS-1 的表達，進一步分析顯示IRS-1過表達后細胞活力升高，細胞凋亡率顯著降低，p21、Bax、Cleaved caspase-3 表 達 下 調，CyclinD1、Bcl-2表達上調，提示IRS-1 過表達可增強細胞活力及抑制細胞凋亡。同時本研究結果顯示抑制IRS-1 的表達后，細胞活力降低，細胞凋亡率升高，提示抑制IRS-1 的表達可明顯減弱尼莫地平對人腦血管外膜成纖維細胞的作用。

綜上所述，尼莫地平可增強IFN-α 誘導的人腦血管外膜成纖維細胞活力及抑制細胞凋亡，其作用機制可能與上調IRS-1 的表達有關，可為尼莫地平治療血管增殖性疾病提供實驗依據。