不同產地的貝母中主要生物堿的含量比較及其毒性評價

李小平， 陳渝珂， 朱 明

（1.蘇州農業職業技術學院，江蘇蘇州 215008；2.上海中醫藥大學，上海 201210）

貝母藥材來源于百合科貝母屬數種植物的干燥鱗莖，始載于《神農本草經》，列為中品，自唐代以后，以貝母屬植物作為中藥貝母正品一直沿用至今。川貝母和浙貝母為大宗藥材，野生川貝母逐年減少，造成其市場價格昂貴，混偽品繁多。2020年版中國藥典收載有川貝母、伊貝母、浙貝母、湖北貝母和平貝母5大類貝母藥材（國家藥典委員會編，2020），各地還有幾十種貝母屬植物的鱗莖習慣性作為貝母入藥。貝母素甲、貝母素乙是浙貝母飲片中常用的質控指標 （國家藥典委員會編，2020；趙耀東等，2013；曾榮香等，2009；程顯隆等，2008；薛燕和顧好糧，2005）；貝母素乙是湖北貝母質控指標，也是川貝母鑒別的對照品（國家藥典委員會編，2020）。近來研究發現，貝母辛具有很好的平喘作用（趙益等，2009），并在瓦布貝母（劉晶等，2010）、太白貝母（王懷玉等，2011；劉晶等，2010）、彭澤貝母（劉紅寧等，2010）、伊貝母（段寶忠等，2010）、川貝母（黃林芳等，2009）、爐貝母（蔣玉虎等，2014）、新疆貝母（劉玉明等，2014；鄒和平等，2014）、康定貝母（鄒和平等，2014）等不同種類貝母的研究中作為質控指標進行檢測。為了保證用藥安全有效，擴大用藥資源，本文采用HPLCELSD法對9個不同產地貝母中3種生物堿貝母辛、貝母素甲和貝母素乙的含量進行測定，比較不同產地貝母藥材中貝母辛、貝母素甲和貝母素乙的含量差異，并對貝母辛、貝母素甲和貝母素乙的細胞毒性進行研究，旨在為開發利用貝母資源提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器、供試材料及試驗動物

1.1.1 供試材料 本試驗共收集到9個不同產地的5大類貝母藥材，經鑒定，涵蓋了2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）收載的浙貝母、伊貝母、平貝母、川貝母和湖北貝母所有種類的貝母藥材。S1、S2、S3、S4、S5號生藥樣品由四川大學鑒定，S6、S7、S8、S9號生藥樣品由上海中醫藥大學鑒定，具體樣品來源見表1。

表1 樣品來源

1.1.2 試劑 對照品貝母辛（110892-201911）、貝母 素 甲 （110750-201908）、 貝 母 素 乙 （110751-201909）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均≥98%；乙睛為色譜純（美國Fisher公司），四甲基偶氮噻唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司，牛胎血清（FBS）購自美國Gibco-BRL公司，其他試劑為分析純。

1.1.3 儀器Waters e2695高效液相色譜儀；Waters 2420 ELSD檢 測 器 ；Empower2色 譜 工 作站；Newllassic MF電子天平（瑞士Mettler公司）；酸度計（瑞士Mettler公司）；RV 10D S25旋轉蒸發儀（德國IKA公司）；Milli-Q超純水儀 （Millipore公司）；InfiniteF50酶標儀（TECAN有限公司）。

1.1.4 試驗動物 清潔級BALB/c小鼠，雄性，8～10周齡，重18～20 g，購自中國科學院上海實驗動物中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 對照品儲備液的制備 精密稱取貝母辛、貝母素甲和貝母素乙對照品適量，分別加甲醇制成含貝母辛1.8 mg/mL，含貝母素甲0.4 mg/mL，含貝母素乙1.2 mg/mL的混合對照品儲備液；于4℃冷藏保存，備用。

1.2.2 供試品溶液的制備 取樣品粉末 （過四號篩）約2.0 g，精密稱定，置燒瓶中，加濃氨試液4 mL浸潤1 h，精密加入三氯甲烷-甲醇（4:1）40 mL，稱量，混勻，置80℃水浴中加熱回流2 h，放冷，再稱量，加三氯甲烷-甲醇（4:1）補足減失的量，濾過。精密量取濾液10 mL，置蒸發皿中蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至2 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，然后過0.45 μm微孔濾膜，即得。每個樣品平行制備3份供試品溶液。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%三氟乙酸（TFA）水溶液；梯度洗脫（0～10 min，25%A，10～20 min，25%A→40%A，20～25 min，40%A→95%A，25～50 min，95%A）； 柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；漂移管溫度：40℃；載氣流速：2.0 L/min。

1.2.4 小鼠脾淋巴細胞懸液的制備 小鼠頸椎脫臼法處死，無菌條件下迅速分離小鼠脾臟，置于冷的PBS下沖洗，剝去結締組織并以200目不銹鋼篩網輕輕研磨過濾。收集細胞，用PBS洗滌2次（4℃，250 g，5 min）之后，再用RPMI-1640培養基（25 mmol/L的谷氨酰胺、100 IU/mL的青霉素、80 IU/mL的鏈霉素、體積分數為0.1%的β-二巰基乙醇和10%的胎牛血清）重懸細胞，配制成密度為2×106個/mL的細胞懸液。每孔200 μL細胞懸液接種于96孔板，最后置于37℃、5% CO2的培養箱中培養。

1.2.5 MTT比色法檢測貝母素甲、貝母素乙和貝母辛對小鼠脾淋巴細胞的藥物毒性 按“1.2.4”項下方法在96孔板中接種200 μL細胞密度為2×106個/mL的細胞懸液，細胞懸液中加入不同濃度的貝母辛、貝母素甲和貝母素乙 （終濃度為0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL），每個劑量設3個復孔。在37℃、5% CO2培養箱中培養48 h后，每孔加入20 μL（質量濃度為5 mg/L）的MTT，置于培養箱繼續避光孵育4 h后，離心（300 g，5 min）棄上清，每孔加入100 μL的DMSO，振蕩10 min，在酶標儀上570 nm波長檢測各孔吸光度（A），計算細胞的相對存活率。并利用Reed-Muench法，計算出貝母辛、貝母素甲、貝母素乙的CC50即對50%的細胞產生細胞毒性時對應的藥物濃度。

1.3 方法學考察

1.3.1 線性關系考察 精密吸取對照品儲備液適量，以甲醇稀釋，得到6個濃度梯度的混合對照品溶液。精密吸取6個濃度的混合對照品溶液，按“1.2.3”項下色譜條件進行測定，考察貝母辛、貝母素甲、貝母素乙的線性關系。

1.3.2 精密度實驗 精密吸取同一對照品溶液，按“1.2.3”項下色譜條件進行測定，連續進樣6次；記錄貝母辛、貝母素甲和貝母素乙峰面積，分別計算貝母辛、貝母素甲和貝母素乙的RSD。

1.3.3 重復性實驗 精密稱取同一批次浙貝母藥材粉末6份，按“1.2.2”項下方法制備成供試品溶液6份，按“1.2.3”項下色譜條件進行測定，連續進樣6次；記錄貝母辛、貝母素甲和貝母素乙峰面積，分別計算貝母辛、貝母素甲和貝母素乙的平均含量及RSD。

1.3.4 穩定性實驗 精密吸取同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12、24 h按“1.2.3”項下色譜條件進行測定；記錄貝母辛、貝母素甲和貝母素乙的峰面積，分別計算貝母辛、貝母素甲和貝母素乙的平均含量及RSD。

1.3.5 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的浙貝母樣品1.0 g，共6份，置圓底燒瓶中，分別精密加入對照品貝母辛0.8 mg、貝母素甲0.1 mg、貝母素乙1.0 mg，按“1.2.2”項下方法制成供試品溶液，按“1.2.3”項下色譜條件進行測定，計算加樣回收率及RSD。

1.3.6 貝母樣品中貝母辛、貝母素甲和貝母素乙的含量測定 精密稱取9個不同產地的貝母樣品，分別按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“1.2.3”項下色譜條件進行測定，計算結果。

2 結果與分析

2.1 樣品及對照品色譜圖 在本實驗色譜條件下，可見供試品溶液及對照品溶液基線平穩，各色譜峰分離度好，其他成分無干擾（圖1）。

圖1 對照品（A）及樣品（B）的HPLC-ELSD色譜圖

2.2 方法學考察結果

2.2.1 線性關系 測定貝母辛、貝母素甲和貝母素乙峰面積，以峰面積積分值（Y）對溶液質量濃度（X）進行線性回歸，得到貝母辛、貝母素甲和貝母素乙的回歸方程分別為：貝母辛，Y1=1.7953X1+13.221，r1=0.9992； 貝 母 素 甲 ，Y2=1.8021X2+12.863，r2=0.9991； 貝 母 素 乙 ，Y3=1.8127X3+12.478，r3=0.9997;表明貝母辛、貝母素甲、貝母乙素在質量濃度3.6～288、0.8～64、2.4～192 μg/mL與峰面積線性關系良好。

2.2.2 精密度實驗 貝母辛、貝母素甲和貝母素乙峰面積的RSD分別為2.13%、1.97%和1.78%，表明儀器的精密度良好。

2.2.3 重復性實驗 貝母辛、貝母素甲和貝母素乙含量的平均值分別為267.4、94.5、304.7 μg/g，RSD分別為1.95%、2.27%和2.03%，表明該方法重現性良好。

2.2.4 穩定性實驗 貝母辛、貝母素甲和貝母素乙峰面積的RSD分別為1.87%、2.05%、1.96%；表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.5 加樣回收率實驗 貝母辛、貝母素甲和貝母素乙平均回收率分別為101.13%、99.26%、101.29%，RSD分別為2.03%、1.95%和2.56%，表明該方法準確可靠。

2.3 樣品中貝母辛、貝母素甲和貝母素乙含量的測定結果 由表2可知，9個不同產地的5大類貝母中，在達到定量限的供試品中，貝母辛、貝母素甲和貝母素乙的含量分別在19.7～937.6、6.2～221.2、31.2～599.2 μg/g。 其中，貝母辛在川貝母中含量最高，貝母素甲在梭砂貝母含量最高，貝母素乙在湖北貝母中含量最高。

表2 不同產地貝母中貝母辛、貝母素甲和貝母素乙含量 μg/g

2.4 貝母辛、貝母素甲和貝母素乙細胞毒性的評價 分別用0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的貝母辛、貝母素甲、貝母素乙處理小鼠脾淋巴細胞后，細胞相對存活率及CC50如表3所示。

表3 貝母辛、貝母素甲、貝母素乙對小鼠脾臟淋巴細胞的毒性

由上述結果可知，貝母辛、貝母素甲、貝母素乙的半數致死量 （CC50）分別為65.38、146.8、91.44 μg/mL，其中，貝母辛對細胞毒性最大（CC50＝65.38 μg/mL）。 依據William S.Stokes（程顯隆等，2008）建立的體外實驗對于急性毒性實驗起始劑量的公式：log（LD50）＝0.435×log（IC50）+0.625，IC50＝CC50＝65.38 μg/mL，計算出小鼠的LD50為0.796 g/kg。默認每日服藥量為ED50，治療指數TI＝LD50/ED50，依據經驗值，人的劑量為LD50＝0.796/9×70＝6.191 g。貝母辛在川貝母中的含量最高，為937.6 μg/g，《中國藥典》2020版（一部）記載川貝母的用藥量為3～10 g（程顯隆等，2008），得出川貝母的治療指數（TI）為661～2203。 當治療指數TI＞10時，說明用藥安全，故在不考慮貝母辛對胚胎細胞潛在致畸毒性的前提下，可認為不同產地貝母的臨床用藥安全。

3 結論與討論

貝母中的主要活性物質生物堿的化學結構中沒有共軛雙鍵和發光團，不能直接用紫外檢測器進行分析和檢測。HPLC-ELSD適合于沒有紫外吸收、不易揮發的化學成分的含量測定。本文采用HPLC-ELSD方法對9個產地的貝母中貝母辛、貝母素甲、貝母素乙的含量進行測定和比較分析，該方法靈敏度高，干擾少，重現性好，是檢測貝母中甾體和異甾體生物堿有效、簡便的分析方法。

不同產地貝母藥材中，貝母辛、貝母素甲、貝母素乙含量測定的結果顯示，浙貝母和湖北貝母中3種生物堿含量都較高。平貝母中3種生物堿含量都很低，均只達到檢測線，但未達到定量限，這與周劍俠等（2006）的研究結論相符，即平貝母中單一生物堿成分含量過低，不宜作為平貝母藥材的質量控制指標；以平貝母中總生物堿含量作為質量控制指標，能更客觀地反映平貝母活性成分情況。在伊犁貝母中，貝母素甲和貝母素乙含量都較低，貝母辛含量相對較高，與文獻報道相符。瓦布貝母和濃密貝母是川貝母的新培育品種，瓦布貝母中貝母辛和貝母素乙含量都較高；貝母辛、貝母素甲和貝母素乙三個單體成分，在暗紫貝母、川貝母、梭砂貝母等組成的川貝母復合群中，整體含量偏低。貝母素甲在瓦布貝母中達到檢測限，但未達到定量限（朱明，2011）。

周劍俠等（2006）研究表明，當異甾體生物堿結構中同時存在醚氧結構和呋喃環時可能會對妊娠期的動物和人的胚胎產生致畸作用。本文所測貝母的3種生物堿中川貝母中貝母辛的含量最高，川貝具有悠久的應用歷史，一直是貝母藥材重要品種之一，故貝母辛的遺傳毒性仍需引起關注。