黃芩苷抑制脂多糖促巨噬細胞氧化應激損傷作用的研究

黃偉琨 徐秋艷 周婷

貴州省人民醫院口腔科 貴陽 550002

牙周炎是成年人缺失牙的重要原因[1]，同時也是威脅人類健康的重要疾病[2]。牙周炎的治療方式主要包括非手術治療與手術治療[3]，以及局部藥物輔助治療[4]。近年來，中醫藥在牙周炎局部輔助治療方面具有獨特的優勢，受到學者們的重視[5-7]。黃芩苷（baicalin）由于其優良的抗炎及抗氧化應激特性，在心血管疾病[8-9]、肝臟疾病[10-11]的防治方面具有重要作用。但是由于黃芩苷在牙周炎局部藥物治療領域的相關研究尚不充分[12]，極大地限制了黃芩苷在牙周炎領域的廣泛應用。因此，加強黃芩苷在牙周炎治療領域的相關基礎研究，對于未來將黃芩苷應用于牙周炎的藥物輔助治療具有重要作用。

鑒于氧化應激反應既是牙周炎發生發展的重要分子機制[13]，也是牙周炎治療領域的一個重要作用靶點[14-16]，黃芩苷作為強效的抗氧化應激藥物，是否能夠調控牙周炎的氧化應激狀態，目前尚未見相關報道。因此，本研究采用牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）的致病因子脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激牙周組織重要細胞之一——巨噬細胞[17]，構建牙周炎的體外細胞模型，同時采用不同濃度的黃芩苷進行干預，對黃芩苷在P.gingivalis-LPS促巨噬細胞發生氧化應激反應中的作用及相關分子機制進行初步探討。

1 材料和方法

1.1 主要材料

黃芩苷（Sigma公司，美國）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide diamutase，SOD）酶聯免疫吸附試劑盒（南京建成生物工程研究所）；P.gingivalis-LPS（sigma公司，美國）；核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）抗體（Cell Signaling Technology公司，美國）；培養基、胎牛血清（Gibco公司，美國）；cDNA合成試劑盒、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（GeneCopoeia公司，美國）。

1.2 人單核巨噬細胞系（human monocytic-leukemia cell，THP-1）來源的巨噬細胞的誘導及處理

THP-1人單核細胞株，購買于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。細胞培養于含10%胎牛血清的細胞培養基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）中，培養條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。采用課題組前期研究[17]方法，用佛波酯將其誘導成巨噬細胞。P.gingivalis-LPS濃度為10 ng·mL-1，黃芩苷干預濃度分別為5、10 μmol·L-1，根據實驗需求分為對照組（未加入P.gingivalis-LPS和黃芩苷的正常細胞組）、LPS組、LPS+黃芩苷（5 μmol·L-1）組及LPS+黃芩苷（10 μmol·L-1）組，培育時間為72 h。

1.3 細胞活性檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK8）檢測細胞活性

巨噬細胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板，并按照上述分組處理后，參照CCK8的操作說明，加入CCK8混合液100 μL，孵育4 h，采用酶標儀測定450 nm波長處每個組的光密度（optical density，OD）。

1.4 LDH的含量

巨噬細胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板，并按照上述分組進行處理，處理結束前1 h，往96孔板加入LDH釋放試劑，離心后吸取上清液于另一96孔板中，隨后加入LDH檢測工作液，在室溫條件下，孵育30 min后，采用酶標儀檢測上清液的OD值，并通過標準曲線換算成LDH含量。

1.5 細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量的檢測

細胞根據分組處理后，采用2,7-二氫二氯熒光黃（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFADA）熒光探針對巨噬細胞ROS水平進行檢測。實驗步驟簡述如下：加入10 μmol·L-1的DCFA-DA熒光探針，然后繼續培養30 min，采用無血清DMEM洗滌細胞2～3遍，使用流式細胞儀對細胞內ROS含量進行檢測。

1.6 MDA及SOD活性的檢測

按照實驗分組處理細胞后，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌收集的細胞并用裂解液對細胞進行裂解，隨后使用MDA及SOD試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書操作，采用酶標儀對各組的MDA及SOD活性進行檢測。

1.7 細胞凋亡的檢測

細胞按照分組條件處理后，收集細胞，加入100 μL Binding Buffer，2 μL Annexin V-FITC和2 μL PI混勻，在室溫條件下進行孵育，5 min后采用流式細胞儀檢測細胞的凋亡數。

1.8 蛋白質印跡法（Western Blot，WB）檢測Nrf2的蛋白表達

細胞按照上述分組處理后，棄去上清液，胰酶消化后離心收集細胞，加入100 μL的裂解液，離心15 min，收集細胞總蛋白、胞質蛋白以及胞核蛋白，蛋白經過定量，依次進行電泳、轉膜、封閉，洗膜，隨后將Nrf2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、Histone H3抗體按照說明書進行稀釋，孵育過夜。充分清洗后，使用二抗室溫孵育2 h。隨后清洗后顯影，分析條帶的灰度值，以GAPDH為內參，計算Nrf2總蛋白及Nrf2胞質蛋白的相對表達量，以Histone H3為內參，計算Nrf2胞核蛋白的相對表達量。

1.9 統計方法

采用GraphPad Prism 8.0.2軟件對數據進行處理。計量資料采用均數±標準差表示。采用單因素方差分析對各組之間的差異進行比較，P<0.05則認為各組之間的差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芩苷對P.gingivalis-LPS致巨噬細胞損傷的影響

P.gingivalis-LPS（10 ng·mL-1）刺激巨噬細胞72 h后，采用CCK8與LDH試劑盒對P.gingivalis-LPS致巨噬細胞的損傷進行檢測。結果顯示：巨噬細胞的細胞活性受到P.gingivalis-LPS的顯著抑制，同時P.gingivalis-LPS的刺激導致細胞LDH含量的上調；不同濃度黃芩苷（5、10 μmol·L-1）進行干預后，則能夠顯著減輕P.gingivalis-LPS致細胞活性的下降，同時在黃芩苷干預組LDH含量顯著下降（圖1）。

圖1 黃芩苷對LPS致巨噬細胞損傷的影響Fig 1 The effects of baicalin on cell injury of LPS on macrophages

2.2 黃芩苷對P.gingivalis-LPS致巨噬細胞氧化應激反應的影響

P.gingivalis-LPS刺激巨噬細胞72 h后，采用DCFA-DA熒光探針、MDA及SOD試劑盒，檢測P.gingivalis-LPS對巨噬細胞氧化應激相關指標的影響。結果顯示：P.gingivalis-LPS能夠顯著上調細胞內ROS的含量及MDA的活性，同時導致SOD活性顯著下調。通過不同濃度黃芩苷干預后，均能夠顯著抑制P.gingivalis-LPS導致的ROS和MDA升高，且在濃度為10 μmol·L-1的黃芩苷干預時，SOD活性較LPS組有顯著升高（圖2）。

圖2 黃芩苷對LPS致巨噬細胞氧化應激反應的作用Fig 2 The effects of baicalin on oxidative stress of LPS on macrophages

2.3 黃芩苷對P.gingivalis-LPS致巨噬細胞凋亡的影響

P.gingivalis-LPS刺激巨噬細胞72 h后，采用流式細胞儀檢測P.gingivalis-LPS對細胞凋亡的影響。結果顯示：P.gingivalis-LPS能夠誘發巨噬細胞發生細胞凋亡，不同濃度黃芩苷干預，均能夠顯著降低P.gingivalis-LPS對細胞凋亡的促進作用（圖3）。

圖3 不同濃度黃芩苷對LPS致巨噬細胞凋亡的影響Fig 3 The effects of baicalin on apoptosis of LPS on macrophages

2.4 黃芩苷抑制P.gingivalis-LPS促細胞氧化應激損傷及細胞凋亡的分子機制

P.gingivalis-LPS刺激巨噬細胞72 h后，采用WB檢測P.gingivalis-LPS對細胞抗氧化應激重要分子Nrf2表達的影響。結果顯示：P.gingivalis-LPS的刺激并不影響細胞Nrf2的總蛋白量、胞質蛋白量及胞核蛋白量的表達。但不同濃度黃芩苷的干預，均能夠顯著上調細胞胞核的Nrf2表達（圖4）。

圖4 黃芩苷抑制LPS致巨噬細胞氧化應激損傷及細胞凋亡的分子機制Fig 4 The mechanisms underlying baicalin attenuating LPS-induced oxidative injury of macrophages

3 討論

本研究采用P.gingivalis-LPS刺激THP-1來源的巨噬細胞來構建牙周炎細胞模型，同時采用不同濃度的黃芩苷對上述細胞模型進行干預，并隨后對氧化應激損傷及細胞凋亡相關指標進行了檢測。研究結果顯示：P.gingivalis-LPS能夠促進巨噬細胞發生氧化應激損傷（圖1、2），同時促進細胞發生凋亡現象（圖3）?，F有的研究[18-20]顯示：LPS能夠促進牙周相關細胞發生氧化應激損傷，最終導致細胞的成骨功能紊亂。在本研究中，黃芩苷的干預能夠使ROS的含量下降及MDA的活性減低，且隨著干預濃度的增加，ROS的含量和MDA的活性有逐漸降低的趨勢，同時在高濃度黃芩苷（10 μmol·L-1）干預時SOD的活性有顯著增加，表明黃芩苷能減輕P.gingivalis-LPS對巨噬細胞所造成的氧化應激損傷。研究顯示：黃芩苷是強效的抗氧化劑，能夠減輕出血性腦損傷的氧化應激水平[21]，減輕缺氧缺糖所導致的神經元細胞損傷[22]。抑制高糖導致腎臟的氧化應激損傷[23]。本研究結果與上述研究結果基本一致，提示黃芩苷能夠有效抑制牙周炎的氧化應激水平，但黃芩苷的有效干預濃度還需要進一步的研究。

細胞凋亡是一種不同于細胞壞死的死亡方式，它由特定的信號分子啟動，在基因調控下，遵循自身的程序而自我消亡的過程。細胞凋亡在牙周病的發生和發展中也起著重要作用。目前認為，氧化應激反應的過度激活會導致細胞凋亡的發生，氧化應激反應激活后產生過多的ROS，ROS通過激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路、激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑、造成線粒體損傷、損傷細胞DNA等途徑誘導細胞凋亡[24]。本研究結果顯示：黃芩苷的干預能顯著抑制P.gingivalis-LPS刺激巨噬細胞發生的細胞凋亡，同時ROS的含量也相應下降，提示黃芩苷可能通過抑制氧化應激反應中ROS的產生從而起到抑制細胞凋亡的作用，其具體作用機制還需要進一步的研究。也有研究[25]表明：黃芩苷能夠誘導THP-1細胞發生細胞凋亡，可能由于此研究使用的是THP-1單核細胞，并且黃芩苷濃度較高，而本研究的實驗條件是P.gingivalis-LPS刺激佛波酯誘導的THP-1巨噬細胞，而且黃芩苷濃度較低，所以本研究沒有出現黃芩苷促進細胞凋亡的現象。課題組將在今后的研究中，探討不同濃度黃芩苷對THP-1單核細胞及THP-1來源巨噬細胞增殖及凋亡的影響。那么黃芩苷對P.gingivalis-LPS促巨噬細胞氧化應激損傷的抑制機制是什么呢？

研究顯示：黃芩苷主要通過磷脂酰肌醇激酶/絲氨酸/蘇氨酸激酶/Forkhead轉錄因子FoxO1[26-27]、MAPK/低氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）[23,28]、Nrf2[29]等信號通路抑制氧化應激反應。其中Nrf2是抗氧化應激損傷的重要分子[30]，同時也是慢性疾病治療的重要靶點[31]。研究顯示：Nrf2既是黃芩苷發揮其生物學效應的重要作用靶點[29]，同時也是調控牙周炎發生發展的關鍵基因[32]。但是黃芩苷是否通過調控牙周組織的Nrf2表達，發揮其抑制牙周炎氧化應激反應的作用，目前尚未見相關報道。因此，課題組對黃芩苷干預下巨噬細胞Nrf2表達的水平變化進行了檢測。結果顯示：黃芩苷的干預能夠顯著促進Nrf2的胞核蛋白表達，提示黃芩苷促進了Nrf2的核轉位。Nrf2核轉位后，能夠激活細胞的抗氧化應激系統，從而抑制外界刺激對細胞造成的氧化應激損傷，也抑制了氧化應激反應對細胞其他重要功能的有害影響[33-34]。但P.gingivalis-LPS的刺激對Nrf2的表達沒有影響，可能跟本實驗采用的LPS濃度較低有關。有研究顯示：其他中藥也能夠通過Nrf2信號通路治療牙周炎。例如姜黃素能夠通過上調Nrf2表達，促進牙周膜干細胞的成骨分化[35]；丹參能夠通過調節Nrf2信號通路，抑制氧化應激反應[36]；橙皮素、丹皮酚也能夠通過上調Nrf2的表達，抑制牙周炎的牙槽骨吸收[20,37]。本研究結果與上述研究基本一致。

綜上所述，通過本研究能夠進一步豐富黃芩苷發揮生物學功效的分子機制，同時也為將黃芩苷應用于牙周炎防治領域提供理論依據。但其抗氧化的具體分子機制，如黃芩苷是如何促進Nrf2核轉位，對Nrf2信號通路上的關鍵信號分子有何影響仍有待進一步的研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。