一種新型提高HDR效率的CRISPR/Cas9-Gal4BD供體適配基因編輯系統

張瀟筠，徐坤，沈俊岑，穆璐，錢泓潤，崔婕妤，馬寶霞，陳知龍，張智英，魏澤輝

一種新型提高HDR效率的CRISPR/Cas9-Gal4BD供體適配基因編輯系統

張瀟筠，徐坤，沈俊岑，穆璐，錢泓潤，崔婕妤，馬寶霞，陳知龍，張智英，魏澤輝

西北農林科技大學動物科技學院，楊凌 712100

近年來，CRISPR基因編輯及衍生技術迅速發展，在生命科學、生物醫學研究以及動植物育種領域得到了廣泛應用?；贒NA雙鏈斷裂(double-stranded break, DSB)同源指導修復(homology-directed repair, HDR)機制的基因敲入和點編輯是基因編輯的重要策略，但效率偏低亟待提高。本文提出了驅動供體DNA富集至DSB處以提高HDR效率的新策略，并設計了一套CRISPR/Cas9-Gal4BD 供體適配基因編輯系統(donor adapting system, DAS)。該系統主要利用Gal4 DNA結合域(Gal4 binding domain, Gal4BD)作為配體蛋白與Cas9融合表達，將Gal4BD結合序列(Gal4 binding sequence, Gal4BS)作為受體序列與雙鏈DNA (double-stranded DNA, dsDNA)供體結合，以期提高HDR效率。使用HEK293T-HDR.GFP報告細胞系的初步研究結果表明當dsDNA供體同源臂在一定長度(100～60 bp)時該系統能夠提高HDR效率2～4倍。進一步的優化研究表明，融合端口和融合使用連接子(linker)的選擇會影響Cas9表達效果及活性，而GGS5作為Cas9-Gal4BD融合的連接子則影響較小。同時，本研究還發現Gal4BS-dsDNA供體的差異化設計也會影響HDR效率，將Gal4BS添加到dsDNA供體5′-端的效果最佳。綜上所述，本研究利用CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS在和位點上實現了HDR編輯效率的提高，為進一步利用該系統進行動物分子設計育種研究提供了參考和借鑒。

CRISPR/Cas9；基因編輯；供體DNA；供體適配；同源指導修復

CRISPR/Cas9基因編輯被稱為能夠“改變世界”的技術，以其為基礎的分子設計育種能夠實現動植物性狀的快速改良，被廣泛應用到了動植物育種研究中[1～3]。CRISPR/Cas9系統通過單鏈引導RNA (single guide RNA, sgRNA)在特定的靶位點誘導DNA雙鏈斷裂(double-stranded break, DSB)，進而利用細胞自身的DSB修復機制實現基因編輯[4,5]。細胞主要通過非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)和同源重組(homologous recombination, HR)兩種修復機制進行DSB的修復。其中，HR包括在基因組編輯中廣泛應用的同源指導修復(homology- directed repair, HDR)和相對小眾的單鏈退火(single- stranded annealing, SSA)[6]。

在哺乳動物細胞中，DSB絕大部分通過NHEJ機制進行修復，相關修復蛋白直接將DNA斷裂末端拉近，通過連接酶進行重新連接。在此過程中通常會導致斷裂末端核苷酸的丟失或插入，進而引起基因功能的喪失。HR修復發生的概率相對較低，當DNA雙鏈斷裂后，MRN復合物(包括MRE11、Rad50、Nbs1三種蛋白質)結合到DSBs，引起核酸內切酶(CtIP)對DSBs末端進行切除，導致長3′單鏈DNA片段被復制蛋白A (replication protein A, RPA)包裹。隨后，Rad51取代了RPA與ssDNA結合，形成核蛋白突觸前絲，促進尋找同源供體。待異源雙鏈DNA結構形成后，Rad51分解，同時伴隨著DNA合成和最后的連接步驟。

在使用CRISPR/Cas9進行相關研究時，基于NHEJ修復的基因編輯通常被用于目標基因的移碼敲除，而HDR機制常被用于基因精確編輯(精確的點突變、小片段的插入或缺失等)、置換和敲入等。但是，HDR機制依賴于供體DNA的重組效應，普遍存在著效率低下的缺點[7]。近年來，研究者們開發了一系列的提高HDR效率的策略，包括抑制NHEJ通路、增強HDR機制、優化供體形式和控制打靶時效等(表1)。

Ruff等[8]首次提出了將供體DNA靶向募集到DSB附近以提高HDR效率的策略。該研究直接將I-I核酸酶作為配體蛋白，篩選出具有強結合活性的受體DNA元件(I-I適配子)。通過在單鏈DNA (single-stranded DNA, ssDNA)短供體(小于100 nt)一端引入適配子序列，成功在酵母和人類細胞中將HDR效率提高了32倍和16倍。受此策略的啟發，多個類似的CRISPR/Cas9基因編輯衍生系統相繼被開發[9～16]。為了便于描述，本文提出了供體適配基因編輯系統(donor adapting system, DAS)的概念，特指驅動供體DNA富集至DSB處以提高HDR效率的CRISPR/Cas9基因編輯衍生系統。

Gal4轉錄因子是半乳糖誘導基因表達的正調節因子，由DNA結合域(binding domain, BD)和激活域(activating domain, AD)兩個功能域組成。兩個結構域可以獨立表達并行使功能，已被成功應用于商業化的酵母雙雜交系統(yeast two-hybrid system, Y2H)。Gal4BD位于Gal4 N-末端，是一個屬于Zn(2)-C6家族的鋅指結構，能夠特異性識別Gal1啟動子中的上游激活序列(upstream activation sequence, UAS)[43]。野生型UAS由幾個具有高度同源性的結合序列(binding sequence, BS)組成。研究人員發現單個結合序列是約為20 bp的保守序列，兩端均有保守的GC堿基[44]。

表1 不同HDR效率提高策略的比較

本研究基于課題組在CRISPR/Cas9和Y2H方面的研究基礎提出了一種新型的CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS基因編輯系統，通過將Cas9蛋白與酵母源的Gal4 BD[45]融合表達以提高HDR效率。

1 材料與方法

1.1 載體構建

采用pLL3.7作為載體骨架，分別用U6和CMV啟動子起始CRISPR/Cas9系統sgRNA和Cas9的表達。通過PCR，從Y2H載體pGBKT7 (美國Clontech公司)上擴增獲得Gal4BD及C-端28 aa鏈接的DNA表達序列，克隆至pLL3.7-U6/sgRNA-CMV-Cas9中基因的上游(N-端)，構建獲得N-ter Gal4BD Cas9融合蛋白表達載體；將課題組研究常用的針對VEGF基因相關靶位點(CTCGGCCACCACAGGG-AAGCPAM)的sgRNA克隆至該載體中U6啟動子下游，構建sgVEGF/N-ter Gal4BD Cas9表達載體，初步建立CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS (圖1A)。

為了進一步優化該系統，采用兩類不同的柔性linker，即不同長度的GGSn (n=1/3/5/7，為GGS氨基酸串聯重復的個數)和全長及截短的XTEN (XTEN1- SGSETPGTSESATPES和XTEN2-SESATPES)，將基因克隆至基因的下游(C-端)，進而構建獲得相應的C-ter Gal4BD Cas9融合蛋白表達載體，同樣采用sgVEGF作為后續功能驗證實驗的sgRNA構建相應的CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS表達載體。

本研究中所使用的pSSA.GFP.VEGF和pHDR.GFP.VEGF熒光報告載體分別為課題組前期研究所構建[27,46]。兩個報告載體中的報告基因均被插入的VEGF靶序列打斷，經過CRISPR/Cas9系統打靶造成DSB后，分別通過SSA和HDR機制進行修復，進而可以通過熒光細胞流式計數評估Cas9活性和HDR效率。

1.2 細胞培養和轉染

采用HEK293T細胞進行相關細胞實驗檢測。細胞培養條件均為：90% DMEM培養基，10% FBS，100 μg/mL的青鏈霉素，5% CO2(均為體積分數)，溫度37℃。采用上海YEASEN公司的Hieff Trans?脂質體核酸轉染試劑根據說明書步驟進行轉染實驗：轉染前1天將細胞接種于12孔板中，在細胞密度達到80%～90%后進行轉染，每孔轉染2 μg的質粒，每組最少設置3個平行轉染孔。

1.3 報告細胞系的構建及檢測

課題組前期通過轉座系統將HDR.GFP報告基因表達盒隨機整合至HEK293T基因組中構建了相應的HEK293T-HDR.GFP報告細胞系[46]。本研究利用該報告細胞系初步驗證CRISPR/Gal4BD- Cas9 DAS的可行性，通過PCR在不同長度的GFP dsDNA供體5′-端添加長度為20 bp的Gal4BD結合序列(binding sequence, BS; 5′-TCCGGAGGACTG-TCCTCCGG-3′) (圖1B)。對照組供體添加同樣長度的無關序列(irrelevant sequence, IS; 5′-TTCAGAC-GAGATAGTCTGAG-3′)。將上述構建的sgVEGF/ N-ter Gal4BD Cas9表達載體與經5′-端改造的GFP dsDNA供體以質量比1∶1轉染HEK293T-HDR.GFP報告細胞系，轉染48 h后使用BD FACS Aria III流式細胞儀對GFP陽性(GFP+)細胞進行計數以評估HDR效率。

1.4 SSA報告實驗檢測Cas9活性

采用SSA報告實驗比較不同Cas9-Gal4BD融合表達方案對Cas9活性的影響。其中，pSSA.GFP.VEGF報告載體中的報告基因被CRISPR/Cas9系統打靶后無需供體DNA即可通過SSA機制直接修復(圖2A)。以1∶1的質量比或摩爾比，將sgVEGF/Cas9表達載體與pSSA.GFP.VEGF報告載體共轉染HEK293T細胞進行預實驗，初步結果表明1∶1的質量比效果最佳。進而以質量比1∶1將不同融合表達方案(圖2, B和D)的sgVEGF/Cas9-Gal4BD表達載體與pSSA.GFP.VEGF報告載體共轉染HEK293T細胞，轉染48 h后，使用美國BD公司FACS Aria III流式細胞儀對GFP陽性(GFP+)細胞進行計數以評估Cas9活性。同時收集每個轉染組的細胞提取總蛋白，使用抗-Gal4BD (美國Abbkine公司，ABP57232)和抗-Cas9 (英國Abcam公司，ab191468)抗體分別進行免疫印跡(Western blot, WB)實驗檢測不同Cas9- Gal4BD融合蛋白的表達情況。

1.5 HDR報告實驗驗證HDR效率

為了獲得最佳的BS-dsDNA供體設計，使用HDR報告實驗對不同BS-dsDNA供體介導的HDR效率進行評估。其中，pHDR.GFP.VEGF報告載體中報告基因被CRISPR/Cas9系統打靶后僅能通過供體DNA依賴的HDR機制實現修復(圖3A)。以1∶1∶1的質量比或摩爾比，將sgVEGF/Cas9表達載體、pHDR.GFP.VEGF報告載體和長度為700 bp的GFP dsDNA供體共轉染HEK293T細胞進行預實驗，初步結果表明1∶1∶1的質量比效果最佳。根據相關報道，Gal4BD結合序列的一般結構是5′- CGG-N11-CCG-3'[44,47,48]，進一步選擇長度為17 bp的短BS序列[49]進行BS-dsDNA供體的設計(圖3，B和D)。以質量比1∶1∶1將sgVEGF/Cas9-GGS5- Gal4BD載體、pHDR.GFP.VEGF報告載體和通過PCR擴增獲得的不同BS-dsDNA供體共轉染HEK293T細胞。轉染48 h后，使用美國BD公司FACS Aria III流式細胞儀對GFP陽性(GFP+)細胞進行計數以評估HDR效率。

1.6 基因組編輯

使用優化后Cas9-Gal4BD和BS-dsDNA組成的CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS對HEK293T細胞三個基因組位點(、、)進行點編輯。將sgVEGF/Cas9-GGS5-Gal4BD載體中的sgVEGF替換為sgAAVS1、sgEMX1和sgNUDT5，構建相應的CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS載體。以課題組前期構建的質粒供體[50]為模板，通過PCR引入5′-BS獲得相應的BS-dsDNA供體。供體左右同源臂長度均設計為1000 bp左右，且序列中sgRNA靶點PAM均突變為限制性內切酶(RE)位點(圖4A)，以便通過限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析評估HDR編輯效率。

以質量比1∶1∶1將CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS載體、相應的BS-dsDNA供體和HDR通用型報告篩選載體(HDR-universal surrogate reporter, HDR- USR)共轉染HEK293T細胞。HDR-USR為課題組前期開發的HDR編輯陽性細胞輔助篩選報告載體[50]。轉染后24 h，用含有嘌呤霉素的培養基篩選3天，更換正常培養基繼續培養2天，收集各組細胞，提取基因組DNA，PCR擴增目的基因片段并進行限制性內切酶消化實驗及RFLP分析。其中，一條PCR檢測引物設計在dsDNA供體模版之外，PCR產物及酶切后片段大小(bp)為：, 1274=1087+187；, 2147=1087+1060；, 2186=1105+1081。通過ImageJ軟件對消化和未消化的DNA條帶進行灰度對比分析，進而評估目標基因位點的HDR編輯效率。

1.7 數據統計與分析

所有實驗均至少設置三個平行重復或獨立重復，數據以“平均值±SD”表示，使用檢驗進行顯著性檢驗。*：<0.05為差異顯著，**：<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 報告細胞系初步驗證CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS功能

本研究最初將Gal4BD與Cas9 N-端進行融合，初步建立了CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS 基因編輯系統(圖1A)，并嘗試利用課題組前期研究構建的HEK293T-HDR.GFP報告細胞系進行功能驗證。該報告細胞系中整合的報告基因修復原理如圖1B所示。其中，Gal4BD結合序列BS可以通過PCR技術直接添加到dsDNA供體的5'-端，IS為無關對照序列。本實驗采用了長度分別為215 bp、100 bp和60 bp的GFP dsDNA供體，初步檢測結果表明，當供體DNA在一定長度內時，HDR編輯效率可提高2～4倍(圖1C)。但CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS能否有效提高長dsDNA供體的HDR效率尚有待商榷。

圖1 CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS及HEK293T-HDR.GFP報告細胞系驗證結果

A：Cas9-Gal4BD融合蛋白驅動BS-dsDNA供體示意圖；B：CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS介導報告細胞系基因HDR示意圖；C：CRISPR/Gal4BD-Cas9 DAS介導的不同GFP dsDNA供體HDR效率比較。BS/IS-GFP215/100/60分別代表5’-端連接BS或IS、長度為215/100/60 bp的GFP dsDNA供體；BS為Gal4BD結合序列，IS為無關對照序列。數據以平均值±SD表示，=3，**：<0.01。

2.2 SSA報告實驗優化Cas9-Gal4BD融合方式

鑒于Gal4BD與Cas9 N-端融合(N-ter Gal4BD)可能會嚴重影響Cas9的活性，進一步將Gal4BD與Cas9 C-端進行融合(C-ter Gal4BD)，并采用了多個不同的linker，構建了優化的CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS。利用課題組前期開發的SSA報告系統(圖2A)進行Cas9活性的驗證，結果表明C-ter Gal4BD保留了與野生型(WT)Cas9相近的活性，而N-ter Gal4BD活性顯著降低(圖2，B和C)；不同linker連接的C-ter Gal4BD對Cas9活性造成了不同程度的影響(圖2，D和E)。進一步采用抗-Gal4BD和抗-Cas9抗體對Cas9-Gal4BD融合蛋白的表達情況進行WB檢測，結果表明除了GGS5和XTEN1，其余linker連接的C-ter Gal4BD均對Cas9表達造成了顯著影響(圖2，F和G)。結合SSA報告實驗結果及Cas9、Gal4BD蛋白表達檢測情況，推測采用GGS5 (5個GGS重復) linker的C-ter Gal4BD融合表達策略是相對較優的選擇。

2.3 HDR報告實驗優化BS-dsDNA供體設計

作為CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS重要組成部分，BS-dsDNA供體的設計也是提高HDR效率的關鍵。為了探討最佳的BS-dsDNA供體設計，采用課題組前期開發的HDR報告系統(圖3A)進行不同BS-dsDNA供體的HDR效率驗證。鑒于Gal4 BS的一般結構為5′-CGG-N11-CCG-3′，改用長度為17 bp的短BS序列，并采用不含啟動子的全長序列(約700bp)作為供體模板。首先，將不同數量的BS添加到dsDNA供體的5′-端，HDR報告實驗結果表明增加BS并不能提高HDR效率，反而單個BS (1×BS)可能是最好的選擇(圖3，B和C)。其次，將BS序列添加到供體模板的5′-或/和3′-端(圖3D)，結果表明將BS添加到供體DNA 5′-端的效果較好(圖3E)。

圖2 SSA報告實驗驗證不同Cas9-Gal4BD融合蛋白活性的結果

A：pSSA.GFP報告載體修復原理示意圖；B，D：Cas9 N-端和C-端融合Gal4BD (N-ter Gal4BD, C-ter Gal4BD)及linker示意圖；C：N-ter Gal4BD和C-ter Gal4BD對Cas9活性影響的檢測結果；E：不同linker鏈接的C-ter Gal4BD對Cas9活性影響的檢測結果；F：使用抗-Gal4BD (上)和抗-Cas9 (下)抗體的WB檢測結果；G：Cas9蛋白表達水平WB檢測結果的灰度分析。數據以平均值±SD表示，n=3～5，*：<0.05；**：<0.01。

圖3 HDR報告實驗驗證不同BS-dsDNA供體HDR效率的結果

A：pHDR.GFP報告載體修復原理示意圖；B：5′-端添加不同數目BS的dsDNA供體及HDR報告實驗設計示意圖；C：5′-端添加不同數目BS的dsDNA供體HDR效率檢測結果；D：5′-端或/和3′-端添加BS的dsDNA供體及HDR報告實驗設計示意圖；E：5′-端或/和3′-端添加BS的dsDNA供體HDR效率檢測結果。數據以平均值±SD表示，=3～5，**：<0.01。

2.4 CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS介導的基因組編輯

使用優化后Cas9-Gal4BD和BS-dsDNA組成的CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS對HEK293T細胞的三個基因組位點(、、)進行點編輯。將BS-dsDNA供體中sgRNA靶序列的PAMs突變為RE位點防止供體DNA被打靶，同時方便后續通過RFLP實驗進行HDR效率檢測(圖4A)。結果表明和位點的HDR編輯效率顯著提高了約20%，但是基因位點則與對照組相比無顯著差異(圖4，B和C)。據此推測，HDR編輯效率的提高具有位點依賴性，可能與基因的結構和活躍情況有關。

3 討論

為了提高供體DNA的HDR效率，本研究開發了新型的CRISPR/Cas9-Gal4BD供體適配基因編輯系統。優化結果表明Cas9-Gal4BD C-端融合效果較好，這可能是因為RuvC-1位于Cas9 N-端且N-端的完整性對Cas9的核酸酶活性至關重要[11]。為了降低Gal4BD融合對Cas9活性的影響，本研究采用了兩類不同的柔性linker，即不同長度的GGSn和全長及截短的XTEN。雖然最終確認了相對較優的GGS5和XTEN1，但不同linker鏈接的Cas9-Gal4BD融合均對Cas9的表達及活性均造成了一定程度的影響。這可能與Cas9蛋白較大、空間結構折疊容易受到影響有關。在后續相關研究中可以嘗試比較更多類型及不同長度的linker以降低融合蛋白對Cas9活性的影響。在BS-dsDNA供體的優化過程中，本研究發現單個BS序列添加在dsDNA 5′-端的效果較好，推測dsDNA供體的3′-游離端有助于同源重組，非同源BS的額外添加反而不利于重組，但該假設仍有待進一步探討。

此外，課題組也注意到了預實驗中HKE293T- HDR.GFP報告細胞系的驗證結果與后續優化過程中的HDR報告載體實驗及基因組編輯結果并不呼應，這可能與報告細胞系的質量、供體長度改變、融合linker優化以及后續檢測手段不同等因素有關。在報告細胞系驗證實驗中，dsDNA供體長度為100 bp和60 bp時的HDR效率有所提高。推測修復模版較短時，可能存在效率較HDR高的微同源末端鏈接(microhomology-mediated end joining, MMEJ)修復，故提升效果明顯。但CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS能否有效提高長dsDNA供體的HDR效率尚有待商榷。由于HKE293T-HDR.GFP報告細胞系是一個轉基因細胞混池，基因型背景不清晰，存在著一定的不確定因素，課題組后續放棄了使用該細胞系進行優化研究。另鑒于較短的dsDNA供體不能介導基因敲入，其應用前景有限，且與ssDNA供體相比HDR效率相對較低，后續優化研究及內源基因編輯均采用了長dsDNA供體，以期應用于基因大片段敲入研究。在進一步的內源基因編輯實驗中，盡管利用CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS在和位點實現了編輯效率的提高，但仍需在更多類型的細胞中針對更多基因組位點進行適用性驗證。另外，通過藥物瞬時篩選富集基因點編輯細胞后進行RFLP分析的檢驗方法具有一定的局限性，受細胞篩選、基因組提取、PCR及酶切等過程的影響，存在著一定的干擾因素。鑒于CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS所采用的dsDNA供體主要優勢在于基因大片段敲入，后續研究可采用熒光或抗性基因敲入的策略并優化下游檢測手段，更嚴謹地論證該系統的可行性。

圖4 CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS介導的基因精確編輯

A：以基因座為例的基因編輯設計及檢測示意圖，其中一條PCR檢測引物設計在dsDNA供體模版之外；B：RFLP實驗檢測HDR編輯效率的瓊脂糖凝膠電泳結果，PCR產物及酶切后片段大小(bp)為：，1274=1087+187；，2147=1087+1060；，2186=1105+1081；C：基于RFLP實驗DNA條帶灰度分析的HDR編輯效率檢測結果。數據以平均值±SD表示，=3，*：<0.05。

在本研究開展前后，多種以相似設計理念改進的CRISPR/Cas9 DAS被相繼報道(表2) 。其中，Cas9-SNAP/O6-BG-ssDNA系統以SNAP-Tag作為適配配體，以O6-芐基鳥嘌呤(BG)作為“受體”修飾ssDNA供體[9]。Cas9-Avidin/Biotin-dsDNA系統[10]將與Cas9蛋白融合的親和素作為適配配體，同時將生物素作為適配“受體”與PCR獲得的dsDNA供體進行化學偶聯。Cas9-Avidin/Biotin-ssDNA系統[11]與Cas9-Avidin/Biotin-dsDNA系統類似，但采用了長ssDNA供體(～1000 nt)。另一個sgRNA-S1m.Avidin/ Biotin-ssDNA系統[12]采用了新穎的sgRNA導向策略，該系統將親和素特異性結合序列(S1mRNA)與sgRNA融合，作為驅動鏈霉親和素/生物素-ssDNA供體的接頭部分。該系統增加了供體和sgRNA設計的復雜程度，且ssDNA供體需要與生物素–鏈霉親和素偶聯，理論上并不實用。ssDNA供體與dsDNA供體介導的DNA修復機制有所不同，前者具有重組效率高、操作簡單方便等優點，但是長ssDNA供體制備相對困難、價格昂貴、不穩定且容易降解。因此，基因編輯研究中多使用長度小于120 nt的短ssDNA供體進行點編輯，而大片段基因敲入研究仍受限于相對偏低的dsDNA供體重組效率。

表2 目前已報道的CRISPR/Cas9 DAS系統

Linker，一段短肽鏈用于連接Cas9蛋白和適配器。S1m*，一段與sgRNA連接的用于連接鏈霉素親和素的RNA序列。MW，分子量。

與本研究思路類似，在最新的報道中不同的dsDNA結合蛋白也被用于開發新型CRISPR/Cas9 DAS。對于這些DAS，通?？梢酝ㄟ^PCR便捷地獲得BS-dsDNA供體，并且可以通過重組DNA技術以質粒的形式組裝大型供體進而介導復雜的基因編輯。在Cas9-THAP11/THAP11.BS-dsDNA系統中，將滅活的轉錄因子THAP11與Cas9 C-端融合[15]，可以提高HDR敲入效率2倍。Cas9-N57/N57.BS-dsDNA系統[16]采用了來自睡美人轉座子SB100X的N57 DNA結合域，該系統具有上述相似的供體適配特征，但使用了非同源依賴靶向整合(homology-in-dependent targeted integration，HITI)供體[51]，可以在分裂和非分裂細胞中提高靶向敲入效率。

最后，值得注意的是滅活的轉錄因子THAP11、轉座酶SB100X的N57 DNA結合域和本研究使用的酵母源Gal4BD長度分別為105 aa、57 aa和146 aa，均遠小于Cas9蛋白(1368 aa)。此外，Cas9-N57系統采用了HITI供體進行非同源依賴靶向基因敲入，表明CRISPR/Cas9 DASs能夠同時適用于HDR和HITI介導的基因編輯。在BS-dsDNA供體方面，Cas9- Gal4BD系統和Cas9-THAP11系統具有更短BS (17 bp和19 bp)的相對優勢。

綜上所述，本研究開發了一種新型提高HDR效率的CRISPR/Cas9-Gal4BD供體適配基因編輯系統，并在Cas9-Gal4BD融合表達和BS-dsDNA供體設計方面進行了優化。最終利用優化后的CRISPR/ Gal4BD-Cas9 DAS實現了對和位點的HDR增強編輯，為進一步利用該系統進行動物分子設計育種研究提供了參考和借鑒。

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A CRISPR/Cas9-Gal4BD donor adapting system for enhancing homology-directed repair

Xiaojun Zhang, Kun Xu, Juncen Shen, Lu Mu, Hongrun Qian, Jieyu Cui, Baoxia Ma, Zhilong Chen, Zhiying Zhang, Zehui Wei

The fast-rising CRISPR-derived gene editing technologies has been widely used in the fields of life science andbiomedicine, as well as plant and animal breeding. However, the efficiency of homology-directed repair (HDR), an important strategy for gene knock-in and base editing, remains to be improved. In this study, we came up with the term Donor Adapting System (DAS) to summarize those CRISPR/Cas9 systems modified with adaptor for driving aptamer-fused donor DNA. A set of CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS was designed in our study.In this system, Gal4 DNA binding domain (Gal4BD) is used as adaptor to fuse with Cas9 protein, and Gal4 binding sequence (Gal4BS) is used as aptamer to bind to the double-stranded DNA (dsDNA) donor, in order to improve the HDR efficiency. Preliminary results from the HEK293T-HDR.GFP reporter cell line show that the HDR editing efficiency could be improved up to 2-4 times when donor homologous arms under certain length (100-60 bp). Further optimization results showed that the choice of fusion port and fusion linker would affect the expression and activity of Cas9, while the Cas9-Gal4BD fusion with a GGS5 linker was the prior choice.In addition, the HDR efficiency was likely dependent on the aptamer-dsDNA donor design, and single Gal4BD binding sequence (BS) addition to the 5′-end of intent dsDNA template was suggested. Finally, we achieved enhanced HDR editing on the endogenousandsites by using the CRISPR/Gal4BD-Cas9 DAS, which we believe can be applied to facilitate animal molecular design breeding in the future.

CRISPR/Cas9; gene editing; donor DNA; donor adapting; homology-directed repai

2022-04-05;

2022-05-11;

2022-05-23

國家自然科學基金項目(編號：32172736)，陜西省重點研發計劃項目(編號：2021NY-027)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 32172736), and the Shaanxi Key R&D Program (No. 2021NY-027)]

張瀟筠, 在讀碩士研究生，專業方向：動物生物技術。E-mail: mshn15@163.com

魏澤輝，博士，副教授，研究方向：動物分子設計育種，E-mail:weizehui7848@163.com

徐坤，博士，副教授，研究方向：動物基因編輯技術，E-mail: xukunas@nwafu.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-118

(責任編委: 谷峰)