基于ITS2和psbA-trnH序列鑒別金線蘭及其近緣種

吳巖斌，張 超，吳建國，吳錦忠*，鄭承劍

? 藥材與資源 ?

基于ITS2和psbA-trnH序列鑒別金線蘭及其近緣種

吳巖斌1，張 超1，吳建國1，吳錦忠1*，鄭承劍2*

1. 福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122 2. 海軍軍醫大學 藥學系中藥鑒定學教研室，上海 200433

應用ITS2和psbA-trnH條形碼鑒定金線蘭及其近緣種。提取金線蘭及其近緣種的DNA，對ITS2和psbA-trnH序列進行擴增和測序，計算物種種內、種間遺傳距離，構建鄰接法（neighbor-joining，NJ）系統聚類樹直觀反映鑒定結果。經PCR擴增后測序，金線蘭及其近緣種ITS2序列長度為250～254 bp，GC含量為48.2%～51.6%；psbA-trnH序列長度為636～704 bp，GC含量為31.8%～32.0%。根據K2P遺傳距離計算，金線蘭的種內遺傳距離明顯小于種間遺傳距離?；贗TS2序列構建的NJ樹結果顯示，除長片金線蘭外，金線蘭與其余混偽品可以明顯區分?；趐sb A-trnH序列構建的NJ樹結果顯示，除長片金線蘭和麗蕾金線蘭外，金線蘭與其余金線蘭屬近緣種可以明顯區分。ITS2和psb A-trnH序列可以鑒別金線蘭與其遺傳距離較遠的近緣種。

金線蘭屬；金線蘭；DNA條形碼；ITS2序列；psbA-trnH序列

目前，全世界有金線蘭屬Blume植物40余種，中國有20種（10個特有種），其中金線蘭(Wall.) Lindl分布最廣，儲量相對較多，分布于福建、浙江、江西、云南、廣西、湖南等地區，是福建特色中草藥金線蓮的基原植物[1-4]。金線蓮具有清熱涼血、祛風利濕、解毒的功效[4]，具有保肝、降血糖、抗類風濕性關節炎、抗骨質疏松、減肥等生物活性[5-9]，臨床上主要用于治療肝炎、手足口病、糖尿病等疾病，顯示出良好的應用前景[10-14]。課題組在前期金線蓮資源調查過程中發現，除金線蘭外，臺灣銀線蘭、麗蕾金線蘭、興仁金線蘭、長片金線蘭、高金線蘭和滇南金線蘭等金線蘭屬植物在民間均被當作金線蓮使用。此外，一些斑葉蘭屬、血葉蘭屬和齒唇蘭屬植物也?；熳鹘鹁€蓮使用。金線蘭及其近緣種形態特征相似，從外觀上難以進行快速準確地鑒定，容易造成混用，影響金線蓮臨床療效的穩定。因此準確鑒別金線蘭，對保障金線蓮藥材質量具有重要的意義。本研究選用ITS2和psbA-trnH 2條序列對金線蘭及其近緣種進行分子鑒定，以期為金線蘭的快速鑒定及其開發提供參考。

1 材料

1.1 材料

金線蘭及其近緣種樣品采自福建、江西、廣東、廣西、云南等地（采樣時間2016年3～8月），由福建中醫藥大學藥學院黃澤豪教授和吳錦忠教授鑒定為金線蘭(Wall.) Lindl.、臺灣銀線蘭Hayata、興仁金線蘭Z. H. Tsi & X. H. Jin、麗蕾金線蘭Rolfe ex Downie、長片金線蘭H. Jiang & H. Z. Tian、滇南金線蘭Rolfe、高金線蘭Lindl.、血葉蘭(Ker-Gawl.) A. Rich.、大花斑葉蘭(Lindl.) Hook. f.、斑葉蘭Rchb. F.、小小斑葉蘭(L.) R. Br.、小斑葉蘭s (L.) R. Br.、西南齒唇蘭C. B. Clarke ex Hook. f.、艷麗齒唇蘭(Parish et Rchb. f.) T. Tang et F. T. Wang，憑證標本保存于福建中醫藥大學藥學院。樣品信息見表1。

1.2 儀器及試劑

S1000 Thermal Cycler PCR擴增儀（美國BIO-Rad公司）；凝膠成像系統（美國BIO-Rad公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；Tris堿（合肥biosharp生物科技有限公司）；β-巰基乙醇（Genview公司）；Tris飽和酚（美國Solarbio公司）；DL2000 DNA marker（TaKaRa公司）；PrimeSTAR Max dna Polymerase（TaKaRa公司）；GoldView（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）；6×DNA Loading Buffer（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）；瓊脂糖（Genview公司）。

表1 樣品信息

Table 1 Sample information

編號拉丁名中文名代碼采集地 1A. roxburghii金線蘭AR1福建漳州 2 AR2福建漳州 3 AR3福建漳州 4 AR4福建漳州 5 AR5福建龍巖 6 AR6江西贛州 7 AR7廣東清遠 8 AR8廣東清遠 9 AR9廣西南寧 10 AR10福建漳州 11 AR11福建龍巖 12 AR12福建漳州 13 AR13福建漳州 14 AR14福建漳州 15 AR15福建三明 16 AR16福建漳州 17 AR17福建漳州 18 AR18福建龍巖 19A. formosanus臺灣銀線蘭AF1福建漳州 20 AF2福建漳州 21 AF3福建漳州 22 AF4福建漳州 23 AF5福建漳州 24A. xingrenensis興仁金線蘭AX1廣西南寧 25 AX2廣西河池 26 AX3廣西南寧 27A. lylei麗蕾金線蘭LY1廣西南寧 28 LY2廣西南寧 29A. longilobus長片金線蘭AL云南文山 30A. burmannicus滇南金線蘭AB云南德宏 31A. elatus高金線蘭AE云南西雙版納 32Ludisia discolor血葉蘭LD1廣西南寧 33L. discolor血葉蘭LD2廣西南寧 34Goodyera biflora大花斑葉蘭GB貴州興義 35G. schlechtendaliana斑葉蘭GS浙江麗水 36G. yangmeishanensi小小斑葉蘭GY廣西河池 37G. repens小斑葉蘭GW云南怒江 38Odontochilus elwesii西南齒唇蘭OE云南麻栗坡 39O. moulmeinensis 艷麗齒唇蘭OM云南麻栗坡

2 方法

2.1 樣品DNA的提取、PCR擴增和測序

取經過硅膠干燥的植物葉片約0.5 g，經液氮研磨后，用改良的CTAB法提取總DNA[15]。各候選序列的PCR反應條件，通用引物及擴增程序參考陳士林等的研究[16]。PCR擴增產物經純化后，使用ABI3730型基因分析儀進行雙向測序。

2.2 數據處理

測序所得到的峰圖采用Contig Express v 3.0（Codon Code Co.，美國）校對拼接，去除引物區及低質量區。使用隱馬爾可夫模型HM-Mer序列注釋方法去除兩端5.8S和28S區段，獲得ITS2序列[17]。通過與GenBank序列進行Blastn比對，并通過參考序列進行注釋，獲得psbA-trnH序列[18]。利用MEGA 5.05對序列進行比對分析，比對后的序列統計GC含量，同時采用Kimura-2-Parameter（K2P）模型計算遺傳距離，并基于鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹，利用bootstrap（1000次重復）檢驗各分支的支持率。

3 結果與分析

3.1 PCR擴增產物檢測

金線蘭及其部分近緣種樣品的PCR擴增成功率均為100%，經瓊脂糖凝膠電泳得到PCR擴增電泳圖（圖1），擴增效果較好，條帶較亮，沒有拖尾現象，ITS2序列在500 bp左右，psbA-trnH序列在750～1000 bp。

M-Marker CK-空白對照，1～31為表1中樣品

3.2 ITS2和psbA-trnH序列的GC含量分析

通過MEGA5.05軟件對金線蘭及其近緣種ITS2和psbA-trnH序列的GC含量進行分析，結果顯示（表2），樣品1～39的ITS2序列長度為250～254 bp，其中金線蘭與長片金線蘭、滇南金線蘭的GC含量均為48.2%，金線蘭與臺灣銀線蘭、興仁金線蘭、麗蕾金線蘭、高金線蘭、斑葉蘭、大花斑葉蘭、小小斑葉蘭、小斑葉蘭、血葉蘭、西南齒唇蘭和艷麗齒唇蘭的GC含量差異分別為0.4%、0.4%、0.4%、0.8%、1.4%、2.2%、1.0%、3.4%、1.8%、2.6%和0.8%。樣品1～31的psbA-trnH序列長度為693～704 bp，其中金線蘭與臺灣銀線蘭的GC含量均為31.8%，金線蘭與興仁金線蘭、麗蕾金線蘭、長片金線蘭、滇南金線蘭、高金線蘭的GC含量差異分別為0.2%、0.1%、0.1%、0.2%和0.2%。

表2 ITS2和psbA-trnH序列長度及其GC含量

Table 2 Length and GC content of ITS2 and psbA-trnH sequences

編號代碼序列長度/bpGC含量/% ITS2psbA-trnHITS2psbA-trnH 1AR 125369548.231.8 2AR 225369548.231.8 3AR 325369548.231.8 4AR425369448.231.8 5AR525369548.231.8 6AR625369448.231.8 7AR725369548.231.8 8AR825369548.231.8 9AR925369548.231.8 10AR1025369448.231.8 11AR1125369548.231.8 12AR1225369448.231.8 13AR1325369548.231.8 14AR1425369548.231.8 15AR1525369448.231.8 16AR1625369548.231.8 17AR1725369548.231.8 18AR1825369448.231.8 19AF125370148.631.8 20AF225370148.631.8 21AF325370148.631.8 22AF425370148.631.8 23AF525370248.631.8 24AX125369348.632.0 25AX225369348.632.0 26AX325369348.632.0 27LY125363648.631.9 28LY225363648.631.9 29AL25369548.231.9 30AB25370448.232.0 31AE25370449.032.0 32LD1250 50.0 33LD2250 50.0 34GB252 50.4 35GS252 49.6 36GY254 49.2 37GR252 51.6 38OE250 50.8 39OM251 49.0

3.3 遺傳距離分析

ITS2序列種內種間K2P遺傳距離結果顯示（表3），金線蘭種內遺傳距離為0，金線蘭與長片金線蘭的種間遺傳距離為0，金線蘭與興仁金線蘭、麗蕾金線蘭、長片金線蘭、滇南金線蘭、高金線蘭的種間遺傳距離分別為0.004 0、0.004 0、0.004 0、0.012 0、0.008 0。金線蘭與斑葉蘭、大花斑葉蘭、小小斑葉蘭、小斑葉蘭、血葉蘭、西南齒唇蘭和艷麗齒唇蘭的種間遺傳距離分別為0.104 1、0.113 5、0.108 3、0.108 6、0.099 2、0.080 8、0.063 0。結果說明，基于ITS2序列的遺傳距離，可以鑒別金線蘭與興仁金線蘭、麗蕾金線蘭、長片金線蘭、滇南金線蘭、高金線蘭、斑葉蘭、大花斑葉蘭、小小斑葉蘭、小斑葉蘭、血葉蘭、西南齒唇蘭和艷麗齒唇蘭等近緣種混偽品，但是不能鑒別金線蘭與長片金線蘭。

psbA-trnH序列種內種間K2P遺傳距離結果顯示（表3），金線蘭種內遺傳距離為0，金線蘭與臺灣銀線蘭、興仁金線蘭、麗蕾金線蘭、長片金線蘭、滇南金線蘭、高金線蘭的種間遺傳距離分別為0.001 6～0.007 3，明顯大于金線蘭種內遺傳距離。結果表明，基于psbA-trnH序列的遺傳距離可作為鑒別金線蘭與其他近緣種混偽品的重要依據。

3.4 金線蘭及其同屬近緣種NJ樹的鑒定

利用鄰接法（NJ）構建金線蘭與其近緣種的ITS2、psbA-trnH序列的NJ系統發育樹。ITS2序列構建的NJ樹結果顯示（圖2），金線蘭與長片金線蘭聚為一支，興仁金線蘭、麗蕾金線蘭、臺灣銀線蘭、和滇南金線蘭聚為一支、高線蘭單獨聚為一支，西南齒唇蘭、艷麗齒唇蘭和血葉蘭聚為一支，斑葉蘭、大花斑葉蘭、小小斑葉蘭和小斑葉蘭聚為一支?；贗TS2序列構建的NJ樹結果顯示，除長片金線蘭外，金線蘭與其余近緣種混偽品可以明顯區分。psbA-trnH序列構建的NJ樹結果顯示（圖3），18批金線蘭單獨聚為一支，臺灣銀線蘭、麗蕾金線蘭、興仁金線蘭、長片金線蘭也各自聚為一支，高金線蘭和滇南金線蘭聚為一支，基于psbA-trnH序列構建的NJ樹結果顯示，金線蘭與臺灣銀線蘭、興仁金線蘭、高金線蘭和滇南金線蘭可以區分開；但是金線蘭與麗蕾金線蘭、長片金線蘭較難區分，其支持率只有39%，并未達到物種鑒定的標準。

表3 基于ITS2和psbA-trnH序列的金線蘭及其近緣種的K2P遺傳距離

Table 3 K2P genetic distances of A. roxburghii and its closely related species based on ITS and psbA-trnHsequences

類別ITS2遺傳距離psbA-trnH遺傳距離 金線蘭種內 0 0 金線蘭與臺灣銀線蘭種間0.004 00.002 9 金線蘭與興仁金線蘭種間0.004 00.004 3 金線蘭與麗蕾金線蘭種間0.004 00.001 6 金線蘭與長片金線蘭種間00.001 4 金線蘭與滇南金線蘭種間0.012 00.007 3 金線蘭與高金線蘭種間0.008 00.007 3 金線蘭與斑葉蘭0.104 1 金線蘭與大花斑葉蘭0.113 5 金線蘭與小小斑葉蘭0.108 3 金線蘭與小斑葉蘭0.108 6 金線蘭與血葉蘭0.099 2 金線蘭與西南齒唇蘭0.080 8 金線蘭與艷麗齒唇蘭0.063 0

圖2 基于NJ法（ITS2數據）構建系統發育樹

圖3 基于NJ法(psbA-trnH數據) 構建系統發育樹

4 討論

核基因ITS2片段和葉綠體基因psbA-trnH片段作為國際通用條形碼序列，被廣泛應用于藥用植物的分子鑒定[19]。目前，鮮有文獻對多種金線蘭屬植物的DNA條形碼進行研究。Lv等[20]在對金線蘭、臺灣銀線蘭、血葉蘭、斑葉蘭等4個物種DNA條形碼研究中發現，ITS2可以將金線蘭與同屬植物臺灣銀線蘭、血葉蘭屬植物血葉蘭、斑葉蘭屬植物斑葉蘭區分開，其研究結果與本試驗的ITS2結果一致，但應用核糖體ITS2 序列卻無法鑒別金線蘭與長片金線蘭。同時，本研究單獨應用葉綠體psbA-trnH序列可較好的鑒別金線蘭與臺灣銀線蘭、興仁金線蘭、高金線蘭和滇南金線蘭，但不能用于鑒別金線蘭與麗蕾金線蘭、長片金線蘭。研究表明，物種間的GC含量差異可反映其親緣關系的遠近[21]。本研究通過對金線蘭及其近緣種ITS2序列的GC含量差異分析可知，長片金線蘭與金線蘭的GC含量沒有差異，系統發育樹中可見長片金線蘭與金線蘭聚為一支；而在ITS2序列中，滇南金線蘭與金線蘭的GC含量也沒有差異，但在系統發育樹中滇南金線蘭與金線蘭卻沒有聚為一支。psbA-trnH序列的GC含量差異分析顯示，麗蕾金線蘭和長片金線蘭二者與金線蘭GC含量差異均為0.1%，說明二者與金線蘭親緣關系較近，在系統發育樹中可見金線蘭、麗蕾金線蘭和長片金線蘭聚為一大支。因此，序列的GC含量與金線蘭屬植物的親緣關系是否存在必然聯系還有待進一步研究。綜上所述，ITS2和psb A-trnH序列可以鑒別金線蘭與其遺傳距離較遠的近緣種，而金線蘭與長片金線蘭的鑒別還需進一步研究。此外，金線蘭屬植物種類較多，后續研究有必要進一步擴大取樣范圍。本研究工作可為金線蓮基原植物的鑒定及金線蘭屬植物的親緣關系與分類提供有益借鑒。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Identification ofand its closely related species based on ITS2 and psbA-trnH sequences

WU Yan-bin1, ZHANG Chao1, WU Jian-guo1, WU Jin-zhong1, ZHENG Cheng-jian2

1. College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China 2. Department of Chinese Medicine Authentication, Faculty of Pharmacy, Naval Medical University, Shanghai 200433, China

To identifyand its closely related species using ITS2 and psbA-trnH barcode.Total genomic DNA was isolated fromand its related species. Nuclear DNA ITS2 and chloroplast gene psbA-trnH sequences were amplified and sequenced. The Kimura 2-parameter (K2P) distances were calculated. Identification analyses was performed using Neighbor-joining (NJ) methods.After PCR amplification, the ITS2 regions of tested samples were sequenced and their lengths were from 250—254 bp, and the GC content was 48.2%—51.6%. The lengths of psbA-trnH regions ranged in size from 636 to 704 bp, with GC content ranging from 31.8%—32.0%. Based on K2P model, the intra-specific genetic distances ofin ITS2 and psbA-trnH regions were smaller than the inter-specific ones ofwith its closely related species. The NJ tree based on ITS2 sequence showed thatcan be distinguished clearly from its adulterants except for, while the NJ tree based on psbA-trnH sequence showed thatcan be distinguished clearly from otherspecies except forandITS2 and psbA-trnH sequences can be used as potential DNA barcode to distinguishfrom its related species with genetic distances.

Blume;(Wall.) Lindl; DNA barcoding; ITS2 sequences; psbA-trnH sequences

R286.2

A

0253 - 2670(2022)18 - 5807 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.023

2022-04-28

國家自然科學基金資助項目（82174081，81773846）；福建省科技廳高校產學合作項目（2020Y4015）；上海市浦江人才計劃（21PJD082）

吳巖斌（1982—），男，副研究員，研究方向為中藥藥效物質及品質評價。E-mail: wxsq1@163.com

吳錦忠，教授，研究方向為中藥藥效物質及品質評價。E-mail: jinzhongfj@126.com

鄭承劍，教授，研究方向為中藥藥效物質及品質評價。E-mail: cjzheng1984@126.com

[責任編輯 時圣明]