廣西家蠶僵病流行趨勢及其主要病原遺傳規律研究

唐亮，胡文娟，蔣滿貴，黃深惠，董桂清，李標，唐名艷，趙燁蕓，何驥，潘志新

（廣西蠶業技術推廣站/廣西蠶業科學研究院，廣西南寧530007）

0 引言

【研究意義】蠶病是在家蠶飼養環節中制約蠶繭產量、質量及蠶農經濟效益的主要因素之一（祁廣軍，2013）。其中，僵病是養蠶過程中全齡易發的真菌蠶病，且病源多樣，常經風媒傳播或直接接觸蠶體而感染致病，若防控不及時極易暴發流行，給蠶桑產業造成重大經濟損失（廖華珍等，2009；唐亮等，2013）。因此，掌握家蠶僵病的發病規律及病原特性，建立科學的防控策略和措施，對有效降低家蠶僵病危害、保障蠶業穩定發展及促進蠶農增收均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】牟志美等（1999）研究報道，常規年份山東家蠶的僵病危害在5%～8%，與飼養品種、發育時期及野外昆蟲的發生密切相關；朱方容（2008）、廖華珍等（2009）調查發現廣西2008—2009年連續2年春季家蠶僵病暴發流行，造成當地蠶繭產量銳減，其主要病原可能來源于飛機噴施森林防蟲用的白僵菌。引起家蠶僵病的病原除白僵菌屬外，還有擬青霉屬（朱方容等，1997；苘娜娜等，2015）、曲霉屬、萊氏野村菌屬（王長軍，2000）及蠟蚧屬（苘娜娜等，2015）等多種真菌病原，存在持續的感染能力（余金勇等，2007），但不同菌株間對宿主的毒力存在明顯差異（Saito and Brownbridge，2016）。Wang等（2005）利用簡單序列重復（ISSR）分子標記研究39個白僵菌屬分離株的遺傳多樣性，結果表明ISSR分子標記能成功將3個密切相關的物種與球孢白僵菌（）區分開來，并證實球孢白僵菌分離株與其地理來源存在一定關聯，但這些分離株與其昆蟲宿主間無明確的相關性。呂思行等（2012）采用微衛星分子標記對廣東和廣西蠶區的白僵菌居群之間和居群之內的遺傳多態性進行分析，結果發現兩廣白僵菌居群之間的基因分化系數（）為0.0590，多態位點百分率（PPL）為97.73%，Nei's基因多樣性指數（）為0.1896，Shannon信息多樣性指數（）為0.3165，表明兩廣家蠶來源的白僵菌居群間遺傳分化較小。唐亮等（2013）通過研究宿主濕度環境對球孢白僵菌致病力的影響，發現球孢白僵菌在病蠶體中宿存60 d內對家蠶的致死率仍然很高，因此及時清除病蠶尸體并進行尸體病原性滅活，可降低白僵菌的二次感染。陳雪（2014）通過ISSR遺傳多樣性數據及菌株對家蠶的致死數據研究全國各地球孢白僵菌種群關系，結果表明家蠶白僵病的發生與松毛蟲白僵病的自然流行或人工釋放球孢白僵菌殺蟲劑均無直接關系。王婷婷（2019）在柞蠶僵病病原分子鑒定的研究中發現，野外柞蠶僵蠶、僵蛹及室內人工接種僵蠶的內轉錄間隔區（ITS）序列相似性存在明顯差異，與已知基因序列（KM205065.1）的相似性在96.01%～100.00%。王露露等（2022）從山東和廣西僵蠶及生防菌中篩選獲得對家蠶具有高毒力的白僵菌，并優化其發酵條件，為制備僵蠶提供了優質的菌種資源。Wang等（2022）通過對比、、、、及共6個基因序列，以評估中國、泰國15株白僵菌的系統發育位置，結果篩選出3株具有生防潛力的白僵菌株?！颈狙芯壳腥朦c】查明廣西家蠶僵病發生狀況、流行規律，掌握病原特性及其遺傳規律等是有效防控該病的基礎，但目前尚缺乏對廣西家蠶僵病的系統性研究?！緮M解決的關鍵問題】通過分析2008—2021年廣西主要蠶區蠶病調查數據，結合病原菌形態學與分子生物學研究，旨在掌握廣西主要蠶區的僵病流行規律及其病原特性，為精準防控家蠶僵病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 蠶病數據

廣西家蠶僵病發病原始數據由廣西蠶桑病蟲害監測網的常規蠶病監測數據和相關科技項目蠶病調查數據組成；數據匯總年份為2008—2021年，月份為每年3—10月。每批次全齡期蠶病調查數據為三齡起蠶、五齡起蠶、上蔟后第2 d的僵病發生率總和。

1.2 供試病原

家蠶僵病病原采自桂中、桂南、桂西、桂西北、桂東南等廣西主要桑蠶主產區的僵蠶，清潔處理后接種于薩氏培養基上，劃線分離純化獲得單菌落，經顯微形態鑒定和產孢測定后，保存于廣西蠶業技術推廣站蠶桑病蟲害研究室菌種庫。

1.3 供試菌絲及分生孢子制備

將供試菌株接種至薩氏培養基，培養箱（25±1）℃倒置培養10 d左右，待大量產生菌絲和分生孢子后，刮取表層菌絲及分生孢子，經液氮速凍后，分別置于-20和-80℃冰箱保存備用。

1.4 病原菌對家蠶致病力測試

采用濾紙接觸法（唐亮等，2013）添毒兩廣二號的二齡起蠶，置于（25±1）℃、相對濕度在90%以上的環境下飼養，連續觀察7 d內家蠶發病情況。重復3次。

1.5 病原菌DNA提取

參照朱衡等（1994）的方法提取病原菌總DNA，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量；采用核酸測定儀測定DNA濃度后稀釋至20 ng/μL，-20℃保存備用。

1.6 病原菌ITS序列分析

采用真菌通用引物ITS4（5'-TCCTCCGCTTAT TGATATGCITS-3'）/ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCG TAACAAGG-3'）組合進行PCR擴增（陳立杰等，2008），PCR反應體系50.0μL：DNA模板2.0μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.5μL，ITS4/ITS5引物（20μmol/L）各1.5μL，10×ExBuffer（MgPlus）5.0μL，Ex酶（5 U/μL）0.2μL，ddHO補足 至50.0μL。擴增程序：94℃預變性3 min；94℃1 min，55℃1 min，72℃2 min，進行30個循環；72℃延伸5 min。PCR擴增產物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，回收目的條帶，經PCR Purification Kit純化后以擴增引物進行雙向測序，所得測序結果拼接后輸入GenBank，通過BLAST進行比對分析。

1.7 病原菌ISSR多態性分析

從測試樣本中選取4個樣本對20對引物進行測試，篩選出10個擴增條帶清晰、多態性好的引物用于ISSR-PCR反應。反應體系25.0μL：DNA模板約40 ng，10×Bufer 2.5μL，DNA聚合酶1.25 U，引物（10 ng/μL）1.0μL，dNTPs（2.5 mmol/L）0.4μL，MgCl（1.5 mmol/L）2.0μL，ddHO補足至25.0μL。擴增程序：94℃預變性5 min；94℃45 s，55～62℃45 s，72℃1.5 min，進行35個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴增產物以2.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.8 統計分析

基于ITS4/ITS5引物進行PCR擴增，并將雙向測序結果輸入GenBank進行BLAST比對分析。ISSRPCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳的某個相同遷移率位置上有DNA條帶記為1，無DNA條帶則記為0，形成ISSR表型數據矩陣，然后使用NTsys計算遺傳相似系數，并基于遺傳相似系數進行UPGMA聚類分析。同時，使用PopGene32計算供試材料的遺傳多樣性指數（安丹丹等，2021；周春寶等，2021），并以SPSS 25.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結果與分析

2.1 不同年份家蠶僵病的發生規律

2008—2021年廣西主要蠶區的家蠶僵病平均發病情況如圖1所示。廣西家蠶僵病發病率整體上呈波動下降趨勢，連續14年的平均發病率為5.19%。其中，2008年的發病率為10.08%，顯著高于其他年份（＜0.05，下同）；發病率最低的年份是2019年，發病率僅為3.16%。此外，廣西家蠶僵病年均發病率曲線在2012年呈現一個轉折點，2008—2012年整體上呈快速下降趨勢，2012—2021年則現出上下波動，但總體維持在較低水平，年均發病率僅為4.08%。

2.2 不同月份家蠶僵病的發生規律

以月為單元進行分析，結果顯示廣西家蠶僵病以5月的發病率最高（圖2），達13.37%，與其他月份的差異均達顯著水平；次高峰出現在4月和10月，對應的發病率分別為7.91%和6.87%，二者差異不顯著（＞0.05，下同）。廣西家蠶僵病發病高峰和次高峰時段與廣西溫潤多雨氣候存在高度重疊，推測溫濕度對家蠶僵病的發生有較大影響。

2.3 不同蠶區不同地形家蠶僵病的發生規律

據2008—2021年桂中、桂南、桂西、桂西北和桂東南五大蠶區的調查數據顯示，各蠶區平緩丘陵地形、山區地形的家蠶僵病發生情況如圖3所示。由圖3可知，山區地形的家蠶僵病發生率普遍高于平緩丘陵地區。平緩丘陵蠶區的家蠶僵病發病率排序為桂中（13.55%）＞桂西北（12.66%）＞桂南（11.56%）＞桂西（11.05%）＞桂東南（9.53%），可能與桂中、桂西北在春季低溫陰雨天氣偏多，濕度偏高有利于真菌萌發有關。值得注意的是，5月是各蠶區家蠶僵病的發病高峰期，但進入6月中下旬家蠶僵病發生率迅速下降，可能是平緩丘陵地區氣溫上升迅速、濕度快速下降，超出了真菌發育的最適溫濕度而表現出家蠶僵病發病率急劇下降。

山地蠶區的家蠶僵病發病率排序為桂中（18.91%）＞桂西北（17.96%）＞桂西（16.01%）＞桂西（14.90%）＞桂東南（11.61%），可能是桂中、桂西北山區養蠶多位于河谷地區，相對日照較短，下午16：00后的太陽照射盲區及夜間會出現局部相對濕度偏高而有利于真菌萌發和感染傳播。相對于平緩丘陵地區5月家蠶僵病發病高峰過后次月發病率驟降的情況，山地蠶區的家蠶僵病發病率下降趨勢略顯緩慢，尤其是桂中、桂西、桂西北地區6月的家蠶僵病發生率仍維持在7.80%～10.28%，提示山地蠶區的家蠶僵病危害時間更嚴重且更持久。

2.4 病原菌形態學觀察及其對家蠶毒力測試結果

本研究收集了桂中、桂南、桂西、桂西北及桂東南5個蠶桑主產區多年發生的僵蠶、僵蟲，以及部分白僵菌（農藥），以此為基礎分離獲得60株病原單菌落（表1）用于后續測試。分離獲得的單菌落接種至薩氏培養基上，26℃培養14 d，連續觀察其生長情況并統計菌落的產孢情況，綜合評價病原菌的危害。然后挑取菌絲和分生孢子制片，在顯微鏡下觀察分生孢子形狀、分生孢子梗分支情況及產孢方式等真菌分類特征，初步鑒定分離菌株即為白僵菌（圖4）。

篩選廣西各蠶區及不同來源農藥白僵菌株產孢量第一或前兩名的菌株，統計分析其中的10株菌株（表2），產孢量排名前3的菌株是崇左白僵菌株（農藥）、愛山白僵菌株（農藥）和桂南蠶區白僵菌株，對應的平均產孢量分別為3.4×10、2.8×10和2.6×10分生孢子/mm，其中前兩者是森林防蟲用農藥白僵菌，而桂南蠶區白僵菌是從白僵蠶分離獲得，說明農藥源白僵菌在產孢量方面具有明顯優勢。其中，桂南蠶區白僵菌株來源于廣西蠶業技術推廣站品種保育過程的僵蠶，由于廣西蠶業技術推廣站地處南寧市區，養蠶環境獨立、飼養技術規范，與其他蠶區病原基本無交集，故推測該菌株是1株相對獨立的野生白僵菌，但其產孢量在所有測試菌株中最低。

同時測試上述10株白僵菌株對家蠶的致病力，結果（圖5）顯示，這些白僵菌株對兩廣二號二齡幼蟲的致死速率存在一定差異，但7 d累計致死率均達100.00%，致病力最強的為崇左白僵菌株（農藥），其攻毒48 h后即出現家蠶吐水現象，72 h累計致死率達100.00%。72 h累計致死率排名第一梯隊為3種農藥源白僵菌株：崇左白僵菌株（農藥）（cy34）100.00%、南寧白僵菌株（農藥）（cy33）98.89%、愛山白僵菌株（農藥）（cy49）97.78%；其次是蠶區病蠶分離的白僵菌株和松林僵蟲白僵菌株：桂中松林白僵菌株（cy13）94.44%、桂南2白僵菌株（cy28）93.33%、桂中2白僵菌株（cy16）93.33%、桂西北白僵菌株（cy51）92.22%、桂中1白僵菌株（cy24）91.11%、桂東南白僵菌株（cy22）83.33%，即蠶區病蠶白僵菌株致死率在83.33%～93.33%，低于農藥源白僵菌株對家蠶的致死率；最后為獨立的桂南1白僵菌株（cy20）8.89%，明顯低于農藥用白僵菌株。經顯著差異分析發現，除愛山白僵菌株（農藥）與桂中松林白僵菌株、桂南2白僵菌株、桂中1白僵菌株、桂中2白僵菌株及桂西北白僵菌株的差異不顯著外，南寧白僵菌株（農藥）、崇左白僵菌株（農藥）均顯著高于蠶區白僵菌株的致病力，松林白僵菌株顯著高于桂東南蠶區和桂南獨立蠶區的白僵菌株。即10株白僵菌株對家蠶的致病力總體上呈現出農藥源白僵菌株＞松林白僵菌株＞蠶區病蠶白僵菌株的趨勢，同時存在桂南、桂中、桂西北蠶區白僵菌株感染力高于桂東南、桂西蠶區的白僵菌株?？梢?，桂南、桂中、桂西北蠶區受白僵菌農藥影響的可能性較大，即蠶桑主產區應慎用白僵菌農藥。

2.5 病原菌ITS序列分析結果

以最初凍存的病原菌絲和分生孢子為樣本，提取60株病原單菌落總DNA，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格（圖4-A）后，利用ITS4/ITS5引物進行目的片段擴增，PCR擴增電泳結果（圖4-B）顯示60株病原樣本均能擴增獲得預期大小的目的條帶，可用于后續的ITS序列分析。

將PCR擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序，測序結果輸入GenBank進行BLAST比對分析，結果顯示擴增的ITS序列存在高度保守性，有多個序列比對結果完全一致。在60株病原菌中有56條序列匹配到8個已知序列，序列相似性在97.83%～99.83%（表3）。其中，來自桂中蠶區2019年的3個樣本和桂南蠶區2019年的1個樣本，經2次重復提取DNA均未能成功測序，故不計入后續分析。在56株匹配的菌株中，有45株為蠶區采集病原株，且其中39株為球孢白僵菌（）?？梢?，導致蠶區家蠶白僵病的主要病原為球孢白僵菌，占比達86.67%；誘發家蠶僵病的病原還有曲霉屬、擬青霉屬和蟲草菌屬等，表明蠶區家蠶僵病病原復雜多樣。

2.6 白僵菌遺傳多樣性及聚類分析結果

在ITS序列分析的基礎上，選擇45株蠶區白僵菌株樣本、4株農藥源白僵菌株樣本及1株松林白僵菌株樣本共計50株菌株進行多態性分析。首先選用cy03、cy14、cy40、cy60等4個樣本進行ISSR引物篩選，結果從20條引物篩選出10條擴增條帶清晰、條帶數較多、多態性良好，且易于擴增的引物（表4）。利用篩選出的10條ISSR引物對50株菌株樣本的DNA進行ISSR-PCR擴增，擴增產物以2.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并根據ISSR-PCR擴增結果以Quantity One繪制電泳模式圖，結果顯示，10條ISSR引物從50株菌株樣本中擴增出152條清晰條帶（表5），其中多態位點147個，多態百分數為87.5%～100.0%，平均為96.71%。各引物擴增獲得的條帶數在13～19條，平均為15.2條。從單條引物擴增得到的多態位點來看，以引物P8和引物P9擴增得到的多態位點最多，均為19個。10條引物擴增得到的多態位點平均為14.7個，表明這10條引物能很好地區分白僵菌株多樣性。利用PopGene32計算供試材料的遺傳多樣性指數，結果顯示，50株菌株樣本的等位基因數（）為1.8750～2.0000，有效等位基因數（）為1.2726～1.5625，Nei's基因多樣性指數（）為0.1740～0.3257，Shannon信息多樣性指數（）為0.2840～0.4880，均表現出極高的遺傳多樣性，尤其以引物TL-P8的擴增效果最優（圖7）。

根據“0，1”矩陣數據，分別計算50個供試材料兩兩間的遺傳距離并構建遺傳相似矩陣，結果顯示，cy13與cy16的遺傳相似系數（GS）最大，為0.9737，表明二者的遺傳距離非常近；而cy33（白僵屬）與cy25（擬青霉屬）和cy26（擬青霉屬）的GS最小，均為0.4276，表明其遺傳距離較遠。蠶區來源白僵菌株間的GS波動幅度在0.5921～0.9671，說明蠶區病原遺傳多樣性較高，同時中位區間在0.8000～0.8999，占56.41%，預示著超過半數的蠶區病原基因相關度較高，GS大于0.8000的比例高達78.00%，則提示區域內的菌株變異較小或區域間存在頻繁交流。其中，蠶區病原的GS最高值（0.9737）出現在2013年的2株桂中蠶區病原菌株間（cy16與cy19），最小值（0.5921）則出現在2013年育種僵蠶菌株cy20與同年桂西北蠶區的僵蠶病原菌株cy23間，表明相同地域的白僵菌株會表現出更高的親緣關系，而跨區域菌株間的基因相關度較低。

根據50株菌株兩兩間的遺傳距離進行UPGMA聚類分析，結果（圖8）顯示，蠶區病原菌株與農藥源白僵菌株聚類在相鄰位置，提示二者具有較緊密的遺傳關系。如cy28（桂南蠶區，2017年）與cy33［南寧白僵（農藥），2017年］、cy51（桂西北蠶區，2011年）與cy49［愛山白僵（農藥），2011年］、cy22（桂東南蠶區，2013年）與cy12［南寧白僵（農藥），2013年］、cy24（桂中蠶區，2011年）與cy34［崇左白僵（農藥），2011年］間的遺傳距離分別為0.9276、0.9342、0.9605和0.9568，預示著桂南、桂西北、桂東南、桂中等蠶區的病蠶白僵菌株與農藥源白僵菌株存在非常近的親緣關系，進一步證實廣西各蠶區白僵病的發生流行與施用白僵菌農藥存在密切關系。

3 討論

2008—2021年廣西主要蠶區的家蠶僵病平均發病率為5.19%，與牟志美等（1999）研究報道山東家蠶僵病常規年份的年均發病率在5%～8%相仿。廣西屬于高溫多濕的亞熱帶季風氣候，山東屬于溫帶季風氣候，兩地溫濕度差異明顯，但兩地的家蠶僵病發病率相近可能與廣西氣溫偏高，適宜白僵菌繁殖和浸染的時間范圍較窄有關。在2008和2009年廣西蠶區周邊環境引入大量森林防控白僵菌（朱方容，2008；廖華珍等，2009）的情形下仍取得良好防控效果，預示著在沒有大量外源病原菌影響的情況下僵病發病率可能會更低。自2009年廣西蠶區大面積引入外源性白僵菌后，2010和2011年廣西蠶區周邊未見大量施用白僵菌的報道，但2010年的家蠶僵病發病率顯著高于之后的多年平均發病率（4.08%），廣西家蠶僵病年均發病率曲線在2012年呈現一個轉折點。說明人為引入大量白僵菌株后，對當地家蠶僵病的影響可能會維持2年左右，第3年則呈顯著下降趨勢，與余金勇等（2007）在研究白僵菌防松毛蟲持續致病力得出的結論相似。本研究通過對廣西主要蠶區及周邊地區收集的白僵菌株進行ITS序列分析，進一步明確廣西家蠶僵蠶的病原種類，包括白僵菌屬、曲霉屬、擬青霉屬和蟲草菌屬，表明廣西家蠶僵病病原呈多樣性。其中，擬青霉屬病原與朱方容等（1997）的研究結果相似。廣西家蠶僵病的主要病原仍是球孢白僵菌（占86.67%），說明廣西蠶區家蠶僵病的病原高度保守。

本研究對廣西五大蠶桑主產區家蠶僵病病原、4株生物防控白僵菌（農藥）、1株松林白僵分離株和1株研究機構育種白僵菌進行毒力測試，結果顯示生物防控白僵菌株＞松林白僵菌株＞主要蠶區白僵菌株＞研究機構育種白僵菌。生物防控白僵菌株（農藥）對家蠶的致病力顯著高于蠶區白僵菌株，提示其具備區域性危害的基礎條件，與石美寧和朱方容（2010）、劉吉平等（2011）的研究結果相似。本研究同時利用ISSR-PCR分析廣西主要蠶區白僵菌病原間的基因相關度，結果顯示同一地域相同年份的病原菌株具有非常近的遺傳距離，如cy16與cy19的GS最大（0.9737）；相同區域經過多年后遺傳變異較大，如cy28與cy58的GS最?。?.7895）。廣西桑蠶主產區家蠶僵病病原的GS中位數區間在0.8000～0.9000，約有78.00%的GS大于0.8000，暗示廣西白僵菌居群的遺傳多樣性水平相對較低，與呂思行等（2012）的研究結果相似。此外，通過對比生物防治用白僵菌株（農藥）與廣西部分蠶區白僵菌株，發現其遺傳距離非常近，同時蠶區周邊松林分離白僵株與前兩者存在極高的遺傳關聯度，預示著松林害蟲可能是白僵菌（農藥）感染家蠶的中間宿主（陳雪，2014），即廣西蠶區白僵病的流行與施用白僵菌農藥存在密切聯系。

4 結論

廣西家蠶僵病危害高峰期為5月，球孢白僵菌仍是最主要的病原菌，且ITS序列高度保守。不同來源白僵菌對家蠶致病力的排序為農藥源白僵菌株＞松林白僵菌株＞蠶區僵蠶菌株，但三者相互間存在非常高的基因關聯性，提示廣西家蠶僵病的病原遺傳背景復雜，且蠶桑主產區應慎用白僵菌農藥。