保護性耕作對黑土不同土層土壤固氮菌豐度和群落結構的影響

李猛，李海瑜，高明

(中國科學院 東北地理與農業生態研究所，海倫農田生態系統國家野外科學觀測研究站，黑龍江 哈爾濱 150081)

0 引 言

黑土是我國農作物生產最重要的土壤資源之一，在保障國家糧食安全方面發揮著至關重要的作用[1]。然而，由于過度耕作，黑土已經嚴重退化，導致土壤侵蝕和有機質流失[2]。保護性耕作措施可以改善土壤結構，保持水土，增加土壤養分水平，提高作物水分利用率和增加作物產量，是防止土壤退化的一種有效方法，通常被視為未來可持續的耕作方式。因此，采取保護性耕作制度來維持東北地區的土壤生產力非常必要。

土壤氮素循環影響著土壤生態系統的生產力和可持續性。由于氮循環過程幾乎都是依靠微生物介導的氧化還原反應完成的，因此土壤微生物在土壤氮循環中起著非常重要的作用[3]。其中，nifH基因是編碼固氮酶的一個亞基，為研究固氮菌的分布和多樣性提供了一個有用的途徑。對土壤中nifH基因多樣性的研究揭示了多種未知固氮菌的基因序列類型[4-7]。有數據表明，這些固氮菌在許多土壤系統中有著重要的作用，是主要的固氮微生物[8,11]。保護性耕作增加了土壤微生物豐度以及微生物多樣性[12-14]。一些研究表明，保護性耕作增加了固氮菌群落的多樣性，耕作方式和土壤深度的交互作用改變了其組成[12-18]。例如，Hsu和Buckley[15]研究表明，免耕制度下固氮菌對氮的固定效率的影響要強于土壤理化性質的改變；趙有翼等[19]認為免耕秸稈覆蓋提高了氨化細菌、硝化細菌及自身固氮菌數量，且隨著土層的加深，種植小麥土壤中的氨化細菌數量比免耕不覆蓋處理增加。同時，土壤理化屬性與土壤微生物活性密切相關[20-21]。Calderoli等[13]通過測序對阿根廷的潘帕斯草原土壤研究結果表明，土壤穩定性和土壤有機碳對nifH固氮菌功能有一定影響。適宜的土壤pH和高含量的土壤碳為固氮菌群落提供了更為理想的生存環境[22-23]。

然而，關于保護性耕作對東北黑土區固氮菌群落結構和多樣性的影響尚不明確。本研究利用15年免耕和傳統耕作試驗，采用高通量測序方法，探討東北地區免耕和傳統耕作條件下0～5 cm和5～20 cm兩個土壤深度的固氮菌群落的豐度、多樣性和組成的差異，解析東北黑土保護性耕作條件下固氮菌的群落結構特征及其與土壤理化性質的關系，研究結果將有助于增強保護性耕作對黑土保育的理論體系，為未來通過調控固氮微生物、優化保護性耕作效果提供探索的途徑。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

本研究依托中國科學院海倫農田生態系統(N47°26′，E126°38′)長期定位實驗站(簡稱海倫站)。海倫站始建于1978年，2005年成為國家野外科學觀測研究站，地處我國東北黑土帶的中心區域，也是中國生態系統研究網絡(CERN)最北端的生態站，是農業資源、環境和生態多學科的綜合研究基地。海倫站海拔240 m，處于溫帶大陸性季風氣候區，夏季高溫多雨，冬季寒冷干燥，年平均氣溫1.5～2.9 ℃，年平均降雨量500～600 mm，主要集中在5～9月，年平均有效積溫(≥10 ℃)2 400～2 500 ℃，年平均日照時數2 600～2 800 h，無霜期120～130 d。

1.2 試驗設計

海倫站的保護性耕作試驗設置于2004年，包括免耕和傳統耕作兩種耕作制度，每種耕作制度設有3個重復，采用完全隨機區組設計。每個地塊的面積為8.4 m×40 m，用0.7 m的緩沖帶與其他地塊隔開，大豆(Glycinemax)和玉米(Zeamays)輪作。免耕處理(NT)只收獲作物種子，其他所有生物量都均勻覆蓋在整個地塊表面。每年5月初，作物(玉米或大豆)用免耕播種機播種，土壤保持原樣，不使用任何耕作措施。傳統耕作(CT)是所有地上生物量在10月份收獲后被移除，然后采用旋耕整地，深度為20 cm，起壟高度為15 cm。下一年在5月初用傳統的播種機種植，中耕起壟兩次。除耕作作業外，免耕和傳統耕作的其他管理都一樣。玉米每年施氮(N)138 kg·hm-2，磷(P2O5)51.75 kg·hm-2，鉀(K2O)15 kg·hm-2，大豆每年施氮(N)20.25 kg·hm-2，磷(P2O5)51.75 kg·hm-2，鉀(K2O)15 kg·hm-2。

1.3 樣品的采集與分析

2018年夏季，分別從免耕和傳統耕作0～5 cm和5～20 cm土層深度采集土壤樣品，每個處理3個重復，其中每一土層的樣品是由隨機選取并混合均勻的六個樣點組成的復合樣品。將采集后的樣品放在無菌塑料袋里，置于冰盒內運送到實驗室。到達實驗室后，移除可見的植物殘體和石子，過2.0 mm的篩子，之后將樣品平均分成3部分，一部分風干樣品和一部分鮮樣用來測定土壤基礎物理、化學和生物學性質，另外部分放在-80 ℃冰箱存儲以備進一步提取土壤DNA。

1.4 土壤理化性質測定

1.5 土壤DNA提取，固氮菌nifH基因的熒光定量PCR和Illumina Miseq高通量測序

基于Fast DNA?SPIN Kit(MOBIO PowerSoil DNA Isolation Kit)試劑盒來提取DNA。使用NanoDrop(Thermo Scientific,Wilmington,USA)測量DNA數量和質量。從土壤中提取的DNA的置于-20 ℃冰箱用于下一步分析。

采用引物nifH-F(5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′)與nifH-R(5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′)對固氮菌nifH基因進行熒光定量PCR測定[27]。具體擴增程序和PCR反應體系為：在95 ℃下變性10 min，40個循環，變性：95 ℃，5 s；退火：50 ℃，30 s；延伸：72 ℃，40 s。對固氮菌nifH采用上述引物進行高通量測序，PCR反應混合物包括：15 μL 1×SYBR預混劑Ex Taq，每種引物0.25 μL，4 μL dNTPs(2.5 mmol)和1 μL DNA模板50 ng。PCR產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳。

將每個樣品的擴增子進行組合、純化、定量，然后使用MiSeq PE300委托上海美吉生物醫藥公司(Majorbio Bio-TecCo.Ltd)進行高通量測序。用QIIME version 1.9.1軟件處理序列質量，通過UCHIME算法刪除修剪后的序列，用UPARSE將剩余的樣本讀數以97%的相似性對序列進行OTU劃分。

1.6 統計分析方法

基于Chao 1指數和Shannon指數描述固氮菌群落的α多樣性。不同處理的Chao 1指數和Shannon指數差異采用One-way ANOVA方法分析，nifH基因的拷貝數和多樣性的交互作用使用Two-way ANOVA方法分析，用SPSS 18.0軟件統計完成。土壤固氮菌的群落結構用Bray_curtis距離矩陣的PCA分析，nifH基因的拷貝數、多樣性和土壤理化性質的相關性采用Pearson相關性進行分析。Mantel test在R(Version 3.5.0)軟件的vegan數據包中完成，用來檢驗土壤固氮菌群落與理化性質之間的相關性。

2 結果與分析

2.1 免耕對土壤固氮菌豐度和群落組成的影響

免耕和傳統耕作下，nifH基因的豐度范圍為0.73×106～1.81×106copies·g-1dry soil。耕作和土壤深度對nifH基因拷貝數沒有顯著影響(圖1)。本試驗從所有樣品中獲得516 549條優化序列，平均長度386 bp。獲得的數據在97%相似性水平上進行分類，檢測得到了7個門，12個綱，18個目，23個科，32個屬的4 280個OTU。土壤微生物組數據集已保存在NCBI中，登錄號為PRJNA777296。

門水平上，變形菌門和未分類k__norank_d__Bacteria細菌的相對豐度占固氮菌群落的99%。屬水平上，慢生根瘤菌屬和未分類變形菌的相對豐度占固氮菌比例最大，分別占50.6%～69.0%和13.0%～24.5%，其次是未分類細菌屬(7.4%～10.1%)和地桿菌屬(0.8%～8.8%)(圖2)。慢生根瘤菌屬在所有處理中無顯著差異(P=0.639)。

注：NT5代表免耕0～5 cm深度;NT20代表免耕5～20 cm深度;CT5代表傳統耕作0～5 cm深度;CT20代表傳統耕作5～20 cm深度。下同。Note:NT5,no tillage at soil depths of 0～5 cm;NT20,no tillage at soil depths of 5～20 cm;CT5,conventional tillage at soil depths of 0～5 cm;CT20,conventional tillage at soil depths of 5～20 cm.The same is as below.圖1 固氮菌基因豐度對耕作和土壤深度的響應Fig.1 Soil nifH gene abundance response to tillage and soil depth

圖2 耕作和土壤深度對土壤固氮菌屬水平上相對豐度的影響Fig.2 Effects of tillage and soil depth on relative abundance of soil diazotrophic community at genus level

2.2 免耕對土壤固氮菌群落多樣性的影響

Chao 1和Shannon指數用于了解固氮菌群落的多樣性[23]。本研究中，Chao 1和Shannon在所有處理中都沒有顯著差異(圖3)。Chao 1和Shannon指數也未受到耕作、土壤深度及其交互作用的影響(圖3)。采用PCA分析了所有樣品的組成分布，PC1軸和PC2軸分別可以解釋總方差的36.91%和12.96%(圖4)。免耕和傳統耕作對土壤固氮菌群落組成有顯著影響(r=0.429，P<0.001)。

圖3 土壤固氮菌群落多樣性指數對耕作和土壤深度的響應Fig.3 Soil diazotrophic community diversity indices response to tillage and soil depth

圖4 土壤固氮菌群落組成的PCA分析Fig.4 Soil diazotrophic community composition indicated by principal co-ordinates analysis

2.3 土壤固氮菌群落與土壤理化性質的關系

本研究顯示，所有土壤理化特征與nifH基因拷貝數、Chao 1和Shannon指數都沒有顯著相關性(圖5)，這一結果與先前的研究結果即耕作和土壤深度對nifH基因豐度、Chao 1和Shannon沒有顯著影響相吻合(圖3)。土壤容重與PC1顯著相關(圖5)，同時Mantel test檢驗也表明，固氮菌群落與土壤容重顯著相關(表1)。因此，土壤性質可能主要影響固氮菌群落的構成。本試驗的研究結果強調了土壤容重對免耕系統中固氮菌群落的重要性。

表1 土壤固氮菌群落與土壤理化屬性Mantel test分析Table 1 Mantel test analysis between soil diazotrophic community and soil properties

注：SOC代表土壤有機碳;DOC代表可溶性碳;TN代表總氮;TP代表總磷;AP代表有效磷;TK代表全鉀;AK代表速效鉀；BD代表容重；顯著相關(**代表P<0.01;*代表P<0.05)。Note:SOC indicates soil organic carbon;DOC indicates dissolved organic carbon;TN indicates total nitragen;TP indicates total phosphorus;AP indicates available phosphorus;TK indicates total potassium;AK indicates available potassium;BD indicates bulk density.Significant correlations (** indicates P<0.01;* indicates P<0.05).圖5 土壤理化屬性與固氮菌群落的相關性Fig.5 Correlation between diazotrophic community and soil properties

3 討 論

土壤氮轉化過程需要很多功能微生物的參與，這些功能微生物對土壤氮素的轉化具有一定的調控作用。固氮菌將大氣中氮氣轉化為生物可利用形態氮。植被種類、火燒、土壤氮含量和秸稈還田都會影響土壤固氮菌的組成[28-30]。免耕秸稈還田可以通過對土壤水分和溫度的影響來調控氮的固定，也可以提高一些作物的固氮率[31-32]，增加土壤中的nifH基因豐度[33]，并改變固氮菌的群落結構。本研究結果顯示，免耕和傳統耕作對土壤固氮菌群落的組成有顯著影響(圖4)。Hsu和Buckley[15]在長達30多年的長期定位試驗研究表明，保護性耕作和秸稈還田共同影響土壤固氮菌群落變化。同時，Calderoli等[13]的研究表明，在粉質土壤中，保護性耕作和土壤深度共同影響土壤固氮菌群落的組成，這也證明了本試驗的結論，這可能是由于免耕加秸稈還田改變了不同土壤深度的固氮菌生活所需的底物分布狀況導致的。有研究表明，nifH基因群落的豐度和多樣性主要受某些土壤理化屬性驅動[13,28]。土壤pH對固氮菌群落結構有顯著影響，而較低的pH不利于土壤固氮[8,16,31]。有研究表明，土壤氮含量影響固氮菌群落的結構[34-36]。氮的有效性既可以具有刺激作用，也可以具有抑制作用[8,37]。土壤有機碳增加了土壤固氮菌群落的豐度、多樣性和活性，不穩定碳含量的增加通常會加速氮的固定，這可能是因為環境中較多的可利用碳對固氮菌的生長有良好的促進作用[38-40]，但也有研究證明沒有效果[41-42]。然而，在本研究中，土壤碳和氮對固氮菌群落沒有顯著影響，這可能是因為東北黑土具有較高的碳氮含量，導到碳并未成為固氮菌生存的限制因子。本研究中，土壤容重與PC1具有顯著相關性(圖5)。同時Mantel test檢驗表明固氮菌群落與土壤容重呈顯著相關關系(表1)。土壤容重可以反映土壤的結構以及透氣性、透水性和保水能力，在一定程度上影響了土壤微生物的群落組成[43-44]。前人研究表明，土壤微生物種群與土壤容重呈負線性關系[45]，這些結果也證實了本研究的發現，即土壤容重與微生物種群密切相關[46]。土壤容重顯著影響固氮菌群落可能是因為nifH群落占據的生態位是以水分和孔隙大小的波動為特征的[13]。本研究結果強調了土壤容重對免耕系統中固氮菌群落的重要性。本試驗針對土壤固氮菌群落的研究只限于nifH基因，今后可用宏基因組學的方法對整個固氮基因家族進行研究。

4 結 論

本研究表明免耕和傳統耕作下土壤固氮菌在門水平上變形菌門的相對豐度最大。屬水平上慢生根瘤菌屬的相對豐度最大，其次是未分類細菌屬和地桿菌屬。耕作處理未對慢生根瘤菌屬產生顯著影響。耕作、土壤深度對nifH基因拷貝數、Chao 1和Shannon指數均無顯著影響，PCA分析表明免耕和傳統耕作對土壤固氮菌群落的組成有顯著影響。所有土壤理化特征與nifH基因拷貝數、Chao 1和Shannon指數均未達到顯著相關性，土壤容重與PC1呈顯著相關關系。Mantel test檢驗表明固氮菌群落與土壤容重顯著相關。本研究表明保護性耕作通過影響土壤容重改變了土壤固氮菌的群落組成。