云南省異煙肼耐藥結核分枝桿菌katG 和inhA 基因突變特征

陳連勇，茹浩浩，楊星，閆雙群，陳濤，倪沁璇，許琳

（云南省疾病預防控制中心結核病防治所，云南 昆明 650022）

結核病仍是人類面臨的重大公共衛生問題。據WHO 估計[1]，2019 年全球有新發結核病1 000 萬，近50 萬新發利福平（rifampicin，RFP）耐藥肺結核患者，其中78%為耐多藥結核病患者（multiple drug resistant tuberculosis，MDR-TB）指同時耐異煙肼和利福平的結核病患者，而中國是全球30 個MDR 高負擔國家之一，耐藥結核患者占了其中的14%，位居全球第2[1]。耐藥結核病尤其是MDR-TB 仍是結核病防治面臨的一個嚴重挑戰。異煙肼（isoniazid，INH）自其問世以來一直是治療結核病的首選藥物之一，當結核分枝桿菌對INH 產生耐藥時則會嚴重影響結核病的治療效果。而耐藥從分子水平上大部分是由于結核耐藥相關基因位點發生了突變而產生的，同時受地域因素等影響，其耐藥基因突變類型和頻率存在差異。為了解云南省的INH 耐藥結核分枝桿菌基因突變情況，本研究對云南省結核耐藥監測點分離的結核分枝桿菌進行INH 耐藥相關基因katG 基因和inhA 基因測序，以闡明其耐藥基因突變特征，為本地區耐藥結核病的快速診斷和防控政策的制定提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

結核分枝桿菌菌株來自于2016 年1 月至12月期間前來云南省32 個耐藥監測縣就診的病原學陽性肺結核患者，對其痰標本進行分離培養后獲得。結核桿菌標準株（H37RV）由中國疾控中心結核病預防控制中心國家結核病參比實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 表型藥物敏感性試驗表型藥物敏感性試驗采用比例法，檢測其對6 種抗結核藥物的藥物敏感性?？菇Y核藥物在培養基中的終濃度分別為：INH 0.2 μg/mL，OFX 2 μg/mL，RFP 40 μg/mL，KM 30 μg/mL，EMB 2 μg/mL 和SM 4 μg/mL。以耐藥百分比作為判定標準：<1%者判定為敏感，≥1%則報告為耐藥。并以H37RV 作對照進行質量控制。

1.2.2 DNA 模板制備對表型藥敏結果顯示INH耐藥的結核分枝桿菌，從固體羅氏培養基斜面上刮取1 接種環培養3～4 周的新鮮菌株，重懸于200 μLTE 中，恒溫金屬浴85 ℃孵育30 min 滅活，12000 r/min 離心5 min，然后棄上清，每管分別加入100 μL 去離子水，渦旋振蕩重懸；95 ℃恒溫金屬浴20 min，超聲裂解15 min，12000 r/min離心 5 min，取上清液作為DNA 模板備用。

1.2.3 耐藥基因擴增及測序從Genebank獲得H37Rv 的katG 和inhA 基因序列，采用Primer 5.0 設計引物，對katG 和inhA 基因進行擴增，2對引物的序列分別為：

katG-F：5‘-AATCGATGGGCTTCAAGACG-3’ ；

katG-R：5‘-CTCGTAGCCGTACAGGATCTCG-3’ 。

inhA-F：5‘-CCTCGCTGCCCAGAAAGGGA-3’ ；

inhA-R：5‘-ATCCCCCGGTTTCCTCCGGT-3’ 。

擴增產物分別為500 bp 和248 bp。每個反應體系為50 μL，包括2×PCR 擴增25 μL、上下游引物（10 mol/L）各1.5 μL，DNA 模板5 μL，去離子水17 μL。PCR 擴增反應條件：94 ℃變性5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 共35 個循環，再72 ℃延伸10 min。擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4 測序結果比對katG 和inhA 基因測序結果采用BioEdit v7.2.5 軟件分析，測序結果與標準菌H37Rv 的基因序列進行比對，確定基因突變位點及基因突變情況。

1.3 統計學處理

建立EpiData 數據庫，并將實驗結果等信息錄入，采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析。突變率的比較采用χ2檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物敏感性實驗結果

共收集并分離到846 株結核分枝桿菌，藥敏試驗結果顯示，88 株結核分枝桿菌對INH 耐藥，INH 耐藥率為10.40%。其中32 株同時對RFP 耐藥（即MDR），MDR 率為4.29%，另56 株對INH耐藥，而對RFP 敏感（INH 單耐）。

2.2 INH 耐藥相關基因突變特征

88 株表型藥敏試驗結果顯示INH 耐藥的結核分枝桿菌，對其katG 和inhA 基因進行PCR 擴增，擴增出500 bp 和248 bp 大小的目的基因片段，見圖1。

圖1 katG 和inhA 基因擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose GEL electrophoresis of katG and inhA gene amplification products

測序結果顯示，73 株檢出INH 耐藥相關基因突變，15 株（17.05%）未檢測到katG 或inhA 基因的突變，INH 耐藥基因型與表型的符合率為82.95%（73/88），其中65 株（73.86%）為katG 基因突變，7 株（7.95%）為inhA 基因突變，1 株（1.14%）為katG 基因和inhA 基因的聯合突變?；蛲蛔兩婕発atG 和inhA 的14 個基因突變類型和13 種氨基酸改變，有點突變、雙位點聯合突變和基因缺失，見表1。

表1 88 株INH 耐藥結核分枝桿菌的KatG 和inhA 基因突變情況Tab.1 Distribution of mutations of katG and inhA gene among 88 inh-resistant TB isolates

突變頻率最高的位點為KatG315 位點，占INH 耐藥菌株數的67.05%（59/88），包括52 株Ser315Thr（堿基改變為AGC→ACC，氨基酸改變為Ser→Thr）基因突變，見圖2，6 株Ser315Asn（堿基改變為AGC→AAC，氨基酸改變為Ser→Asn）基因突變，見圖2，1 株Ser315Arg（堿基改變為AGC→CGC，氨基酸改變為Ser→Arg）基因突變。有4 株（4.55%）出現katG 基因的雙位點突變，見表1，其中1 株出現Ser315Thr+Lys327Lys雙位點突變中的Lys327Lys 堿基密碼子改變為同義突變，堿基變化為AAA→AAG，而編碼氨基酸未發生改變，均為Lys，見表1。7 株（7.95%）INH耐藥菌株的基因突變發生于非315 密碼子區。

7 株（7.95%）inhA 基因突變位于inhA 基因啟動子區域，均為-15 位點（C→T），見圖2，占基因突變類型的第2 位。katG315 或inhA-15 位點的突變占到所有INH 耐藥菌株數的75%（66/88）。

圖2 katG 和inhA 基因的主要突變類型Fig.2 The characteristics of katG and inhA gene mutation

2.3 耐藥基因突變與耐藥類型的比較

32 株MDR 菌株中有87.50%（28/32）出 現katG 或inhA 基因突變，而56 株INH 單耐菌株中出現基因突變的比例為80.36%（45/56），MDR 和INH 單耐菌株中基因突變比例，差異無統計學意義（χ2=0.735，P=0.391）。32 株MDR 菌株中，katG 基因突變的有28 株，占MDR 數的87.50%，其中出現katGSer315Thr 的比例為62.50%（20/32），見表2，56 株INH 單耐菌株中，katG 基因突變的有38 株（67.86%），其中出現Ser315Thr 的比例為57.14%（32/56），見表2，MDR 菌株中出現katG基因突變的比例與INH 單耐結核分枝桿菌相比，差異有統計學意義（χ2=4.190，P=0.041），而出現katGSer315Thr 基因突變，差異無統計學意義（χ2=0.242，P=0.623）。inhA 基因突變中，7 株inhA-15 位點基因突變均來自于INH 單耐菌株中，1 株inhA-34 位點基因突變來自于MDR 菌株，為與katG314 位點的聯合突變，MDR 和INH 單耐菌株的inhA 基因突變，差異無統計學意義（3.13% vs 12.50%，χ2=1.180，P=0.277），inhA-15 位點基因突變，差異無統計學意義（0 vs 12.50%，χ2=2.806，P=0.094）。

表2 不同耐藥類型中INH 耐藥基因突變情況[n（%）]Tab.2 KatG and inhA gene mutations between MDR and INH mono-resistant [n（%）]

3 討論

INH 和RFP 作為治療結核病的2 種最重要的首選抗結核藥物，兩者均存在價格便宜、殺菌力強和副作用低的特點[2]。由于RFP 耐藥的主要分子機制相對簡單，96%以上RFP 耐藥都是由于apoB 基因的核心區基因突變引起的[3]，表型和基因型耐藥高度相關，因而使得RFP 耐藥快速檢測成為可能，而INH 的耐藥機制十分復雜，涉及katG、inhA、ahpC、oxyR-ahpC 等結構基因和調控區[4?7]，其中最為主要的為katG 和inhA 基因。INH 耐藥菌株中katG 基因突變率約為60%～95%，而inhA 基因突變率則為8%～43%左右[8?10]。本研究通過對來自云南結核病耐藥監測點分離的88株INH 耐藥結核分枝桿菌進行katG 和inhA 基因的序列分析，結果顯示82.95%的菌株出現INH耐藥相關基因katG 和/或inhA 的突變，15 株未檢測到katG 基因及inhA 基因的突變，這可能和其它異煙肼耐藥相關基因發生突變有關，有關文獻報道，在異煙肼耐藥菌株中，oxyR-ahpC 突變率可達占5%～10%[2]。本研究中katG 基因突變占INH 耐藥菌株數的73.86%，INH 耐藥以katG 315位點基因突變為主，超過INH 耐藥菌株數的50%，達到67.04%；其次為inhA-15 位點的突變，占耐藥菌株數的7.95%，總體結果與國內其它省份基本一致。katG 基因突變率與江西（73.25%）[11]和吉林（70.6%）[12]等地結果接近，高于浙江（63.1%）[13]和北京（62.3%）[14]；katG 315 位點突變率與江西（68.8%）[11]、浙江（63.1%）[13]等地報道接近，低于上海（81.4%）[15]和四川（84.43%）[16]，inhA-15 位點的突變與浙江（10.41%）[13]結果接近，而低于江西（15.30%）[11]、上海（16.9%）[15]、湖南（15.6%）[17]及北京（19.5%）[14]等地結果，提示katG 和inhA 基因突變受地域等因素的影響。目前，商品化的INH 耐藥檢測分子診斷技術大部分是基于對katG 基因的315 位點和inhA 基因啟動子區的幾個常見突變位點進行檢測，根據本研究，兩者占INH 耐藥的75%左右，鑒于常規表型藥敏檢測從痰標本采集到獲得藥敏結果需分離培養和藥敏試驗等過程，耗時2～3 個月時間，而分子診斷技術工具大大縮短了診斷的時間，因此合理使用分子診斷技術對于指導臨床診療具有重要意義，同時今后還需開發或引進包含其它基因或位點的分子診斷工具以提高INH 耐藥檢測水平。

世界各地結核分枝桿菌中katG 基因中Ser 315Thr 突變的流行率各不相同，與當地結核病疫情密切相關，相比于結核病低疫情地區，高結核病負擔地區INH 耐藥菌株中的Ser 315Thr 突變率總是處于一個比較高的水平[18]。本研究顯示云南省的結核分枝桿菌Ser 315Thr 突變達到INH 耐藥菌株數的59.09%，超過50%與國內其他地區的報道基本一致[18]。有研究表明，INH 耐藥菌株在katG 315 密碼子以外區域的突變頻率低于1%[19]，而本研究中315 密碼子突變率為7.95%，同時4.55%菌株出現katG 基因雙位點突變看，提示我省katG 基因突變的多樣性較高。

本研究還對耐多藥和INH 單耐菌株的耐藥基因突變率進行了分析，結果顯示，MDR 結核分枝桿菌中katG 基因突變率顯著高于INH 單耐的菌株，這可能與大部分MDR 菌株其INH 耐藥性的獲得提前于RFP 有關[2]，通常認為katG 突變與結核分枝桿菌對INH 高水平耐藥相關，inhA 啟動子突變與INH 低水平耐藥相關。INH 耐藥性尤其是katG 突變更容易誘發菌株對RFP 耐藥而形成MDR 菌株。國外相關研究[19?20]也顯示MDR 菌株中的katG 基因突變率高于INH 單耐。本研究中雖然MDR 和INH 單耐菌株中其inhA 基因突變比例無顯著差異，但7 株inhA -15 位點突變的菌株均來自于INH 單耐，僅有1 株inhA-34+katG314聯合突變的菌株為MDR，提示不同耐藥類型中，inhA 的基因突變率也可能不同，本研究受限于inhA 基因突變的樣本較少，尚不足以明確反映inhA 基因與表型耐藥的關系，具體情況還有待于今后進一步研究。

本研究首次通過基因測序手段揭示了云南省結核分枝桿菌異煙肼耐藥的分子特征，并對耐藥表型和基因型的關系進行了分析，為云南省今后各類異煙肼耐藥檢測技術手段在云南省的合理應用提供了技術支撐。