赤霉烯酮通過PI3K-Akt信號通路誘導驢支持細胞炎癥與細胞凋亡的機制

孫瀟，于樹濤，孫玉江，張孝忠，張國梁，宋俊霖

(1.青島農業大學中心實驗室，山東青島 266109，2.青島農業大學動物科技學院；3.萊陽市動物疫病預防控制中心，山東煙臺 265200)

赤霉烯酮 (zearalenone，ZEA ) 是由鐮刀菌產生的霉菌毒素，常見于玉米、小麥、燕麥和麥草中，分子式 C18H22O5。ROMER檢測中心國內畜禽谷物原料與飼料霉菌毒素檢測報告顯示[1]，大中型飼料與養殖企業采集樣品中霉菌毒素的檢出比例為95%，青貯飼料中ZEA檢出率為65%。有報道表明，動物攝入霉菌毒素后可能會出現腹瀉、腸道出血、繁殖性能降低、發育異常等癥狀[2]。驢誤食霉菌毒素后會發生肝出血、脾淤血、腸道積液等病理現象，嚴重中毒時可能會死亡[3-5]。2019年全國驢存欄量260.1萬頭[6]，產值近千億元。山東省規?；B驢場存欄量占全省驢存欄總量的80%，同時占全國300頭以上規模養殖場的61%[7]。目前，馬屬動物飼草料中霉菌毒素含量尚未出臺國家或者地方標準，然而集約化養驢場的飼草料中ZEA等霉菌毒素含量過高已經成為損害驢繁殖性能的重要原因之一[8-9]。但是，到目前為止此類問題并未引起廣泛和足夠的重視。因此，探究ZEA等霉菌毒素妨害驢繁殖性能的主要途徑與作用機制可制定飼草料中該毒素限量的國家標準，為促進家畜高效繁殖和健康養驢提供理論支持。

PI3K (胞內磷脂酰肌醇激酶，Phosphatidylinositide 3-kinases)參與調節了細胞凋亡、轉錄等多種細胞內生物過程[10]。PI3K的主要下游效應子是Akt (絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，又稱 PKB，protein kinase B)，PI3K被激活與磷酸化后引起Akt活化來調節生物過程[11]。Hossini等[12]報道了PI3K/Akt途徑異常能夠誘導多能干細胞的凋亡。Koh等[13]研究了PI3K/Akt通路參與了細胞的增殖、分化和遷移，細胞內營養因子可以激活PI3K途徑，進而促進了Akt1的磷酸化，導致細胞增殖。因此，PI3K-Akt信號分子在細胞凋亡與增殖等多種生物過程中發揮了至關重要的作用。

支持細胞(sertolicells，SCs)在家畜睪丸曲細精管中具有營養、支持、分泌、吞噬等多種功能，是血-睪屏障的重要組成部分之一[14-16]。支持細胞能夠分泌多種因子保證精子發生正常進行[17]，其異常發育或受損后將會對精子發生產生較為嚴重的影響[6]。目前為止，國內外有關ZEA暴露引起馬屬動物繁殖障礙的研究通常是從毒素暴露后影響動物的攝食或流產等現象去解釋，而毒素直接作用的靶器官如睪丸，卵巢或子宮等蛋白、基因表達差異卻鮮有報道，且ZEA等霉菌毒素的毒性作用機制尚不完全清楚[18-21]。本研究通過采用轉錄組測序(RNA-seq)方法分析評估了10 μmol·L-1和30 μmol·L-1ZEA在體外培養的驢睪丸支持細胞毒性作用，探討ZEA通過PI3K-Akt信號通路誘導驢支持細胞炎癥與細胞凋亡的分子機制，試驗結果將為研究霉菌毒素損害驢睪丸發育的機制和制定馬屬動物飼草料中ZEA等霉菌毒素的限量標準提供一定的理論借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑

赤霉烯酮(Z2125)、牛血清蛋白(BSA)、AnnexinV-FITC/7-AAD凋亡檢測試劑盒(APOAC)均購自Sigma-Aldrich?公司(美國)；青-鏈霉素(雙抗)混合液(PS,P1400)、DMSO(D8371)、非必需氨基酸(NEAA,N1250)、丙酮酸鈉(SP,SP0100)、膠原酶Ⅳ(C8160)、透明質酸酶(H8030)、DNA酶Ⅰ(D8071)均購自Solarbio?公司(北京)；FBS(ST30-3302)購自PAN?公司(巴伐利亞)；胰酶(SH30042.01)、DMEM/HIGHGLUCOSE(SH300 22.01)購自Hyclone?公司(北京)；TUNEL(A113)凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；InvitrogenTRIzol(15596026)購自Thermo Fisher Scientific?公司(美國)。細胞免疫熒光抗體信息見表1。

表1 抗體信息表Table 1 The information of the antibodies

1.2 試驗方法

1.2.1 驢睪丸收集與睪丸支持細胞培養處理

取新鮮屠宰的驢(Equusasinus)睪丸，迅速放置于37 ℃含體積分數5%青-鏈霉素生理鹽水的保溫杯中，1 h以內運回實驗室。使用含體積分數1%青-鏈霉素的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS) 清洗驢睪丸，去除多余脂肪與結締組織。清洗后的組織放入無水乙醇中浸泡10～20 s，使用PBS沖洗3遍，睪丸樣品置于無菌操作臺上，除去白膜，將剩余睪丸實質剪碎至2～3 mm3小塊，去除可見血管和結締組織，用含雙抗的PBS沖洗后移入50 mL離心管中，加入2～3倍體積膠原酶IV(約2 mL)與0.2 mL·L-1透明質酸酶(約2 mL)消化液，用1 mL移液器輕輕吹打混勻，37 ℃消化10～15 min，每隔3～5 min觀察曲細精管分散狀況；之后將睪丸組織與消化液轉移至50 mL離心管，加入相同體積不含FBS的DMEM培養基，1 200 r·min-1離心5 min，棄上清；分別加入2 mL 37 ℃ 預熱的0.25 mL·L-1胰酶與10 μg·mL-1DNA酶 I的消化液，37 ℃培養箱消化5～8 min，其間每隔1 min 200 r·min-1震蕩一次；加入等體積含體積分數1% FBS的DMEM培養基終止消化；過200目和300目高壓滅菌的細胞篩過濾得細胞懸液；細胞懸液1 200 r·min-1離心5 min，加入10 mL含1% FBS的DMEM培養基在體積分數5 % CO2、37 ℃的條件下培養6～8 h，然后更換全液。試驗中采用10 μmol·L-1和30 μmol·L-1ZEA連續72 h體外培養并處理支持細胞。

1.2.2 驢睪丸支持細胞純度鑒定

本研究通過對支持細胞特異表達的SOX 9蛋白，進行細胞免疫熒光染色的方法鑒定支持細胞的分離純度[22]。采用Image J軟件進行計數和統計分析。

1.2.3 TUNEL檢測

收集ZEA處理后的支持細胞，使用4 mL·L-1多聚甲醛溶液常溫下固定30～40 min，取細胞懸液于多聚賴氨酸處理的載玻片上，涂抹均勻后于42 ℃熱臺上烘烤2 h左右。PBS洗2～3次，每次5 min。使用1 mL·L-1Triton X-100透化10 min。PBS洗3次，每次5 min，置于濕盒中保持濕潤。按照試劑盒說明書對樣品進行TUNEL標記，之后使用Hoechst 33342染細胞核，最后每個樣品滴加100 μL抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片，4 ℃干燥避光保存。波長620 nm熒光觀察BrightRed紅色熒光，波長460 nm熒光觀察Hoechst 33342藍色熒光。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

收集ZEA處理后的支持細胞，加入4 ℃的PBS后混勻，300 r·min-1離心5 min后棄上清，1×Binding Buffer重懸細胞，調整細胞懸液密度為1 × 106個·mL-1。設置陰性對照組、單染對照組、對照組和試驗處理組。每組取100 μL細胞懸液，加入5 μL的7-AAD和Annexin V-FITC，輕輕吹打混勻，25 ℃避光孵育15 min。最終加入400 μL 1×Binding Buffer終止反應，上機檢測。

1.2.5 RNA提取和轉錄組分析

每個樣本使用1 mL Invitrogen TRIzol裂解收集大約1×107個細胞，7 500 r·min-14 ℃離心5 min。上下顛倒混勻后室溫放置10 min。12 000 r·min-14 ℃離心10 min，棄上清。加1 mL體積分數75 % DEPC水配置酒精。短暫渦旋后7 500 r·min-14 ℃離心5 min，棄上清，風干10 min。加30 μL DEPC水溶解RNA。RNA測序由Novogene使用Hiseq 4000平臺進行，每組至少3個生物學重復。

1.2.6 差異表達基因的數據預處理和鑒定

測序數據分為對照組(CTRL)、10 μmol·L-1處理組(低濃度處理組)、30 μmol·L-1處理組(高濃度處理組)，使用NovoMagic平臺對支持細胞進行分析、富集并篩選差異表達基因(differential expression genes，DEGs)。使用DEseq2軟件檢測差異表達基因，設置參數為| log 2 FoldChange|>1，P<0.05。使用NovoMagic平臺對DEGs進行差異表達分析和功能富集分析。

1.2.7 細胞免疫熒光染色

收集驢支持細胞，體積分數4%多聚甲醛溶液固定1 h。吹打混勻細胞懸液滴加在多聚賴氨酸處理過的載玻片上，于42 ℃熱臺上烤1.5 h。PBS洗3次，每次4 min。PBST溶液透明10 min，PBS洗1遍。在細胞區域滴加等體積封閉液，室溫封閉1 h。細胞樣品區域加50 μL一抗(使用封閉液稀釋)，濕盒內4 ℃過夜孵育。隨后將樣品置于室溫30 min進行復溫。用含體積分數1% BSA的PBS洗3次，每次3 min。滴加100 μL二抗，37 ℃避光孵育1 h。PBS洗3次，每次5 min。使用10 μg·mL-1Hoechst 33342染核2 min，PBS洗1遍。滴加抗熒光衰減封片劑，蓋蓋玻片，4 ℃干盒中避光保存。使用Image J軟件進行陽性細胞計數。熒光二抗為：山羊抗兔AlexaFluor594-IgG和山羊抗兔AlexaFluor488-IgG。以上試驗3次重復。

1.3 數據處理與分析

本研究使用GraphPad Prism 9軟件進行統計學分析，對照組和處理組之間的差異分析使用雙尾t檢驗的方法，若P<0.05時，認為有統計學差異，用*表示，若P<0.01時，認為有顯著統計學差異，用**表示。

2 結果與分析

2.1 體外分離培養驢支持細胞純度檢測結果

為檢測分離培養驢支持細胞的純度，本鑒定方法為利用細胞免疫熒光染色測定支持細胞特異蛋白SOX 9的表達[22-23]。統計SOX 9陽性數與細胞核染色 Hoechst 33342數量的比率(圖1B)，最終計算驢支持細胞占培養細胞總數的比例。結果顯示，SOX 9蛋白在分離培養的驢睪丸支持細胞內均呈現正常定位 (圖1A)，陰性對照 (驢成纖維細胞) 觀察到熒光信號 (圖1A)。結果顯示了支持細胞的分離純度。

2.2 ZEA處理導致驢支持細胞的凋亡增加

體外培養的驢支持細胞使用10 μmol·L-1和30 μmol·L-1濃度ZEA連續處理72 h (圖1C)。TUNEL檢測結果顯示:ZEA暴露可能導致驢支持細胞顯著凋亡 (圖2A、2B)。TUNEL陽性率為：對照組為5.17%±0.72%；10 μmol·L-1ZEA處理組為14.77%±0.91%；30 μmol·L-1ZEA處理組為23.59%±1.15%，結果與ZEA處理濃度的升高呈正相關。流式細胞儀檢測結果顯示：ZEA連續處理72 h后，10 μmol·L-1ZEA處理組凋亡率可達8.06%±0.06%，30 μmol·L-1處理組凋亡率達到14.22%±0.09% (圖2C)。以上結果表明ZEA可能誘導驢支持細胞凋亡。

A.TUNEL (紅)和Hocehst 33342 (藍)染色檢測結果，標尺：50 μm；B.TUNEL陽性率統計圖；C.流式細胞檢測結果。圖2 10 μmol·L-1和30 μmol·L-1 ZEA誘導驢支持細胞72 h TUNEL、流式凋亡檢測結果Fig.2 The results of TUNEL and flow cytometry apoptosis detection of E. asinus sertoli cells treated by 10 μmol·L-1 and 30 μmol·L-1 ZEA for 72 h

2.3 ZEA暴露改變了驢支持細胞基因表達模式

RNA-seq結果(圖3A)顯示：與對照組相比較，在10 μmol·L-1處理組檢測到803個差異表達基因，其中上調差異表達基因共391個，下調差異表達基因共412個；30 μmol·L-1處理組檢測到5 947個差異表達基因，其中上調差異表達基因共2 816個，下調差異表達基因共3 131個。與10 μmol·L-1ZEA處理組相比較，在30 μmol·L-1ZEA處理組中共檢測到5 218個差異表達基因，其中上調差異表達基因共2 407個，下調差異表達基因共2 811個(圖3B)。VENN分析結果顯示30 μmol·L-1ZEA處理組差異基因與10 μmol·L-1ZEA處理組差異基因存在顯著差異(圖3C)。因此，30 μmol·L-1ZEA處理組與10 μmol·L-1ZEA處理組支持細胞基因表達模式差異顯著。

A.ZEA 處理驢支持細胞差異表達基因火山圖；B.柱狀圖表示差異表達基因數目，紅色表示上調，綠色表示下調；C.VENN圖顯示對照組與ZEA處理組之間的差異基因個數。圖3 ZEA處理影響驢支持細胞基因表達模式Fig.3 The effect of ZEA treatment on gene expression of E. asinus sertoli cells

2.4 差異表達基因功能富集分析

為分析ZEA不同處理組差異表達基因的功能，分別將10 μmol·L-1ZEA 與30 μmol·L-1ZEA處理組中的差異表達基因進行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)信號通路富集分析，設置P<0.05的標準篩選差異表達基因顯著性高的信號通路(圖4)。結果顯示：10 μmol·L-1ZEA 處理影響的生物進程有cell cycle(細胞周期)、p53信號通路等 (圖4A)，30 μmol·L-1ZEA處理影響的生物進程有PI3K-Akt信號通路、MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)信號通路、Ras信號通路、Apoptosis(程序性細胞死亡)以及TNF(腫瘤壞死因子)信號通路等 (圖4B)。下調的信號通路包括PI3K-Akt信號通路 (P=0.001 458 6，計數：22)、類固醇合成途徑 (P=0.007 337 7，計數：10)、細胞周期 (P=0.006 938 9，計數：21)等信號通路。

A.10 μmol·L-1 ZEA處理組DEGs KEGG信號通路富集分析氣泡圖；B.30 μmol·L-1 ZEA處理組DEGs KEGG信號通路富集分析氣泡圖。圖4 對 10 μmol·L-1 ZEA 與 30 μmol·L-1 ZEA處理組驢支持細胞差異表達基因進行KEGG信號通路富集分析結果Fig.4 The results of KEGG signal pathway enrichment analysis on the differential genes expression of E. asinus sertoli cells in 10 μmol·L-1 and 30 μmol·L-1 ZEA treatment group

2.5 ZEA誘導驢支持細胞炎癥反應并影響類固醇激素受體基因表達

對差異基因數據進一步分析，結果顯示：白介素-10受體因子A (IL 10 RA) 在ZEA處理組中表達量與對照組相比顯著升高；差異基因雌激素受體1 (ESR1) ZEA處理組中表達量與對照組相比顯著升高。為了驗證該分析結果，我們使用細胞免疫熒光檢測ZEA處理后的驢支持細胞中炎癥反應與類固醇激素受體相關差異基因蛋白表達量的變化。結果表明，ZEA處理組顯著提高了支持細胞白介素-10受體因子A (IL 10 RA) 蛋白的相對表達水平(圖5)。細胞免疫熒光結果顯示，支持細胞中ESR 1蛋白表達趨勢與轉錄組數據相一致 (圖6)。

A.10 μmol·L-1 和30 μmol·L-1 ZEA處理組細胞免疫熒光檢測IL 10 RA的表達 (綠色)；B.IL 10 RA蛋白陽性表達統計。圖5 細胞免疫熒光檢測ZEA影響驢支持細胞IL 10 RA蛋白的表達Fig.5 The effect of ZEA on IL 10 RA protein expression of E. asinus sertoli cells by ICC

A.10 μmol·L-1 和30 μmol·L-1 ZEA處理組細胞免疫熒光檢測ESR 1的表達 (綠色)；B.ESR 1蛋白陽性表達統計。圖6 細胞免疫熒光檢測ZEA影響驢支持細胞ESR 1蛋白的表達Fig.6 The effect of ZEA on ESR 1 protein expression of E. asinus sertoli cells by ICC

3 討論

我國是全球唯一具備驢養殖、屠宰、加工及銷售等全產業鏈國家[24]。近年來，驢的功能與作用由役用逐步向肉用、藥用保健等多用途的“活體經濟”方向轉型，且驢的飼養逐步向集約化養殖方向轉變。飼料中的霉菌毒素特別是ZEA污染已嚴重影響規?；曫B中驢的繁殖性能。本研究使用10 μmol·L-1和30 μmol·L-1濃度的ZEA連續72 h暴露體外培養的驢支持細胞，利用RNA-seq的手段分析并探討ZEA損害驢支持細胞發育并導致其凋亡的機制，采用TUNEL檢測、細胞免疫熒光與流式細胞檢測的方式驗證了ZEA誘導驢支持細胞炎癥反應和細胞凋亡的分子機制。

流式細胞檢測和TUNEL標記結果顯示30 μmol·L-1濃度的ZEA處理顯著高于10 μmol·L-1驢支持細胞凋亡率，該結果與廖美芳[25]利用ZEA處理IPEC-J2細胞誘導凋亡結果一致，也與利用ZEA誘導豬巨噬細胞凋亡的結果一致[26]。以上結果說明ZEA支持細胞發揮毒性作用具有呈劑量依賴性的特點。PI3K-Akt信號通路參與了多種生理過程，如細胞生長、增殖、運動和代謝等[27]，還可能與多種類型細胞的炎癥反應與癌變息息相關[28]。本研究結果顯示：ZEA處理支持細胞通過PI3K-Akt信號通路影響了與細胞周期相關的基因表達：CDK1和CCNB1基因的mRNA表達量均顯著提高[29]；KEGG富集分析結果顯示，30 μmol·L-1的ZEA處理組DEGs多富集在Hippo信號通路，該結果與Zhang等[30]報道結果相符。另有研究表明，ZEA暴露可影響糖酵解過程，進而干擾大鼠支持細胞內乳酸合成，并可能影響雄性大鼠的繁殖機能。本試驗結果表明，ZEA處理后支持細胞內PGK1和PFKM基因mRNA相對表達量顯著提高，這表明ZEA暴露可能導致驢支持細胞內糖酵解進程加快，支持細胞內物質與能量代謝發生異常，進而可能促進細胞的炎癥反應的發生或腫瘤的形成。

腫瘤的形成與發展和細胞周期異常密切相關[31-32]。ZEA處理后支持細胞KEGG分析結果顯示其細胞周期通路相關基因的表達顯著異常 (圖4)。這一結果說明ZEA可能通過影響細胞周期通路內相關基因的表達，導致驢支持細胞基因表達模式改變，最終可能增加家畜睪丸癌變的風險。有報道表明[33]，LIN28A基因是睪丸內腫瘤發生的標記基因。另外，GADD45B基因在多種腫瘤中均被檢測到過表達，該基因參與調控細胞生存，DNA損傷修復、細胞周期停滯，并與腫瘤轉移現象密切相關[34]。結果顯示，ZEA處理后，支持細胞LIN28A、GADD45B基因的mRNA表達量均顯著升高，這說明ZEA具有導致支持細胞發生癌變風險的可能。KEGG分析結果得知，ZEA可引起IL17信號通路、T細胞受體信號通路等炎癥相關信號通路上調。此外，KEGG結果顯示ZEA顯著下調細胞代謝及DNA復制相關信號通路 (圖4)，諸如半胱氨酸和蛋氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、DNA復制、同源重組等。這些結果表明ZEA可能引起驢睪丸支持細胞的炎癥反應 (圖5)，并干擾細胞正常代謝和DNA復制，但其機制有待進一步研究。

支持細胞能夠合成并分泌多種激素[35]。磷酸戊糖途徑在支持細胞中較為活躍，該途徑可提供膽固醇、類固醇激素等合成所需的能量因子如NADPH+H+[36]。G6PD是該途徑氧化反應階段的限速酶，能催化葡萄糖-6-磷酸形成6-磷酸葡萄糖酸-δ-內脂，進一步使NADP+還原形成NADPH+H+[37]。另外，關鍵酶DHCR24可進一步催化合成膽固醇[38]。KEGG結果表明，ZEA顯著影響了磷酸戊糖途徑和類固醇生物合成途徑相關基因的表達。由此可知，ZEA可能通過PI3K-Akt信號通路抑制磷酸戊糖途徑，降低NADPH+H+的合成進而影響驢支持細胞類固醇激素的合成，且ZEA處理后支持細胞ESR1基因的蛋白表達顯著升高 (圖6)。因此，ZEA可能通過干擾類固醇或受體合成途徑影響睪丸的發育及家畜的繁殖性能。

總之，本研究首次利用RNA-seq手段分析探究了ZEA暴露改變驢支持細胞基因表達模式的毒性作用，該毒性作用具有呈劑量依賴性的特點。此外，ZEA暴露導致支持細胞凋亡增加，類固醇激素受體表達異常。且ZEA暴露可能通過影響支持細胞中凋亡和類固醇激素受體合成等過程關鍵基因的表達，直接或間接影響了睪丸發育和激素受體合成等生物學過程。30 μmol·L-1ZEA暴露能夠誘導驢支持細胞的炎癥反應，進而可能損害驢睪丸發育和誘導睪丸病變的潛在危害；另外，相同劑量ZEA暴露下，支持細胞存在被致癌的可能性。本研究將為國家或地方制定馬屬動物飼草料中ZEA含量標準提供理論借鑒，并對研究ZEA等霉菌毒素影響家畜睪丸發育提供新的研究思路。