沙利度胺抑制腫瘤細胞分泌VEGF/bFGF機制的探討*

黃海寧， 汪 匯， 龍超良， 張 浩,△， 汪 海,3,△

(1. 濟寧醫學院附屬醫院， 山東 濟寧 272029； 2. 北京賽德維康醫藥研究院， 北京 100039； 3. 江蘇師范大學健康科學學院， 徐州 221116； 4. 中國人民解放軍總醫院， 北京 100853)

沙利度胺(thalidomide，Thal)又稱反應停，化學名為α-酞胺哌啶酮，在1950年被德國藥物公司首先合成并作為一種鎮靜劑上市，后來由于沙利度胺能緩解妊娠期婦女的嘔吐癥狀而被用于孕婦早期嘔吐，但是很快發現沙利度胺有嚴重的致畸作用，造成大面積的畸形兒童的產生。因此，該藥物在1961年撤出市場[1]。然而，沙利度胺致畸作用的機制引起了科學家們的極大興趣，并進行了大量的研究，發現了其重要的生物學作用，如抗血管生成[2-4]、抗炎[5]、免疫調節[6]和氧化應激[7, 8]， 2006年美國FDA批準其用于多發性骨髓瘤的治療，在近幾年其在實體瘤的臨床治療中也取得了很好的成效[9, 10]。但沙利度胺的抗腫瘤作用機制尚不明確，有研究指出沙利度胺可能因抑制腫瘤血管新生從而抑制惡性腫瘤的轉移及生長。

2010年，Takumi等人發現CRBN是沙利度胺結合蛋白，沙利度胺通過與CRBN結合并抑制相關的泛素連接酶活性來啟動致畸作用，由此得出CRBN是沙利度胺致畸作用的主要靶點[11]。然而，CRBN是否參與調控沙利度胺抑制腫瘤血管生成罕見報道。腫瘤細胞分泌的VEGF和bFGF被認為是最重要的血管生成因子，可以啟動腫瘤血管生成從而促進實體腫瘤的生長和轉移[12-14]。本研究利用載體構建技術構建CRBN-shRNA干擾質粒敲低A549和HepG2細胞中CRBN，探討CRBN對沙利度胺抑制A549細胞及HepG2細胞分泌的VEGF和bFGF的影響，并進一步研究其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人肺腺癌A549細胞及人肝癌HepG2細胞購于美國 ATCC公司；DMEM培養基及胎牛血清購于美國HyClone Laboratory公司；沙利度胺由北京賽德維康醫藥研究院合成并提供，用二甲基亞砜 (DMSO)配制成100 mmol/L的母液并儲存在-20℃冰箱中以備用，為了保證含DMSO≤1‰，在使用前需用DMEM培養基稀釋1 000倍；TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司；SYBR Green Real-time PCR Master Mix Plus和qPCR RT Master Mix購于日本 TOYOBO 公司；限制性內切酶和DNA聚合酶購于日本TaKaRa公司；轉染所用的試劑購于北京威格拉斯公司；RNA干擾引物由Damacon公司設計；bFGF和VEGF ELISA試劑盒購于武漢博士德生物技術公司。

1.2 MTS實驗檢測細胞增殖活力

將A549細胞及HepG2細胞用10%FBS的DMEM培養基制成5×104cells/ml的細胞混懸液，每孔加入100 μl細胞混懸液于96孔板中，隨機分為含1‰DMSO的l00 μl培養基的空白對照組，1 、10、50、100、500 μmol/L的沙利度胺組，每組設置3個復孔。將加入藥物的96孔板放入培養箱中培養48 h，每孔加入20 μl MTS，放在酶標儀上，調整到490 nm測吸光度 (A)值，計算方法參照文獻[15]，用抑制率(inhibition ratio，IR)間接表示藥物對細胞增殖活力的影響，其計算公式如下：

IR(%)=(A空白-A藥物)/A空白×100%

1.3 構建shRNA穩定敲低CRBN的腫瘤細胞株

1.3.1 CRBN短發夾RNA (short hairpin RNA, shRNA)慢病毒載體的構建 登錄GenBank數據庫獲取人CRBN基因序列，利用Damacon公司的shRNA靶序列分析軟件針對靶序列設計RNA干擾引物，針對的靶序列：5’- CGCTGGCTGTATTCCTTATAT-3’；熒光素酶(luciferase) shRNA(對照組)的靶序列為：5’- CTTCGAAATGTCCGTTCGGTT-3’。將合成好的正義鏈與反義鏈RNA干擾引物置于1/10 TE(Tris鹽酸和EDTA的混合液)分開溶解，按照等比例混勻后以90℃加熱3 min，待降溫至37℃后便得到雙鏈的寡核苷酸；shRNA慢病毒表達載體(pLKO)用限制性內切酶EcoR I和Age I進行雙酶切后，跑膠并回收目的片段，回收產物與前面退火得到的引物進行連接，通過大腸桿菌DH5α感受態細胞轉化，挑取單克隆，送至北京華大生物技術公司測定基因序列。

1.3.2 CRBN shRNA慢病毒表達載體的包裝 將HEK293T細胞接種于6孔板中(轉染時細胞密度約為80%)，第2日包裝前1 h更換新鮮的完全培養基，然后用磷酸鈣轉染法將已克隆好的CRBN shRNA序列的慢病毒表達載體和相應的病毒包裝質粒(慢病毒shRNA表達載體1.25 μg，PLP1 1 μg，PLP2 0.5 μg和VSVG 0.7 μg)共同轉染到293T細胞中，6 h后更換新鮮培養基，轉染36 h后收集包含病毒的上清，4℃ 3 000 r/min的離心10 min，離心好的病毒上清于-80℃保存備用。

1.3.3 獲取穩定表達CRBN shRNA 腫瘤細胞株 A549及HepG2細胞經胰酶消化后，取2×105cells/well于6孔板中，加入100 μl病毒上清和終濃度8 μg/ml的聚凝胺(Polybrene)，實驗分為CRBN shRNA組(相應病毒上清+Polybrene)、luciferase shRNA組(相應病毒上清+Polybrene)，6 h后換液，24 h后加入2 μg/ml的嘌呤霉素(puromycin)，3 d后觀察空白對照細胞狀態(理論上應該全部死亡)，此時將CRBN shRNA和luciferase shRNA組中存活的細胞傳代培養，獲得穩定整合可表達CRBN shRNA及luciferase shRNA慢病毒載體的混合細胞克隆，隨后分別提取2種細胞RNA及總蛋白進行進行實時定量PCR及Western blot檢測其轉染效果。

1.4 實驗設計

將 A549細胞及HepG2細胞按照 3×105cells/well接種到6孔板中，隨機分為以下幾組，將A549細胞分為陰性對照組(A549luciferase)、CRBN低表達組(A549CRBN)；HepG2細胞分為陰性對照組(HepG2luciferase)、CRBN低表達組(HepG2CRBN)，放入37℃，5%CO2的培養箱中培養24 h后，更換培養液，分別加入1 ml含100 μmol/L沙利度胺(thalidomide組)和1 ml 1‰ DMSO(control組)的培養液，繼續培養24 h再行后續實驗，每組設計3個復孔。

1.5 Western blot 檢測蛋白表達

取A549luciferase細胞、A549CRBN細胞、HepG2luciferase細胞及HepG2CRBN細胞，分別加200 μl RIPA裂解液，冰上裂解30 min，收集上清液。使用BCA法測定蛋白濃度，每個樣品取50 μg總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳。利用半干轉膜法將細胞蛋白轉至PVDF膜，將膜置于5 %脫脂奶粉封閉1 h，加入稀釋過的一抗4℃過夜，TBST洗膜后，加入HRP標記的二抗孵育1 h。TBST洗膜后再加入ECL發光液進行顯影并拍照。采用Image J軟件分析蛋白相對灰度值，以β-actin為內參計算蛋白表達相對量，所有實驗獨立重復3次。

1.6 實時定量PCR (Real-time PCR)檢測基因表達

采用 TRIzol試劑盒提取各組的總RNA，參照試劑盒說明書反轉錄成cDNA，每個樣品重復三次，引物見下表1。依照2-△△Ct法計算基因表達水平，△△Ct=(Ct目標基因-Ct內參基因)樣品組-(Ct目標基因-Ct內參基因)對照組。

Tab. 1 Sequences of primers for real-time PCR

1.7 ELISA檢測蛋白表達

收集按照上述分組進行干預的各組細胞上清液，各取100 μl加入抗體包被的96孔板中，37℃反應90 min，甩去液體，將提前稀釋好的抗體100 μl/well加入96孔板中，37℃ 60 min。用PBS洗滌1 min/3次，將在37℃預熱的ABC工作液100 μl/well加入，37℃30 min。再用PBS洗滌1 min/5次，加入90 μl/well的顯色液，放入37℃培養箱內避光反應20～25 min，再加入100 μl/well終止液，在酶標儀450 nm中測定吸光度(OD)值，每個實驗樣品重復3次。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 MTS法檢測沙利度胺對細胞增殖活力的影響

1、10、50、100和500 μmol/L沙利度胺對細胞增殖的抑制率見表2。與空白對照組比較， 500 μmol/L沙利度胺能顯著抑制 A549及HepG2 細胞的增殖活力(P<0.05)，而其它濃度對細胞增殖無顯著抑制作用，該結果與報道一致。

Tab. 2 The inhibition rate of thalidomide on A549 and HepG2 cells at different n=3)

2.2 獲得穩定敲低CRBN 的A549及HepG2細胞

運用慢病毒介導的 shRNA方法(pLKO shRNA 質粒)，構建敲低CRBN的A549CRBN及HepG2CRBN細胞。Real-time PCR及Western blot法檢測其敲低效果，與A549luciferase及HepG2luciferase細胞比較，A549CRBN及HepG2CRBN細胞的CRBN 基因水平顯著降低(P<0.01，表3)，蛋白表達水平也顯著降低(P<0.01，圖1)。

Tab. 3 The expression levels of CRBN mRNA determined by real-time n=3)

Fig. 1 Proteinexpressions of CRBN detected by Western blot n=3)

2.3 敲低CRBN對A549及HepG2細胞VEGF和bFGF表達的影響

與A549luciferase及HepG2luciferase比較， A549CRBN及HepG2CRBN組VEGF和bFGF的mRNA及蛋白表達水平明顯降低 (P<0.05，表4，5)，表明CRBN與VEGF或bFGF表達同步下調。

Tab. 4 Effects of CRBN on the expressions of VEGF and bFGF at the mRNA level n=3)

Tab. 5 Effects of CRBN on the expressions of VEGF and bFGF at the protein level (pg/ml， n=3)

2.4 CRBN調控沙利度胺抑制細胞VEGF和bFGF的表達

沙利度胺抑制A549和HepG2細胞VEGF、bFGF的表達，當敲低CRBN后，抑制作用消失 (P< 0.05，表6，7)，說明沙利度胺對A549或HepG2細胞中VEGF和bFGF表達的影響是由CRBN調控的。

Tab. 6 Effects of thalidomide on the expressions of VEGF at the mRNA level regulated by n=3)

Tab. 7 Effects of thalidomide on the expressions of VEGF at the protein level regulated by CRBN(pg/ml, n=3)

2.5 敲低CRBN對VEGF和bFGF轉錄因子(c-Jun)基因表達的影響

c-Jun是VEGF和bFGF共同的轉錄因子。為了確定CRBN對c-Jun表達的影響，我們檢測了c-Jun的mRNA表達水平。結果表明，在A549細胞及HepG2細胞中，敲低CRBN c-Jun mRNA的表達水平降低 (P<0.05，表8)，表明CRBN和c-Jun的表達同步下調。

Tab. 8 The expressions of c-jun mRNA detected by real-time n=3)

2.6 CRBN調控沙利度胺抑制c-Jun的表達

沙利度胺處理A549細胞及HepG2細胞48 h后，在mRNA水平上檢測c-jun的表達。沙利度胺抑制VEGF和bFGF轉錄因子c-jun的mRNA轉錄水平，敲低CRBN，在HepG2細胞中沙利度胺對c-jun的抑制作用消失 (P<0.05，表9)，而在A549細胞中抑制作用反而增強，提示c-Jun可能是HepG2細胞中介導沙利度胺抑制VEGF和bFGF的轉錄因子之一。

Tab. 9 Effects of thalidomide on the expressions of c-jun at the mRNA level regulated by n=3)

3 討論

腫瘤細胞分泌的VEGF和bFGF是最重要的血管生成因子，臨床和動物實驗結果顯示，沙利度胺可下調骨髓瘤細胞、食管癌細胞和肺癌細胞中VEGF和bFGF的表達[16-18]。這些結果表明，沙利度胺的抗腫瘤活性可能部分通過調控腫瘤細胞中VEGF和bFGF的表達來實現，但沙利度胺調控VEGF和bFGF的分子機制尚不清楚。

本研究采用RNA干擾技術敲低A549及HepG2細胞中CRBN的表達，探討沙利度胺對敲低CRBN的 A549細胞及HepG2細胞分泌VEGF/bFGF的影響。本研究顯示100 μmol/l沙利度胺對A549細胞的增殖沒有明顯的抑制作用，也就是說沙利度胺在該濃度下不影響細胞的增殖能力，排除沙利度胺通過抑制細胞增殖來降低VEGF/bFGF的表達。接下來我們的研究發現，在A549和HepG2細胞中，VEGF和bFGF的分泌與CRBN的表達顯著相關，而CRBN的下調可以顯著降低VEGF和bFGF的表達。沙利度胺可抑制A549和HepG2細胞中VEGF和bFGF的表達[10]，這與我們的結果是一致的，而敲低CRBN后對A549和HepG2細胞中VEGF和bFGF的表達的抑制作用消失，表明CRBN在沙利度胺抑制A549和HepG2細胞分泌VEGF/bFGF中發揮重要作用。沙利度胺對血管生成因子的影響是抗血管生成的觸發因子，可影響血管內皮細胞的增殖和遷移。前期研究表明沙利度胺可能通過CRBN抑制A549細胞的遷移[19]。

c-Jun是VEGF和bFGF的共同的轉錄因子[20]。沙利度胺同時抑制VEGF和bFGF的分泌，它們是否受到其共同的轉錄因子的調控？因此，我們下一步研究的重點是探討沙利度胺對c-Jun的影響。結果表明在HepG2和A549細胞中，沙利度胺都能抑制c-jun的mRNA轉錄水平，并且敲低CRBN后c-jun表達都降低，但是只有在HepG2細胞中，敲低CRBN，沙利度胺對c-jun的抑制作用消失，因此HepG2細胞中，c-Jun可能是CRBN介導沙利度胺抑制VEGF和bFGF的轉錄因子之一。

綜上所述，沙利度胺抑制A549和HepG2細胞中VEGF和bFGF的分泌與CRBN有關，在HepG2細胞中，c-jun可能是CRBN介導沙利度胺抑制VEGF和bFGF表達的關鍵轉錄因子之一。這一發現提示CRBN可能是沙利度胺抑制VEGF/bFGF分泌的潛在靶點，但CRBN如何介導沙利度胺抑制VEGF/bFGF分泌的機制及其下游信號通路有待進一步研究，研究結果為沙利度胺抑制腫瘤血管生成因子提供新的思路。