甘草酸通過激活核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶1通路減輕急性胰腺炎氧化應激

程 波， 李德劍， 張 巖， 陳三洋， 宋耀東， 王巧芳， 劉艷娜， 朱長舉

急性胰腺炎(acute pancreatitis， AP)是一種臨床常見的腹部急癥，由外分泌胰腺消化酶過度激活引起的可逆炎癥過程[1]。大多數AP患者經歷輕度疾病過程，10%～20%患者病情進展出現更為嚴重的重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)，甚至發生多器官功能衰竭甚至危及生命[2-3]。目前AP尚無特異性治療方法。

甘草酸(liquiritigenin， Liq)從甘草中提取，是具有多酚結構的黃酮類化合物，具有多種生化和藥理特性，包括抗炎、降脂、抗氧化、抗癌等特性[4-5]，其在AP中的作用尚不明確。氧化應激在AP的發生發展中起重要作用， 核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)/血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1, HO-1)是調節氧化應激的關鍵通路，我們推測甘草素通過調控Nrf2/HO-1通路發揮抗氧化作用對AP起保護作用。本研究通過兩次L-精氨酸腹腔注射建立小鼠AP 模型，檢測AP小鼠血清淀粉酶、血清炎癥指標腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)及胰腺組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的表達，免疫熒光觀察胰腺組織中活性氧(ROS)的表達，Western blot檢測胰腺組織中Nrf2、HO-1的表達探討甘草酸對AP小鼠的影響及作用機制，為AP的治療提供新途徑。

1 材料與方法

1.1實驗試劑 L-精氨酸(北京索萊寶公司)，BCA 蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶公司)，GAPDH抗體(上海碧云天公司)，Nrf2抗體(美國proteintech公司)，HO-1抗體(美國Abcam公司)，血清淀粉酶(上海酶聯公司)、TNF-α、IL-6 ELISA 試劑盒購自武漢云克隆公司，MDA、SOD試劑盒購自南京建成生物有限公司。

1.2AP模型誘導及動物分組 24只C57BL/6小鼠(8～10周，20～22 g)購自北京維通利華公司，適應性飼養1周,隨機分為4組：對照組(CON組)、甘草酸對照組(Liq組)、AP 組、AP+甘草酸治療組(AP+Liq組), 每組6只。CON組：注射生理鹽水；Liq組：注射甘草酸(30 mg/kg)[6-8]+生理鹽水；AP組：生理鹽水+L-精氨酸(4 g/kg, 注射2次，間隔1 h)；AP+Liq組：甘草酸(30 mg/kg)于L-精氨酸造模前1 h腹腔注射。末次注射后72 h處死小鼠，收集血清和病理標本。本實驗經鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準(2019-KY-140)。

1.3胰腺病理學檢查 胰腺組織石蠟包埋，切成5 μm厚的切片，HE染色并在顯微鏡下觀察。根據Schmidt評分準則[9]進行評分。

1.4血清學指標測定 根據ELISA說明書檢測血清淀粉酶及炎癥因子TNF-α、IL-6水平，用胰腺組織提取蛋白檢測MDA、SOD含量，450 nm下檢測各個指標水平。

1.5免疫熒光檢測胰腺組織ROS的生成 新鮮冰凍組織切片，37 ℃烘箱烘烤10～20 min，固定后抗原修復，畫圈并用血清封閉，ROS染液孵育并4 ℃過夜(Sigma，1∶500)，熒光二抗孵育，DAPI避光染色10 min，加入自發熒光淬滅劑，封片并在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6Western blot 方法測定胰腺組織中Nrf2、HO-1 蛋白的表達 胰腺組織用RIPA裂解提取總蛋白，BCA定量蛋白質濃度。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉1 h后一抗4 ℃過夜， Nrf2(1∶1000)、HO-1(1∶2000)二抗孵育1 h，化學發光顯影。

2 結果

2.1甘草酸減輕L-精氨酸誘導的小鼠AP L-精氨酸誘導AP后，AP組小鼠胰腺組織病理損傷較重，胰腺水腫、炎性細胞浸潤和細胞壞死程度及組織學評分等較CON組及Liq組明顯加重，而甘草酸治療的AP小鼠胰腺損傷程度及損傷評分明顯減輕。見圖1。

注： A 為各組小鼠胰腺病理變化(×100)；B 為各組小鼠胰腺組織壞死、炎細胞浸潤、水腫及Schmid 胰腺病理評分的定量分析；CON組為對照組，Liq組為甘草酸對照組，AP組為急性胰腺炎組，AP+Liq組為急性胰腺炎+甘草酸治療組；bP<0.01，cP<0.05

2.2甘草酸減輕血清淀粉酶、炎癥因子及胰腺SOD、MDA水平 與CON組比較，誘導AP后小鼠淀粉酶、炎癥因子及MDA明顯升高(P<0.01)，SOD明顯下降(P<0.01)；Liq組淀粉酶、炎癥因子及MDA明顯降低(P<0.01和P<0.05)，SOD明顯升高(P<0.01)。見圖2。

注：各組小鼠血清淀粉酶(A)、TNF-α(B)、IL-6(C)水平，胰腺SOD(D)、MDA(E)水平的定量分析；CON組為對照組，Liq組為甘草酸對照組，AP組為急性胰腺炎組，AP+Liq組為急性胰腺炎+甘草酸治療組；bP<0.01,cP<0.05

2.3甘草酸減輕胰腺組織中ROS生成 CON組與Liq組未見明顯的ROS表達，而AP組中的ROS表達明顯增加， 而Liq組降低了胰腺組織中的ROS表達。見圖3。

注：CON組為對照組，Liq組為甘草酸對照組，AP組為急性胰腺炎組，AP+Liq組為急性胰腺炎+甘草酸治療組；ROS為活性氧，DAPI為二氨基苯基吲哚

2.4甘草酸促進胰腺組織中Nrf2/HO-1表達 與CON組比較，AP組Nrf2、HO-1表達明顯降低(P<0.05和P<0.01)；與AP組比較，AP+Liq組中Nrf2、HO-1表達明顯增多(P<0.05)。見圖4。

注：A 各組小鼠胰腺組織Nrf2、HO-1蛋白的表達水平；B、C各組小鼠胰腺組織Nrf2、HO-1蛋白的定量分析；CON組為對照組，Liq組為甘草酸對照組，AP組為急性胰腺炎組，AP+Liq組為急性胰腺炎+甘草酸治療組；Nrf2為核因子E2相關因子2，HO-1為血紅素加氧酶1，GAPDH為內參基因；bP<0.01，cP<0.05

3 討論

甘草素具有強大的抗炎抗氧化特性，然而其對AP的影響尚未明確。本研究發現，甘草酸治療(30 mg/kg)減輕了小鼠AP時胰腺損傷嚴重程度，減輕炎癥因子產生，并能抑制ROS的產生減輕氧化應激反應，從而減輕AP的嚴重程度，提示甘草酸是極具潛力的AP治療藥物。

炎癥反應在AP的發生發展中起重要作用，促炎細胞因子的水平嚴重影響到AP局部及全身器官損傷的程度[10]。促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6在AP的發生發展中起著關鍵作用，嚴重時可導致全身性炎癥反應和多器官功能衰竭[11-12]。血清TNF-α、IL-1β和IL-6的阻斷已被證明可以減弱疾病的進程[13-14]。甘草酸是黃酮類化合物，具有強大的抗炎作用。Zhu等[15]的研究表明，甘草酸可減輕高糖誘導的腎小球系膜細胞系膜基質積累，減少腎小球系膜細胞中IL-1β和IL-6的分泌表達來抑制高糖誘導的炎癥反應和氧化應激。本研究用L-精氨酸對小鼠進行兩次腹腔注射，成功建立了小鼠AP模型，AP組胰腺組織病理損傷明顯，組織學評分明顯高于CON組，而甘草酸治療后胰腺組織損傷明顯減輕。與胰腺組織損傷一致及先前的研究結果一致，AP組小鼠血清TNF-α、IL-6水平明顯升高，而甘草素治療降低了小鼠血清TNF-α、IL-6水平，減輕了胰腺病理損傷程度，提示甘草酸可以改善小鼠AP，減輕炎癥反應。

氧化反應和抗氧化反應之間的平衡對機體正常生理活動至關重要，AP時二者平衡被打破，大量ROS及MDA產生，GSH、HO-1等抗氧化酶表達減少，導致嚴重的氧化應激反應，對組織和細胞造成不可逆轉的損傷[16-17]。減少重要氧化劑ROS的產生，促進抗氧化酶的產生，對AP具有保護作用。甘草酸具有強大的抗氧化作用。Zhang等[18]的研究表明，甘草酸治療可減輕三氧化二砷導致的肝毒性，減輕肝細胞內氧化應激反應，減少細胞內ROS的生成，抗氧化酶SOD、GSH等水平升高，MDA水平降低。以此為基礎，本研究探討了甘草酸對AP時體內氧化應激的影響，CON組和甘草酸對照組胰腺組織中幾乎未檢測到ROS，AP組ROS水平明顯升高，而甘草酸治療減輕了胰腺組織AP觸發的ROS積累。與此同時，甘草酸治療減少了AP時MDA的表達，提高了SOD抗氧化酶的表達，從而平衡氧化與抗氧化的關系，減輕AP的嚴重程度。

Nrf2 是一種重要的氧化還原敏感性轉錄因子，正常條件下，細胞質keap1作為E3泛素連接酶3(Cull3)的適配器，通過泛素蛋白酶體系統對Nrf2進行泛素化降解。機體氧化應激時，keap1結構中的反應性半胱氨酸殘基可以抑制Nrf2的降解，促進其轉移到細胞核中與抗氧化反應元件(ARE)結合，促進如醌氧化還原酶1(NQO1)和HO-1等抗氧化酶基因的表達，從而對抗氧化應激[19-20]。以往的研究[21-22]表明，在AP小鼠的胰腺組織中，Nrf2的表達明顯降低，并證實了上調Nrf2的表達對AP有保護作用。此外，多個研究表明， 甘草酸激活Nrf2/HO-1信號通路減輕氧化應激反應，從而減輕疾病的發展。Wang等[23]的研究表明，甘草酸及其同分異構體可以依賴/非依賴地激活Nrf2信號通路，誘導UGT1A1、NQO1 及HO-1等抗氧化酶的表達，抑制小鼠巨噬細胞激活引起的炎癥反應。Huang等[24]的研究表明，甘草酸可與keap1競爭Nrf2的結合位點，從而促進Nrf2 核易位并導致 Nrf2 下游抗氧化基因的表達增加，減輕了 MCT 誘導的肝臟氧化應激損傷。與此一致，本研究表明，AP組小鼠胰腺組織中Nrf2/HO-1表達明顯減少，而甘草酸治療明顯上調了Nrf2/HO-1的表達，減輕了小鼠AP氧化應激損傷。

綜上所述，甘草酸可通過調節Nrf2/HO-1通路，降低AP誘導的炎癥和ROS的生成， 為AP的治療提供實驗基礎和理論依據。然而，本研究也存在一些限制，未探討不同濃度的甘草酸對氧化應激的影響，未證實甘草酸對AP的直接影響，后續我們將進一步探討甘草酸抗炎、抗氧化的最佳作用劑量，并用Nrf2抑制劑及基因敲除鼠來進一步探討甘草酸對Nrf2的直接作用，及其對線粒體結構及功能的影響。