PD-1抑制劑治療肝細胞癌療效相關生物標志物的研究現狀

劉佳 楊道坤 王燕平 陳寶鑫 王新偉 綜述 申嬌 審校

原發性肝癌包括三種病理組織學類型，其中肝細胞癌(Hpatocellular carcinoma，HCC)占比最大。在中國，HCC是導致癌癥死亡的一個重要原因[1]。HCC的治療方法包括手術、射頻消融、經導管動脈化療栓塞術(Transcatheter arterial chemoembolization，TACE)、放化療和分子靶向治療等，但臨床研究證實這些方法效果欠佳。近年，程序性死亡受體1(Programmed cell death-1，PD-1)抑制劑已顯示出對晚期肝細胞癌的優越治療效果[2]。PD-1是T細胞調節器的成員，可以調節免疫系統對自身細胞的反應[3]。在正常情況下，人體T淋巴細胞表達PD-1，正常細胞會表達適量程序性死亡受體-配體1(Programmed cell death-Ligand 1，PD-L1)維持免疫耐受；而HCC患者的腫瘤細胞會表達過量PD-L1，兩者結合會導致免疫逃逸。PD-1抑制劑可阻斷PD-1和PD-L1間的相互作用，恢復T細胞的活性和個體免疫系統殺傷腫瘤細胞的能力[4](圖1)。本文闡述了PD-1抑制劑在HCC治療中生物標志物的研究進展。

1 腫瘤組織內生物標志物

1.1 PD-L1的表達

國外Feun等[5]研究發現PD-L1陽性組和陰性組在免疫治療后部分緩解(PR)的數量沒有顯著差異。然而，Keynote-224研究表明，PD-L1表達率越高，相應患者的客觀應答率(Objective response rate，ORR)越高，Checkmate 040等其他研究的結果表明，基線PD-L1表達水平與患者的治療效益無關[6]。Liu等[7]研究了HCC患者中PD-L1的不同表達模式，結果證實，腫瘤細胞PD-L1的表達與患者的總生存期(Overall survival，OS)和無復發生存期(Recurrence-free survival，RFS)之間呈負相關(P=0.001；P=0.006)。CD68+巨噬細胞上PD-L1的表達與患者的OS呈正相關(P=0.017)，這是由于表達PD-L1的巨噬細胞會招募大量CD8+T淋巴細胞，產生更多免疫因子。PD-L1表達的異質性是影響研究結果的重要因素。國外一項研究從存儲庫中選取HCC樣本，結果提示從目標表位多樣性、差分檢測特異性、抗體親和力分析，PD-L1的表達存在較大差別[8]。統一PD-L1高表達的臨界值以及運用統一抗體進行檢測至關重要。因此，目前PD-L1表達的預測意義有待商榷。

1.2 腫瘤突變負荷及微衛星不穩定

腫瘤突變負荷(Tumor mutational burden，TMB)是外源編碼區域中堿基的替換和插入/刪除突變數量，與腫瘤樣本的評估基因有關[9]。高TMB提示更多的免疫新抗原存在[10]。Xu等[11]研究發現，高TMB組比低TMB組的無進展生存期(Progression-free survival，PFS)長(3個月vs.2.1個月，P=0.063)，但Huo等[12]研究發現高TMB組患者OS反而較短(P<0.001)，且高TMB組的CD8+T淋巴細胞和M0巨噬細胞浸潤水平較低。究其原因，可能由于臨界值不同或樣本量較小所致。微衛星不穩定(Microsatellite instability，MSI)是由于DNA錯配修復系統(Mis-match repair，MMR)故障所致[13]。Ang等[14]評估了數百份HCC樣本的MSI，發現只有一份樣本具有高MSI表達，提示MSI可能不能精準預測HCC免疫治療的療效。

1.3 腫瘤浸潤免疫細胞

了解腫瘤微環境(Tumor microenvironment，TME)是免疫治療成功的關鍵[15]。HCC的TME是一個富集多種免疫細胞的動態系統[16]。HCC中各種腫瘤浸潤免疫細胞(Tumor infiltrating immune cells，TIICs)相互作用形成復雜的免疫網絡。抑制腫瘤作用：一項研究發現免疫治療后的HCC患者應答組中CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞(Tumor infiltrating lymphocyte，TILs)比例較高[17]。CD8+TILs可釋放穿孔素、絲氨酸蛋白酶、表達FasL分子等導致腫瘤細胞死亡。一項研究表明[18]，耗竭CD8+TILs表達高的患者PFS和OS明顯更長(P=0.007；P=0.058)，并且發現與耗竭CD8+TILs特征相關的基因具有調節趨化因子表達(CCL5、CXCL9、CXCL13)和激活T細胞和NK細胞的功能。相關研究證實，耗竭TILs雖喪失部分功能，但可通過阻斷PD-1/PD-L1通路，實現TILs亞群的增殖[19]。另有一項研究證實了腫瘤組織中CD38+TIICs的免疫組化評分可以預測免疫治療療效，高表達組的中位PFS及中位OS均較高(8.21個月vs.1.64個月，P=0.007；19.06個月vs.5.59個月，P=0.030)[20]。這一現象是由于CD38+腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)會誘導IL-6和TNF-α的表達，并導致更多的IFN-γ和細胞因子(CXCL9、CXCL10和CXCL11)的表達[21]。也有研究表明CD4+TILs可上調效應T淋巴細胞(Effector T lymphocytes，TEFFs)并刺激CD8+TILs分泌細胞因子，直接殺傷腫瘤細胞[22]。促腫瘤作用：研究發現[23]FOXP3+TILs/CD4+TILs與DFS(HR=2.50，P=0.009)和OS(HR=4.04，P=0.001)獨立相關；對其相關細胞因子和趨化因子基因進行鑒定，結果表明高表達組會促使更多的IL-2、IL-10、IL-35及趨化因子CCL20和CXCL16的產生，招募調節性T細胞(Regulatory cells，Tregs)遷移到腫瘤微環境中，利于腫瘤新生血管的形成[23]。一項薈萃分析顯示[24]CD3+TILs的高密度預示較差的OS(HR=1.008；95%CI：1.000～1.015；P=0.037)。另有研究發現HCC組織中CD68+TAMs可誘導Th17的擴增，誘發免疫耐受、分泌TGF-β、IL-6、IL-10等免疫抑制因子導致免疫逃逸[25]。綜上，HCC組織中不同表型的TIICs作用各不相同(圖2)，未來還需詳細探索并建立相關免疫評分。

圖2 腫瘤浸潤免疫細胞在TME中的作用

1.4 外泌體

外泌體是脂質雙層包裹的納米級囊泡[26]。外泌體運輸各種生物分子，如蛋白質、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)和長鏈非編碼RNA(lncRNA)[27]。研究發現[28]，HCC衍生的外泌體中含有較多的lncRNA TUC339，TUC339可以參與細胞因子受體信號通路和CXCR 趨化因子受體結合通路，刺激巨噬細胞向M2表型極化以促進腫瘤進展。HCC外泌體miR-23a-3p通過STAT3信號通路上調巨噬細胞中PD-L1的表達。HCC來源的其他外泌體還可以通過IL-6-STAT3信號通路抑制樹突狀細胞的成熟[29]?？傊?，腫瘤來源的多種類型的外泌體可以通過不同的信號傳導通路抑制免疫細胞的增殖，從而介導免疫逃逸。

1.5 特征性基因和通路

1.5.1 m6A修飾相關基因 Khemlina等[30]使用基因組測序的方法，在HCC中發現了一系列基因改變。探討HCC特征基因改變的研究相繼出現。Jiang等[31]研究發現m6A修飾相關基因或許可預測HCC免疫治療療效。m6A又叫N6-甲基腺苷，是真核生物中含量最多的修飾型RNA。使用LASSO分析將YTHDF2、YTHDF1、METTL3等m6A相關基因構建風險模型。結果表明，風險評分較低的患者具有更長的OS(HR=3.81，95%CI：1.13～11.08，P=0.03)，并且具有較高水平的CD4+TILs及B淋巴細胞；相反風險評分高的患者有較高的M0巨噬細胞及Tregs，導致腫瘤血管生成。結果提示m6A相關修飾基因可能作為生物標志物預測抗PD-1免疫治療。

1.5.2 CMTM4趨化因子 Chui等[32]發現CMTM4(趨化因子跨膜結構域的家族成員)有望成為標志物之一。研究發現CMTM4在人類HCC中過表達。在構建HCC小鼠模型中，CMTM4低表達的生長速度較慢，它通過網格蛋白依賴性內吞和蛋白酶體途徑防止PD-L1降解。通過下調CMTM4可以抑制由IFN-γ驅動的PD-L1表達或其他致癌信號通路，重新激活CD4+、CD8+T淋巴細胞介導的抗腫瘤免疫。

1.5.3 Wnt/β-catenin通路 近來Wnt/β-catenin通路已被確定為免疫逃逸的重要致癌因素。一項研究發現該通路的激活與較低的疾病控制率(Disease control rate，DCR)(0%vs.53%)、較短的中位PFS(2.0個月vs.7.4個月)和較短的中位OS(9.1個月vs.15.2個月)相關。該通路導致樹突狀細胞和抗原特異性T細胞的缺陷，建立“免疫冷腫瘤”，導致對免疫治療的耐藥，可以作為HCC患者免疫治療排除的新生物標志物[33]。

2 腫瘤組織外標志物

2.1 外周血標志物

2.1.1 甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP)和異常凝血酶原 甲胎蛋白是HCC診治中常用的生物標志物。國內一項研究證實了早期AFP水平可以作為免疫治療的標志物，將HCC患者分為早期反應組和無反應組兩組(反應組：治療開始的4周內血清AFP水平較治療前下降>20%)。結果證實早期AFP反應組的中位OS(28.0個月vs.11.2個月，P=0.048)和中位PFS(15.2個月vs.2.7個月，P=0.002)均較長[34]。異常凝血酶原Ⅱ(Protein induced by vitamin k Absence or Antagonist-II，PIVKA-II)是一種異常的凝血酶原蛋白[35]。有研究發現，血清PIVKA-II水平與患者TNM分期和腫瘤大小呈正相關[36]。研究證實[37]，AFP下降>50%和PIVKA-Ⅱ下降>50%分別與更長的OS和PFS相關，兩者的綜合預測模型評分較低的患者有更長的OS及PFS。

2.1.2 TGF-β 大量研究證實TGF-β在HCC TME中起重要作用[38]。肝竇內皮細胞(Liver sinusoidal endothelial cells，LSECs)和肝星狀細胞(Hepatic Stellate Cells，HSCs)產生的TGF-β通過激活SMAD2/3上調Tregs和促炎因子，阻斷T細胞抗原受體的信號傳導并抑制T細胞增殖和細胞毒性介質的分泌，從而導致T細胞耗竭。有研究顯示[5]，免疫治療應答組的TGF-β水平低于無應答組(P=0.003)。另外一項基礎實驗也論證了TGF-β可以上調T細胞表面PD-1的表達，減弱淋巴細胞殺傷力，但需進一步在人體中驗證[39]。

2.1.3 炎癥評分 國內一項研究證實了粒細胞淋巴細胞比值(Neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR)和血小板淋巴細胞比值(Platelet-lymphocyte ratio，PLR)較低的患者OS及完全緩解率均較高[40]。還有相關研究指出CAR(CRP與白蛋白比率)、SII(SII=P×N/L)等炎癥評分較低的患者具有更長的OS和PFS，同時該研究建立了包括格拉斯哥預后評分(GPS)等在內的炎癥評分預測模型，需要進一步探索模型的適用性[41]。有研究表明炎癥評分較高提示大量中性粒細胞衍生的IL-18和血管內皮生長因子生成，減弱淋巴細胞殺傷力，增加腫瘤血供，促進腫瘤細胞的存活[42]。

2.2 腸道菌群

Zheng等[43]選取給予帕博利珠單抗治療的肝細胞癌患者，通過宏基因組測序評估腸道細菌特征的動態變化，結果提示應答組(R組)顯示出比無應答組(NR組)更高的分類群豐富度。R組主要富含乳酸桿菌屬，可抑制腐敗劑的生長，提高宿主免疫能力。NR組中變形桿菌則占據主導地位。另外一項研究表明糞便桿菌屬的豐度越高，PFS越高[44]?？傊?，腸道-微生物種類及豐度的變化可能成為預測HCC免疫治療的因素，但具體機制及其與免疫環境的關系還需進一步驗證。

3 宿主特征

3.1 甲狀腺功能減退

Xu等[45]納入接受免疫治療的HCC患者，結果證實甲減組的中位PFS(6.27個月)高于非甲減組(5.68個月)，且甲狀腺功能減退和患者預后相關(P=0.012)。相關研究表明[46]，S2域(甲狀腺激素結合結構域)可以結合T4和T3，通過磷脂酶C(PLC)和蛋白激酶C(PKCα)激活絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶(MAPK/ERK1/2)通路，從而促進腫瘤細胞增殖。

3.2 營養狀況

有研究證實患者的體重指數(BMI)或許可以作為預測因素之一[47]。研究發現BMI>25的患者中位生存期較長(5個月vs.17.5個月，P=0.034)。BMI增加對一些癌癥患者有保護作用[48]。與BMI有關的白色脂肪，是一部分趨化因子的來源，會刺激記憶性T淋巴細胞的儲存。Mei等[41]研究發現PNI指數(PNI=白蛋白+5×淋巴細胞計數)高的患者生存率較高(24個月總生存率：51.5%vs.25.7%，P<0.001)。PNI指數低提示淋巴細胞減少及白蛋白降低[49]，即免疫能力減弱，而營養不良狀態會削弱吞噬功能和其他防御機制。

3.3 磁共振HCC結節信號

Aoki等[50]使用釓-乙氧基芐基-二乙烯三胺(Gd-EOB-DTPA)的肝膽期增強磁共振成像(MRI)評估HCC患者對PD-1抑制劑的反應。研究結果證實肝膽期圖像上信號較高患者的中位PFS明顯較短(2.7個月vs.5.8個月，P=0.007)。Gd-EOB-DTPA是肝細胞通過有機陰離子轉運多肽1B3(OATP1B3)攝取MRI的肝臟特異性造影劑。有研究發現具有Wnt/β-catenin改變的HCC患者的OATP1B3表達明顯更高。這種高信號的HCC結節可能是一種預測抗PD-1治療反應不佳的成像生物標志物[51]。

4 其他

一項研究揭示了細胞周期蛋白和HCC患者免疫浸潤相關[52]。細胞周期蛋白可以和相關激酶結合調節G2/M期。該研究發現細胞周期蛋白B1(Cyclin B1，CCNB1)、細胞周期蛋白B2(Cyclin B2，CCNB2)、細胞周期蛋白依賴性激酶1(Cyclin-dependentkinase1，CDK1)在HCC組織中高表達，并且可調節多種免疫浸潤細胞的表達，將其抑制劑與免疫療法相結合可能會改善HCC患者的生存時間。賴氨酸特異性脫氧酶可以促進PD-L1的表達，給予該酶的抑制劑后，會增強PD-1抑制劑治療HCC療效，諸如此類，還有很多不同層面的標志物都在研究中[53]。

5 小結與展望

以PD-1抑制劑為代表的免疫治療給晚期不可手術的肝細胞癌患者帶來了新希望，但是目前總反應率仍不盡如人意，因此急需探索生物標志物以篩選優勢人群。大量查閱國內外相關文獻并結合臨床應用實際情況，發現很多不同種類的生物標志物都在研究中，但目前尚沒有得到國際公認且臨床廣泛應用的標志物，仍面臨取材困難、異質性大和靈敏度差等挑戰。但是根據目前的研究熱點及發展趨勢，腫瘤免疫微環境的特征綜合評分及特征基因及通路極有可能會成為未來潛力最大的生物標志物。未來需要建立多種不同層面的綜合因素模型，為肝細胞癌的免疫治療添磚加瓦。