祛瘀通絡解毒方聯合中藥外治方對糖尿病足潰瘍面局部組織活化素Ⅰ型受體和人矮小同源盒基因2表達的影響※

劉宇彪 周花玩 鞠 上

(1.中國中醫科學院廣安門醫院南區外科，北京 102600；2.北京金象復星醫藥股份有限公司天承金象中醫診所，北京 100045；3.北京中醫藥大學東直門醫院周圍血管病科，北京 100061)

糖尿病足是由于糖尿病患者并發周圍神經病變或下肢動脈血管病變，導致的足部缺血性、神經性或神經缺血性病變，在病程進展中可導致足部潰瘍，創面遷延不愈，嚴重者引起足部組織壞死而有截肢風險[1]。目前臨床多以控制血糖、改善微循環、營養神經、抗感染等對癥治療為主，效果并不理想[2]。中藥治療糖尿病足潰瘍具有顯著效果，可改善患者臨床癥狀，促進創面愈合，且具有更高的安全性[3]。近年來多項研究表明，活化素Ⅰ型受體(activin A receptor type Ⅰ，Acvr1)、人矮小同源盒基因2(short stature homeobox 2，Shox2)與肢體發育及創面愈合密切相關[4-5]。Acvr1在肌細胞、血管、足骨及真皮細胞發育中具有重要作用，其表達異常時可影響多種疾病的發生和預后[6]。Shox2是胚胎發育的關鍵基因，不僅在肢體形成中起關鍵作用，對軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞和真皮成纖維細胞等多種結締組織細胞的發育和形成也具有重要作用[7-8]，且有研究發現人類的皮組織中Shox2呈高表達[9]。本研究基于中醫學對糖尿病足潰瘍病因病機的認識，結合臨床實踐經驗，以祛瘀通絡解毒方內服聯合中藥外治方熏洗治療糖尿病足潰瘍58例，并與中藥外治方熏洗治療58例對照，觀察對潰瘍面組織中Acvr1及Shox2表達的影響，結果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年1月至2020年1月中國中醫科學院廣安門醫院南區外科糖尿病足潰瘍住院患者116例，男67例，女49例，年齡48～75歲，按照隨機數字表法分為聯合組和對照組，每組58例。2組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 2組一般資料比較

1.2 病例選擇

1.2.1 診斷標準 西醫診斷：參照《中國糖尿病足防治指南(2019版)》[10]。中醫診斷：依據《糖尿病足中醫診療標準》[11]辨證為瘀毒阻絡，熱毒熾盛證，證見患足肌膚紅腫潰爛，深達筋骨，色黯不鮮，變黑壞死，膿腐，皮膚灼熱腫痛，或分泌黃稠膿液，小便黃赤，大便干結，或伴有高熱煩渴，舌絳紅或黯紅，苔薄黃膩或黃，脈細數或洪數。

1.2.2 納入標準 符合西醫診斷及中醫辨證標準；均為單側患??；年齡<75歲,>18歲；Wagner分級Ⅱ～Ⅳ級[10]；患者臨床資料完整；無危及健康的其他疾??；入組前1個月未采用其他影響本研究結果的治療方式；患者及家屬知情同意，簽署知情同意書；研究獲得醫院醫學倫理委員會批準。

1.2.3 排除標準 合并嚴重心、腦、肝、腎、胃腸疾病及腫瘤者；嚴重感染或嚴重壞死需截肢者；嚴重營養不良、中度及以上貧血者；存在認知功能障礙或有精神疾病者。

1.3 治療方法 2組均常規予改善微循環、營養神經、降糖調脂及抗感染等基礎治療，用碘伏消毒、清潔創面，無菌干潔敷料包扎。

1.3.1 對照組 予中藥外治方熏洗。藥物組成：苦參10 g，紅花10 g，木鱉子10 g，黃連10 g，黃柏30 g，乳香15 g，沒藥15 g。水煎取汁1200 mL趁熱熏足，待藥液溫度降至40 ℃后浸足15～20 min，晾干，敷以無菌干紗布。

1.3.2 聯合組 在對照組治療基礎上加祛瘀通絡解毒方。藥物組成：野菊花、車前子15 g，赤芍、蒲公英、當歸各20 g，川芎10 g，玄參15 g，葛根30 g，制乳香、制沒藥各10 g，川牛膝15 g，生黃芪60 g，三七粉(沖服)、水蛭粉(沖服)各2 g。若有較多的腐爛組織且有臭味，加虎杖15 g、土茯苓30 g解毒除穢；膿液排出不暢，予清創祛腐，加皂刺10 g、花粉30 g、白芷10 g透膿外出；伴有高熱、口干、大便秘結者，加生石膏30 g、大黃10 g瀉熱通便。每日1劑，水煎取汁400 mL，分早、晚2次溫服。

1.3.3 療程 2組均治療4周。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 潰瘍面組織Acvr1、Shox2表達 分別于治療前及治療第7、14天同一個位置取直徑約3.0 mm的創緣組織，采用免疫組化法[試劑盒購自基因科技(上海)股份有限公司]檢測Acvr1、Shox2陽性表達情況。相應組織切片脫蠟復水后，采用檸檬酸鹽抗原修復法熱修復后冷卻至室溫，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗；封閉液室溫封閉15 min，滴加Acvr1、Shox2一抗(稀釋比例1∶500)，室溫孵育1 h，PBS清洗；二抗室溫孵育1 h，PBS清洗；二氨基聯苯胺法(DAB)染色，蘇木素復染核2 min，自來水返藍，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡觀察細胞核呈藍色，陽性表達部位呈棕黃色。使用Image ProPlus軟件對染色結果進行半定量分析，計算平均光密度值(累積光密度值/測量的染色區域面積)，數值越大表示蛋白表達量越高。

1.4.2 血清Acvr1、Shox2水平及蛋白表達 分別于治療前及治療第7、14、28天取2組患者外周肘靜脈血2 mL，離心后取上清，采用酶聯免疫吸附法(試劑盒購自武漢賽培生物科技有限公司)檢測血清Acvr1、Shox2水平。另取外周肘靜脈血5 mL，采用Western blot法[試劑盒由歐蒙醫學診斷(中國)有限公司提供]檢測Acvrl和Shox2蛋白表達。血液樣本離心后取上清，提取血清蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，后轉移蛋白至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，滴加一抗、二抗，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參，使用Image J圖像處理軟件對蛋白條帶灰度值進行分析。

1.4.3 中醫證候積分[12]比較2組治療前及治療第7、14、28天中醫證候評分。其中創面深度、面積、肉芽生長情況、分泌物情況、創面周圍紅腫情況按照無、輕、中、重度分別記0、2、4、6分，煩渴、疼痛按嚴重程度分別記0、1、2、3分，小便黃、大便干、創面周圍灼熱根據有無分別記1、0分。分數越高，癥狀越嚴重。

1.4.4 疼痛 比較2組治療前及治療第7、14、28天疼痛視覺模擬評分(VAS)變化。評分范圍為0～10分，分數越高，表示疼痛越劇烈[13]。

1.4.5 臨床預后指標 比較2組治療前及治療第7、14、28天潰瘍面積(潰瘍長度×寬度)，統計比較2組肉芽組織形成時間、創面愈合時間及住院時間。

1.5 療效標準 參考《糖尿病足病中醫病證結合診療指南》[14]及《中藥新藥臨床研究指導原則：第3輯》[15]擬定。臨床痊愈：創面完全愈合，臨床癥狀消失，中醫證候積分較治療前減少≥90%；顯效：創面縮小≥75%，<90%，臨床癥狀明顯改善，較多新鮮肉芽出現，且無明顯膿性滲出液，中醫證候積分較治療前減少≥70%，<90%；好轉：創面縮小≥25%，<75%，新鮮肉芽可見，較少滲出液，中醫證候積分較治療前減少≥30%，<70%；無效：創面縮小<25%，臨床癥狀未見好轉，或創面出現擴大、截肢，中醫證候積分較治療前減少<30%。有效=臨床痊愈+顯效+好轉。

2 結果

2.1 2組臨床療效比較 聯合組總有效率96.55%(56/58)，對照組總有效率77.59%(45/58)，2組總有效率比較差異有統計學意義(P<0.05)，聯合組臨床療效優于對照組。見表2。

表2 2組臨床療效比較 例(%)

2.2 2組潰瘍面Acvr1、Shox2平均光密度值比較 免疫組化結果顯示，隨著治療時間的延長，2組潰瘍面Acvr1、Shox2平均光密度值逐漸升高，組內治療前及治療第7、14天3個時間點兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。組間比較顯示，治療第7、14天聯合組潰瘍面Acvr1、Shox2平均光密度值均高于對照組同期，比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 2組潰瘍面Acvr1、Shox2平均光密度值比較

圖1 2組潰瘍面Acvr1、Shox2免疫組化圖(×200)

2.3 2組血清Acvr1、Shox2水平比較 隨著治療時間的延長，2組血清Acvr1、Shox2水平逐漸升高，組內治療前及治療第7、14 、28天4個時間點兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。組間比較顯示，治療第7、14、28天聯合組血清Acvr1、Shox2水平均高于對照組同期，比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 2組血清Acvr1、Shox2水平比較

2.4 2組血清Acvr1、Shox2蛋白表達比較 隨著治療時間的延長，2組血清Acvr1、Shox蛋白表達逐漸升高，組內治療前及治療第7、14 、28天4個時間點兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。組間比較顯示，治療第7、14 、28天聯合組血清Acvr1、Shox2蛋白表達均高于對照組同期，比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表5，圖2。

表5 2組血清Acvr1、Shox2蛋白表達比較

圖2 2組血清Acvr1、Shox2蛋白表達

2.5 2組中醫證候積分比較 隨著治療時間的延長，2組中醫證候積分逐漸降低，組內治療前及治療第7、14、28天4個時間點兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。組間比較顯示，治療第7、14、28天聯合組中醫證候積分均低于對照組同期，比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 2組中醫證候積分比較 分，

2.6 2組疼痛VAS比較 隨著治療時間的延長，2組疼痛VAS逐漸降低，組內治療前及治療第7、14 、28天4個時間點兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。組間比較顯示，治療第7、14 、28天聯合組疼痛VAS均低于對照組同期，比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表7。

表7 2組疼痛VAS比較 分，

2.7 2組潰瘍面面積比較 隨著治療時間的延長，2組潰瘍面面積逐漸縮小，組內治療前及治療第7、14、28天4個時間點兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。組間比較顯示，治療第7、14 、28天聯合組潰瘍面面積均低于對照組同期，比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表8。

表8 2組潰瘍面面積比較

2.8 2組肉芽組織形成時間、創面愈合時間及住院時間比較 聯合組肉芽組織形成時間、創面愈合時間及住院時間均少于對照組，比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表9。

表9 2組肉芽組織形成時間、創面愈合時間及住院時間比較

2.9 血清Acvr1、Shox2水平與其他臨床指標相關性分析 Pearson分析顯示，血清Acvr1、Shox2水平與糖尿病病程、糖尿病足病程、中醫證候積分、疼痛VAS、潰瘍面面積、肉芽組織形成時間、潰瘍創面愈合時間及住院時間呈顯著負相關(P<0.05)，Acvr1與Shox2呈顯著正相關(P<0.05)。見表10。

表10 血清Acvr1、Shox2水平與其他臨床指標相關性分析

3 討論

足部潰瘍是糖尿病患者常見的嚴重并發癥，臨床愈合率低，復發率高，若局部感染較重，則可能導致截肢，給患者及其家庭帶來了沉重的負擔[16]。血管病變、神經病變和感染等導致的創面修復途徑受損是糖尿病足潰瘍愈合困難的主要原因，加之多種細胞因子紊亂等多因素的影響，常規的抗感染、營養神經及改善微循環等治療方法往往難以取得良好的治療效果。自2005年，我國一系列糖尿病足防治指南中都重點推介中醫藥參與到糖尿病足的治療過程[17]。

糖尿病足潰瘍屬中醫學“脫疽”范疇，為本虛標實、虛實夾雜之證。發病機制為消渴久病，耗傷氣陰，陰虛燥熱，熱灼津血，變生瘀血、痰濁，阻滯經絡，氣血津液運行輸布失常，肢端肌膚失養而發潰瘍；陰虛血熱，蘊久化毒，又因外傷毒邪入侵，熱毒瘀互結，腐蝕肌膚，久而破潰流膿。瘀血阻絡，熱毒留滯是糖尿病足潰瘍的基本病機[18]，診斷時應以局部辨證為主，兼顧全身辨證，治宜清熱涼血，化瘀解毒，通絡止痛[19-20]。本研究所用中藥外治方中黃連、苦參、黃柏清熱解毒；木鱉子清熱散結，攻毒療瘡；紅花活血祛瘀；乳香、沒藥活血消腫，生肌斂瘡?，F代藥理研究證實，黃連具有體外鎮痛、抗炎、抗菌作用，黃連多糖具有抗氧化、降血糖、減輕炎性反應和神經保護作用[21-22]；苦參含大量生物堿和黃酮類化合物,具有抗菌、消炎、鎮痛等作用[23]；紅花除能抗炎、鎮痛外，還能調節血流動力學，從而促進局部缺血組織微循環和受損神經組織的功能恢復,加速創面愈合[24]；沒藥水提取物能顯著促進人成纖維細胞增殖和Ⅲ型膠原mRNA表達，進而促進創面愈合[25]。祛瘀通絡解毒方方中車前子利水消腫，清熱解毒；蒲公英、野菊花清熱解毒；當歸活血化瘀；川芎活血行氣，祛風止痛；玄參清熱涼血，滋陰瀉火解毒；葛根生津退熱，解毒療瘡；制乳香、制沒藥活血消腫，生肌斂瘡；水蛭破血逐瘀，活血通經；三七粉涼血消腫，止痹痛，活血散瘀；生黃芪重用補氣升陽，斂瘡生肌，托毒排膿；川牛膝活血逐瘀，引藥下行。諸藥合用，共奏清熱解毒、祛瘀通絡、滋陰升陽、行氣活血之功。本研究結果顯示，治療后聯合組總有效率高于對照組(P<0.05)；治療第7、14、28天，聯合組中醫證候積分、疼痛VAS均低于對照組(P<0.05)，潰瘍面面積小于對照組(P<0.05)，肉芽形成時間、潰瘍創面愈合時間及住院時間均少于對照組(P<0.05)。表明祛瘀通絡解毒方聯合中藥外治方熏洗治療可有效提高糖尿病足潰瘍的臨床療效，減輕患者疼痛，促進肉芽組織生成，加速創面愈合。

由于糖尿病足潰瘍的復發率高，且伴有感染和截肢的風險，因此針對糖尿病足疾病，目前的重點除了有效治療外，還需要預防復發，確定糖尿病足潰瘍復發的預測因子尤為重要。Acvr1在軟骨發育和真皮細胞發育中有重要作用，而真皮中主要為成纖維細胞，主要參與皮膚創面肉芽組織的形成。而Acvr1可通過參與機體免疫反應，降低炎癥，改善機體內環境，從而激活局部和全身的修復細胞增殖、遷移和分化，從而使大量的成纖維細胞聚集于創面而形成新肉芽，進而加快創面愈合[26]。而糖尿病足患者存在不同程度的感染，因長期慢性炎癥使機體免疫功能下降，同時會伴有Acvr1表達降低[27]。Shox2在人皮膚成纖維細胞中保持了胚胎發育過程中建立的HOX基因表達模式的關鍵特征，其在胚胎、胎兒和成人皮膚組織中均有表達，在高血糖環境下呈低表達水平[28]。而當其水平降低或發生突變時容易發生四肢皮膚發育缺陷等疾病，另外，當皮膚發生潰瘍時，伴有炎癥水平的升高和Shox2水平降低[29]。本研究通過免疫組化檢測發現，治療第7、14天2組潰瘍面組織Acvr1、Shox2蛋白表達量較治療前顯著升高(P<0.05)，且隨著治療時間的延長，其表達量也隨之增加(P<0.05)，且聯合組較對照組更高(P<0.05)。這與本研究中用酶聯免疫吸附法檢測各組血清Acvr1、Shox2水平及Western blot法檢測血清Acvr1、Shox2蛋白表達的結果具有一致性。進一步的相關性分析顯示，血清Acvr1、Shox1水平與糖尿病病程、糖尿病足病程、中醫證候積分、疼痛VAS、潰瘍面面積、肉芽組織形成時間、潰瘍創面愈合時間及住院時間呈顯著負相關性(P<0.05)。提示Acvr1及Shox2可能參與了糖尿病足潰瘍的發生發展，且高水平的Acvr1及Shox2有助于促進潰瘍愈合，這與目前關于糖尿病足的病因可能為骨、關節、血管異常病變及神經病變等具有一致性。Acvr1、Shox2有希望成為糖尿病足潰瘍預防和治療的重要標記物。

綜上所述，祛瘀通絡解毒方聯合中藥外治法熏洗治療糖尿病足潰瘍療效顯著，可有效減輕患者臨床癥狀，縮短創面愈合時間，提高Acvr1、Shox2水平或蛋白表達，Acvr1和Shox2有希望成為糖尿病足新的治療靶點。但本研究也存在不足，如病例數較少，分析Acvr1、Shox2變化時未設立健康人群及非糖尿病人群作對照，研究結果具有一定的局限性，有待在后續的研究中總結完善。