哺乳期補飼開食料對牦牛犢牛生長性能和皺胃組織形態與功能發育的影響

周亞楠 馮宇哲 楊得玉 王 音 李積蘭 劉書杰 崔占鴻

(青海大學農牧學院，畜牧獸醫科學院，青海省牦牛工程技術研究中心，青海省高原放牧家畜動物營養與飼料科學重點實驗室，西寧810016)

牦牛是青藏高原地區的優勢反芻家畜品種，是該地區重要的生產和生活資料來源之一[1]。犢牛期是幼齡牦牛生長發育的關鍵節點，對成年后牦牛的生產表現至關重要[2]。但是牦牛放牧條件下環境惡劣、牧草質量低下，母牛的能量攝入不足，哺乳量明顯降低，加之犢牛對牧草消化能力不足，犢牛營養攝入缺乏問題十分突出，不利于其早期生長發育，從而導致犢牛發育緩慢[3]。犢牛出生后，在哺乳條件下各營養物質水平都能達到犢牛所需時，到犢牛斷奶，犢牛各組織器官能夠快速發育完善[4-5]；而營養缺乏時，會造成牦牛犢牛發育不良，生長緩慢，嚴重時會形成僵牛，延長牦牛的生長周期[6]。因此，犢牛出生后初乳和過渡期開食料的采食量是犢牛培育計劃中的2個重要環節[2]。研究表明，出生前幾周僅飼喂牛奶或代乳粉的犢牛會阻礙瘤胃的發育，不利于犢牛斷奶和利用谷物及粗飼料[7]。大量研究表明，適時采食一定量精飼料相較于牛奶和干草更加能促進犢牛的生長發育[8-10]。目前，本團隊王音等[11]關于哺乳期補飼開食料對牦牛犢牛瘤胃發育已做研究，而關于補飼開食料對哺乳期牦牛犢牛皺胃形態與功能發育的研究鮮見報道。因此，本研究在前期研究的基礎上，以牦牛犢牛為對象，研究補飼開食料對牦牛犢牛生長性能和皺胃形態與功能的影響，以及對皺胃組織的葡萄糖轉運蛋白1(GLUT1)、脂肪酸轉運蛋白4(FATP4)、小肽轉運蛋白1(PepT1)基因的調控作用，從分子水平探究哺乳期補飼開食料對牦牛犢牛營養物質吸收的影響，預期結果能為哺乳期牦牛犢牛營養調控技術研究提供理論依據和重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地方

試驗時間為2020年7月至2020年11月。牦牛犢牛飼養試驗在青海省海北州海晏縣高原現代生態畜牧業科技試驗示范園管委會完成。樣品測定在青海省牦牛工程技術研究中心實驗室完成。

1.2 試驗設計與飼糧

選取20頭健康、體重相近的1月齡公牦牛犢牛，隨機分為2組，每組10頭。對照組飼喂代乳粉+苜蓿干草，試驗組飼喂代乳粉+苜蓿干草+開食料。對照組和試驗組代乳粉飼喂量相同，總的干物質采食量保持一致，代乳粉、開食料均來自北京標準動物營養研究中心，苜蓿干草購自甘肅省張掖市。代乳粉和開食料組成參見本課題組已發表文獻[12]，營養水平見表1。

1.3 飼養管理

牦牛犢牛(公)單欄飼養，代乳粉早、中、晚飼喂3次，飼喂時間分別為08:30、12:30、16:30，沸水冷卻至42 ℃，代乳粉和溫水按1∶5比例配制，灌入奶瓶，牦牛犢牛主動吮吸；將試驗組開食料和苜蓿干草干物質比例調整為1∶1，開食料和苜蓿干草分開進行飼喂，且每天對剩料進行稱量、記錄試驗，飼養管理具體方法參見本課題組已發表文獻[12]。預試期14 d，正試期120 d。

表1 試驗飼糧營養水平(干物質基礎)

1.4 樣品采集

飼養試驗結束時，牦牛犢牛前1天16:00之后斷食斷水，于清晨屠宰，取皺胃內容物于5 mL凍存管中，立即置入液氮罐中保存，用于皺胃消化酶活性以及功能發育基因表達的測定。在皺胃胃體部取組織塊約2 cm×2 cm，固定于4%的多聚甲醛溶液，連續換液，直至多聚甲醛溶液澄清透明，用于后續組織形態學觀察。

1.5 測定指標與方法

1.5.1 生長性能

分別在試驗初期和試驗末期稱重，測量體高、體斜長、管圍、胸圍，具體測量方法參考郭文杰[12]，計算平均日增重(ADG)，公式如下：

平均日增重=(終末體重-初始體重)/試驗天數。

1.5.2 皺胃組織形態發育

將固定于4%多聚甲醛中的樣品取出，采用蘇木精-伊紅(HE)染色法制備組織切片[11]，制備組織切片的順序為：石蠟切片脫蠟至水，蘇木精和伊紅分別染細胞核、細胞質，不同濃度的酒精脫水封片，利用電子顯微鏡對皺胃進行組織形態學觀察。

1.5.3 消化酶活性

測定皺胃內容物中主要消化酶(纖維素酶、淀粉酶、胃蛋白酶、葡萄糖苷酶、脂肪酶)活性。測定之前稱取0.5 g皺胃內容物，質量體積比為1∶9(g/mL)，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH 7.4)，將其研磨并勻漿充分，低溫離心10 min，仔細收集上清液。分裝多份，其中1份單獨放置，用于試劑盒檢測，其余放置低溫冷凍備用。消化酶活性使用酶標儀測定，試劑盒購于江蘇酶標科技有限公司，試驗流程嚴格按照說明書進行操作。

1.5.4 營養轉運載體基因表達

采用實時熒光定量PCR測定皺胃組織中的GLUT1、PepT1、FATP4基因相對表達量。按照RNA提取試劑盒(Servicebio)說明書進行操作，將皺胃組織中研磨充分，用于提取總RNA，使用Nanodrop 2000儀器檢測RNA濃度及純度用于后續試驗。其中，判斷皺胃組織的RNA是否降解采用的是1%瓊脂糖凝膠電泳法。采用TaKaRa反轉錄試劑盒進行cDNA合成時應保證試驗于冰上進行，使其處于低溫環境?？偡磻w系為20 μL，其中5×Reaction Buffer為4 μL、Oligo (dT)18Primer (100 μmol/L)為0.5 μL、Random Hexamer primer (100 μmol/L)為0.5 μL、Servicebio?RT Enzyme Mix為1 μL、Total RNA為1 μL，最后RNase free water添加至20 μL。所用儀器為熒光定量PCR儀(Stepone plus，ABI)。采用三步法測定，第1步：預變性，95 ℃，10 min；第2步：首先95 ℃，15 s條件下變性，其次60 ℃，30 s 條件下退火/延伸；第3步：生成熔解曲線，60 ℃→95 ℃，每升溫0.3 ℃，采集1次熒光信號。引物設計根據NCBI中查找到的GLUT1、PepT1、FATP4基因序列，由武漢賽維爾生物科技有限公司合成。實時熒光定量PCR引物序列見表2，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參基因，采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達量。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

1.6 數據統計分析

試驗數據先經Excel 2016初步處理后，采用SPSS 20.0軟件的one-way ANOVA程序進行單因素方差分析，Duncan氏法進行多重比較，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 哺乳期補飼開食料對牦牛犢牛生長性能的影響

由表3可知，對照組和試驗組牦牛犢牛初始體重、體斜長、胸圍均差異不顯著(P>0.05)；試驗組干物質采食量、終末體重、平均日增重、體高均極顯著高于對照組(P<0.01)。

2.2 哺乳期補飼開食料對牦牛犢牛皺胃組織形態發育的影響

圖1為補飼開食料哺乳期牦牛犢牛的皺胃冷凍切片。由表4可知，對照組和試驗組黏膜上皮、黏膜肌層、漿膜層厚度均差異不顯著(P>0.05)；試驗組黏膜下層、肌層厚度顯著高于對照組(P<0.05)。

2.3 哺乳期補飼開食料對牦牛犢牛皺胃主要消化酶活性的影響

由表5可知，試驗組牦牛犢牛皺胃葡萄糖苷酶、纖維素酶活性極顯著高于對照組(P<0.01)；試驗組皺胃內淀粉酶活性顯著高于對照組(P<0.05)；皺胃胃蛋白酶、脂肪酶活性2組間差異均不顯著(P>0.05)，但試驗組略高于對照組。

表3 哺乳期補飼開食料對牦牛犢牛干物質采食量、體重、體尺的影響

表4 哺乳期補飼開食料對牦牛犢牛皺胃組織形態發育的影響

a:對照組 control group；b：試驗組 test group；c：試驗組 test group；A：黏膜上皮 mucosal epithelium；B：黏膜肌層 mucosal muscle layer；C：黏膜下層 submucous layer；D：肌層 muscular layer；E：漿膜層 plasma membrane layer。

2.4 哺乳期補飼開食料對牦牛犢牛皺胃組織營養轉運載體基因表達的影響

由表6可知，試驗組皺胃的GLUT1、PepT1基因相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)；試驗組皺胃的FATP4基因相對表達量極顯著高于對照組(P<0.01)。

3 討 論

3.1 哺乳期補飼開食料對牦牛犢牛生長性能的影響

哺乳期牦牛犢牛的復胃發育和功能還未健全，對粗纖維飼糧的消化功能極有限，在哺乳期補飼開食料可以促進牦牛犢?？焖侔l育。早期精料補飼很多優勢，例如瘤胃發育和飼料利用率的提高[13-14]，促進斷奶時犢牛體重和胴體重增加，肌肉更加發達[15]；王琦[16]研究發現，給哺乳期羔羊補飼精料，羔羊的增重效果較好。本研究中，試驗組平均日增重極顯著高于對照組，說明早期補飼開食料能有效改善哺乳期牦牛犢牛營養采食狀況，提高犢牛生長性能和發育質量，這與Suárez等[17]研究結果一致。開食料為高精料，僅飼喂開食料將導致犢牛瘤胃酸中毒，國外研究者認為，在開食料基礎上增加粗飼料供給才能提高犢牛的生長、體增重和健康狀況[17-19]，故合理的營養供給能加速斷奶前犢牛的瘤胃發育，降低飼糧消耗，提高生長速率、斷奶重和健康水平[20-26]。本研究以哺乳期牦牛犢牛為對象，在飼喂代乳粉和苜蓿草的基礎上繼續補飼優質的飼料(開食料)，開食料主要為牦牛犢牛提供精料，形狀為顆粒飼料，即通過固體飼料早期適量飼喂促進了牦牛犢牛生長性能發揮，實現了犢牛飼糧的營養合理組合搭配利用，對挖掘哺乳期牦牛犢牛的生長性能產生了積極調控作用。

表5 哺乳期補飼開食料對牦牛犢牛皺胃主要消化酶活性的影響

表6 哺乳期補飼開食料對牦牛犢牛皺胃組織營養轉運載體基因表達的影響

3.2 哺乳期補飼開食料對牦牛犢牛皺胃組織形態發育的影響

皺胃是典型的管狀器官[27]，是反芻動物的腺胃，又被稱為真胃[28]。反芻動物皺胃運動與單胃相似但也有所不同，雖受迷走神經支配，但將其切斷后，仍可發生推進性運動，在條件反射和非條件反射的作用下引起胃部運動，剛出生犢牛的消化運動功能主要依靠皺胃[28]，而液體飼料可直接由食管溝到達皺胃，對于哺乳期反芻動物而言，前期由犢牛攝入的營養物質其消化吸收主要依賴于皺胃組織[29]。在本試驗中，哺乳期牦牛犢牛在補飼開食料后，黏膜下層、肌層發育明顯優于未補飼開食料牦牛犢牛，且黏膜上皮、黏膜肌層、漿膜層發育略好。飼喂足量的精料，皺胃肌層較為發達，皺胃黏膜肌層發育則不明顯；王斯琴塔娜[30]研究結果表明，飼喂高質量飼糧皺胃肌層的發育要遠遠好于低質量飼糧。同時，趙瑋[31]研究也發現，山羊飼喂含有高質量易消化的飼糧皺胃發育更好，這一結果與本試驗結果一致。由此可見，哺乳期補飼開食料有利于牦牛犢牛皺胃發育，促進皺胃的蠕動，從而影響牦牛犢牛對營養物質的消化吸收，促進其生長發育。

3.3 哺乳期補飼開食料對牦牛犢牛皺胃主要消化酶活性的影響

皺胃分為賁門腺部、胃底腺部、幽門腺部3個部分，胃底腺胃液pH相較于瘤胃酸性更強，為2.1～4.0；幽門腺呈堿性或者中性[30]，胃腺由4部分細胞構成，與前胃明顯不同，造成了它的特殊性，主細胞、壁細胞和頸黏液細胞以及少量的內分泌細胞都有其各自的功能[32]。通過一系列胃部運動，皺胃分泌各種消化酶，其中包括鹽酸、淀粉酶、葡萄糖苷酶、胃蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶，而未經過前胃消化的物質，可被葡萄糖苷酶、纖維素酶消化；鹽酸破壞來自瘤胃的微生物，胃脂肪酶可以分解脂類物質[33]；胃蛋白酶可以通過分解微生物蛋白從而產生氨基酸，直接供犢牛吸收。飼糧中加入精料可以提高胃蛋白酶和脂肪酶的活性[34]；Taniguchi等[35]研究表明，增加開食料攝入量，提高皺胃和小腸對淀粉的消化量，從而進一步促進淀粉酶分泌；Ash[36]發現前胃未消化的物質可刺激皺胃分泌消化酶，對于哺乳期牦牛犢牛，前胃發育不完全，主要由皺胃與小腸分泌的消化酶來消化營養物質[37]。本試驗補飼開食料后哺乳期牦牛犢牛皺胃葡萄糖苷酶、纖維素酶活性顯著升高，表明補飼開食料有助于提高牦牛犢牛皺胃消化酶的分泌和營養物質的消化吸收能力。補飼開食料后牦牛犢牛皺胃內淀粉酶活性提高，與Taniguchi等[35]研究結果相似；試驗組皺胃內胃蛋白酶、脂肪酶活性略高于對照組，也與前人研究結果一致。

3.4 哺乳期補飼開食料對牦牛犢牛皺胃營養轉運載體基因表達的影響

皺胃可消化的營養物質包含葡萄糖、脂質、蛋白質等，GLUT1是反芻動物促進葡萄糖吸收的主要轉運蛋白，可以促進對葡萄糖的攝入[38]；FATP4是機體調控吸收脂肪酸的主要因子，能夠促進機體對脂肪的吸收；PepT1參與小肽的跨膜運轉，可直接促進動物對蛋白質的消化吸收[39]。本試驗發現，在補飼開食料的情況下，哺乳期牦牛犢牛皺胃GLUT1、PepT1基因相對表達量顯著增加，且皺胃FATP4基因相對表達量極顯著升高，這與潘巧[40]、占今舜等[41]研究結果基本一致，說明補飼精料更有利于牦牛犢牛對葡萄糖、脂肪、蛋白質的消化吸收，但國內外對于牦牛犢牛皺胃營養轉運載體的研究極少，其更深的影響機理亟需進一步探究。

4 結 論

綜上所述，哺乳期補飼開食料有利于牦牛犢牛的生長性能發揮，正向調控其皺胃形態與功能發育，進而提高對營養物質的消化利用率。