土壤養分及其化學計量特征對微生物碳利用效率的影響機制

朱 婧, 劉 鼎, 王 珊, 黃祚水, 梁建宏

(1.珍稀瀕危動植物生態與環境保護教育部重點實驗室(廣西師范大學)， 廣西 桂林 541006； 2.廣西師范大學 環境與資源學院， 廣西 桂林 541006； 3.中國地質科學院 巖溶地質研究所, 廣西 桂林 541004； 4.自然資源部/廣西巖溶動力學重點實驗室， 廣西 桂林 541004； 5.自然資源部 巖溶生態系統與石漠化治理重點實驗室， 廣西 桂林 541004)

土壤功能涵蓋基于土壤的環境、社會和經濟服務的各個方面，主要包括：生產生物質、涵養過濾飲用水、儲存和循環養分、作為生物的棲息地保持物種多樣性以及作為全球最重要的碳庫之一調節全球碳(C)循環[1]。土壤碳存儲和固持不僅是土壤質量和肥力的重要特征之一，也對控制大氣二氧化碳(CO2)濃度、延緩氣候變化具有決定性作用[2]。由于土壤碳庫可以提供多種生態系統功能和服務，尤其是在緩解氣候變化和促進糧食安全方面的重大作用，維持和增加全球土壤碳庫不僅是科學界關注的重點，國際和國家層面對此也極為重視。例如，2015 年的巴黎聯合國氣候變化大會COP21發起的“千分之四”國際倡議(4‰ initiative: soils for food security and climate；全球土壤增碳計劃)[3]，表明土壤在糧食安全和氣候變化方面可以發揮關鍵作用。因此，在氣候變化背景下，掌握土壤有機質存儲和分解的控制機理及其對人為干擾和全球變化的響應非常重要。

土壤微生物在陸地生態系統碳循環中至關重要。異養土壤微生物(細菌、真菌和古生菌)通過轉化植物輸入的、外源添加的及土壤固存的有機質來獲取土壤微生物維持和生長的養分和能量[4-5]，決定了生態系統凈初級生產力(NPP)轉化為碳儲量的效率。研究表明，土壤微生物殘體和分泌物可能貢獻了高達80%的土壤穩定有機碳[6-7]。異養微生物一方面分解有機碳使其礦化，另一方面同化有機碳合成自身生物量，微生物殘體提升了土壤有機碳穩定性[8]，加上對土壤有機碳的體外修飾作用，共同形成了土壤微生物源碳——“微生物碳泵”機制”[9-10]，這些過程的平衡決定土壤碳儲量。而多種環境條件對微生物群落的結構和生理活性產生影響，使上述平衡發生改變，進而影響碳儲量[11]。碳利用效率(carbon use efficiency, CUE)在20世紀初作為評估純菌同化底物效率的生理指標被提出[12]，而后其概念擴展應用至生態學中。微生物CUE指微生物用于生長同化的有機碳底物量與分解異化過程(如呼吸作用)對底物碳利用量的比率，反映了微生物對有機碳的同化合成(生長)和分解代謝(呼吸)的平衡和耦合[13-14]。CUE的內核本質反映了在不同時間和空間尺度上影響碳代謝的眾多過程(包括細胞個體及物種層次的生理過程以及群落或生態系統層次上的動力學特征)的集合[15]。因此，理解CUE所反映的微生物生理過程及其對環境條件的響應程度，是量化生態系統土壤碳固持能力，評估其長期碳儲量的潛力，預測全球變化、人為干擾及各種管理措施對生態系統碳固持影響的關鍵所在，是當下生態學研究的熱點之一。

生態系統類型、氣候(如溫度和濕度)、土壤理化特征(如土壤質地和團聚體、土壤礦物和pH等)、土壤有機質底物的質量和養分含量等生物因子和非生物因子都對微生物CUE產生影響[16-17]。自養生物(植物和自養微生物)在大多數生態系統中通常面臨養分限制，而土壤異養微生物通過分解有機碳獲取營養和能量，因此既可能受到養分限制，亦可能在養分相對充分的情況下表現為碳限制[18]。經典養分限制理論(Liebig’s law of the minimum)認為生物量的產生由可利用性最低的單營養限制[19]。但越來越多的研究表明，在生態系統中可能發生多種元素共同限制，這主要是因為群落中不同微生物物種對于養分的需求有差異[20]；同時，一種養分的缺乏可能會降低微生物對另一種養分的獲取效率[21]。土壤有機碳含量、氮(N)、磷(P)等營養元素的含量以及它們之間的化學計量比(C∶N∶P)是微生物在同化生長和呼吸獲取能量過程中分配有機碳的重要影響因子。影響C∶N∶P的機制較為復雜，不僅包括養分供給影響微生物生理活性的直接作用，也包括通過改變微生物群落結構和有機質激發效應從而影響CUE的間接作用，因此，這是當前CUE研究中所面臨的重要挑戰之一。本文對現有文獻進行整理、總結和分析，從土壤有機質碳源、養分及化學計量比特征、微生物群落對養分的響應以及其他生理功能機制的角度，概述微生物CUE的影響機制(見圖1，菱形框突出本文所重點綜述的2個關鍵控制機理及它們在微生物群落結構和生理及土壤有機質轉化中的調節機制)，進而分析養分供給與其他生態因子可能的交互作用，最后提出將來CUE重要的研究方向，以期為預測和評估人為活動和氣候變化對CUE的影響提供理論依據。

圖1 養分和化學計量特征對微生物利用效率和有機物歸趨的影響框架Fig.1 Proposed framework for the impacts of nutrients and stoichiometry on microbial carbon use efficiency and the fate of organic matter

1 土壤養分對CUE的影響機制

1.1 有機質底物質量

盡管土壤是陸地生態系統中最大的碳庫，但對于異養微生物而言，易分解的活性有機碳通常是限制其生長的最重要因素[18]。微生物一方面同化有機質用于自身生長，另一方面通過呼吸代謝消耗有機質獲取能量。能量分配給前者越多，則CUE越高[22]。依據熱力學理論計算，CUE的極限值為0.88，意味著微生物至少需要消耗12%的碳,通過呼吸作用產生能量維持自身生理活動[23]。有機質底物質量對CUE有顯著影響。不同植被覆蓋類型導致輸入土壤的凋落物質量有所差異，因而可被微生物同化利用的效率不同[24]。土壤微生物代謝供能和同化生長這兩方面都將影響到微生物對有機碳利用方式的分配能力，即CUE的高低[25]。在代謝有機質底物提供能量方面， 底物碳還原度(Rs)是衡量每摩爾碳化學能的指標，通常被用于評價有機質提供能量的能力[23]。研究表明：當底物Rs小于微生物生物質碳還原度(RB)時，微生物需要消耗額外的碳合成生物量，從而CUE較低；而當Rs>RB時，微生物的生長則有充足的能量，其生長速率主要受到底物中總可用有機碳含量的限制[25]。

在同化有機碳生長方面，不同的底物需要不同的代謝途徑才能被完全同化，而有機質底物類型會影響其轉化為新生物質的效率[26]，難以降解的有機質需要大量酶的參與。微生物產生和分泌胞外酶的過程伴隨能量的消耗，使得同化每單位C的呼吸速率增大[23, 26]，降低CUE值。例如，糖苷水解酶通常作用于植物細胞壁的分解，在有機質限制的土壤中，表達該酶的基因豐度和多樣性都更高[27]。Takriti等[28]通過采用13C示蹤的糖類、氨基糖、氨基酸和有機酸在土壤中的轉化過程，并用纖維二糖水解酶(CBH)和酚氧化酶(POX)的比值作為底物質量的指標，發現微生物對底物利用的CUE與CBH∶POX呈顯著相關關系，表明土壤有機質底物種類是CUE重要的控制因子。但在包含114種來自不同地區的土壤和16種由14C標記的有機質底物的研究中，Jones等[29]僅發現葡萄糖等有機質底物在不同土壤中均有較一致的高CUE水平，而其他有機質底物在不同土壤中的CUE變化很大。綜上，有機質底物的質量只能部分解釋土壤CUE的變化。

1.2 養分可利用性

氮和磷對于有機體的結構和功能必不可少：氮的增加促進微生物蛋白質和核酸等關鍵細胞生長，包括調控生長代謝過程各種酶的合成[30]；磷的增加促進富含磷的核糖體合成，而后者是合成細胞生長相關的各種酶的場所[31]，三磷酸腺苷(ATP)的增加亦提高了微生物活性[32]。由于氮和磷在大多數生態系統中都有限，其可利用性的增加促進微生物細胞的生長，而氮磷養分的添加對異養呼吸的作用可能有相反的影響。Zhang等[33]在全球尺度范圍內不同生態系統的Meta分析中發現，氮的添加總體呈現降低異養呼吸的趨勢。另一方面，磷添加則能增加異養呼吸[34-36]。這表明氮和磷對微生物有機碳周轉的影響機制不同。在氮限制下，微生物通過分解有機質、固定無機氮，并通過合成促進有機氮降解的酶從而更有效地獲取氮[37]，這些生理過程均需要消耗能量，使呼吸速率增大[17]。同時，氮的添加可能導致土壤pH降低和細胞滲透壓的改變，這是呼吸速率下降的主要原因之一[38]。盡管分解有機質也是微生物對磷獲取的重要途徑之一，微生物亦可通過分泌有機酸活化土壤無機磷[39]，因此磷的獲取與有機質分解的耦合度相對更小[40-41]。在磷限制條件下，添加磷主要體現為微生物活性的增強所導致呼吸作用的增加。這可能是因為添加的磷與土壤有機質競爭吸附位點，從而降低了吸附對有機質的保護，增加了其微生物可利用性，進而提高了呼吸速率[36]。由于養分的可利用性對于微生物生長和呼吸作用的機理不一致，且不同土壤的養分有效性不同，通過養分添加實驗對微生物CUE的影響研究常常很難獲得一致的規律[37, 42]。需要特別注意的是，微生物生物量、生理活性、酶活性對養分的添加存在一定閾值，超過該閾值，作用的方向可能會發生改變[43]。如Li等[44]發現低氮添加(25 kg/(ha·a))能提高溫帶森林有機層土壤中微生物的CUE；當氮添加提高至75 kg/(ha·a)，反而使得CUE降低；與之不同的是，礦質層土壤微生物CUE在低氮添加時不受影響，而高氮添加時則被顯著提高。這些研究結果表明，土壤養分可利用性影響CUE，但其影響機理多樣，還需要進一步深入研究。

1.3 C∶N∶P化學計量特征

有機碳與養分的化學計量特征作為表征底物和養分限制性的指標[45]，是微生物CUE的重要影響因素[46-47]。在化學計量學理論中，當必需元素相對于碳的可用性低于其最佳生長所需的臨界比率(TER)時，生長就會受到養分的限制[48]。通常而言，有機質底物中C∶N∶P較高(如葉片凋落物中該比率為3 055∶43∶1，而木質殘體的比率則高達14 103∶40∶1)[49]，而土壤和微生物中大致為186∶13∶1和60∶7∶1[50]，或者287∶17∶1和42∶6∶1[51]。根據消費者驅動的養分循環理論，限制性養分更可能高效地用于微生物生長，而非限制性養分則可能被微生物釋放到環境中[45]。因此，不同化學計量比之間的不平衡意味著微生物在利用有機質底物的過程中，將過量的碳轉化為CO2釋放的能量用以獲取氮磷養分[52]；而在大多數生態系統中磷相比氮更為缺乏，微生物需要消耗更多的能量獲取和持留磷[53-54]。

微生物生長量必須根據所能獲取到的養分量進行調整。為了在氮和磷可用性較低的情況下達到內部穩態平衡，土壤微生物可以適當減少降解富含碳的碳水化合物水解酶(如葡萄糖苷酶)的合成，并降低對碳水化合物的碳同化速率[55]。盡管在大多數研究中發現較高的C∶(N/P) 比值導致微生物CUE降低[17, 37, 56]，但由于其他因素影響，不同研究的結果并不一致[28, 57-59]。研究結果表明，微生物在不同環境條件(如溫度、水分和pH)和養分限制狀況下采取不同的應對策略，將能量用于細胞生長、養分獲取或者脅迫應對上，從而造成CUE的差異[60]。在研究C∶N∶P化學計量特征對CUE的影響時，也需要特別注意：微生物對于自然(或長期)化學計量比與人為(或短期)養分添加改變化學計量比的響應機制可能不同。短期CUE的改變可能在長期環境中通過微生物群落結構變化及相應的生理適應機制而減弱[61]。因此，在微生物CUE的研究中，需要特別注意其他環境條件及作用時間對于養分限制的協同機制。

通過胞外酶活性(EEA)的化學計量比判斷微生物有機質或養分限制是當前的研究熱點之一[20]。由于微生物的獲取主要以分泌分解酶的途徑進行，酶活性的化學計量比在物質循環過程中能起到調節元素循環和速率的作用。最常被用做酶化學計量比指標的是如下4種酶：β-1,4-葡糖苷酶(BG)、β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)和酸性/堿性磷酸酶(AP)[62]。當前很多研究將BG∶(NAG+LAP)∶AP的比值與在全球尺度上平均活性比1∶1∶1進行比較[63]，并在此基礎上運用數值模型[64]從微生物養分獲取策略的角度判斷其養分限制特征，以研究其對微生物CUE的影響[65]。例如Zhai等[66]在不同鹽度的潮汐帶土壤中研究發現，磷限制而非碳限制對CUE有抑制作用。Cui等[22]通過建立一系列模型，發現綜合元素和酶活性化學計量比能夠更好地揭示微生物代謝的限制特征，并發現微生物的碳限制越高，其CUE越低，證實了化學計量特征的確對微生物資源分配有顯著的影響。Sinsabaugh等[46]通過比較土壤元素、微生物生物量、胞外酶活性及胞外酶活性與土壤元素的化學計量比值與微生物CUE之間的關系，發現胞外酶活性C∶N是預測微生物CUE的最佳指標；而胞外酶活性C∶P和微生物生物量C∶P亦與微生物CUE有非常顯著的對數函數關系。需要注意的是，通過在土壤懸濁液中添加底物測定酶活性的方法所得到的結果是酶活性潛勢，并不一定反映在土壤中實際發生的情況；且由于土壤胞外酶的穩定時間較長，其酶活性對短期養分變化響應不明顯[67]。同時，Rosinger等[68]發現，外源碳添加刺激了真菌和細菌的生長，但BG∶NAG的比率并未發生變化，因此沒有反映出碳的添加對碳限制的緩解作用。Mori[69]通過模型模擬發現，只有當纖維素(而非幾丁質、肽聚糖和蛋白質)是最主要的碳源時，BG∶NAG才能反映碳、氮限制的相對變化。這表明，微生物在面對養分限制時的調控機制較為復雜，若干胞外酶的活性變化可能只能反映部分機理。因此在微生物有機質或養分限制的判別方法上，還需要進一步研究探索。

1.4 養分限制所引起的微生物群落結構改變

作為應對養分限制的另一個機制，改變微生物群落結構，比如其物種構成及多樣性[70]和細菌與真菌比率[71]通常發生相應的變化，因為不同微生物在對養分的需求和獲取營養物質的能力上相異，造成它們生態位的區別。土壤細菌和真菌是主要的異養微生物，它們被認為在碳和養分循環及固持能力上有顯著差異[72]。通過經典微生物培養實驗，人們發現不同微生物內生稟賦的CUE有非常大的差異性[15]：K-策略的微生物生長較慢，但是資源利用效率較高，通常有較高CUE，傾向于生活在養分缺乏的環境中，很多研究認為真菌屬于此類微生物；相反，r-策略的微生物代謝速率更強，對養分要求更高，CUE較低，例如細菌[57, 61]。當環境養分可利用性發生改變時，微生物群落結構發生改變，物種尺度上不同的CUE反映在群落尺度上，可能表現為CUE的增大或者減小[73]。

微生物之間的競爭和協作等種間關系可能比多樣性本身對土壤群落功能有更重要的決定作用，并由此對CUE產生影響[74-75]。同質環境中的直接競爭可能會導致CUE降低，而土壤異質性增加則有利于微生物之間的協作，提高有機質和養分的利用效率，從而促進更高的CUE[73]，同時更有利于K-策略的微生物[76]。與純菌培養實驗結果不同，由于不同環境下種間關系的復雜性，在土壤中真菌和細菌與碳源的利用優勢度及CUE之間可能呈現不同的關系?；趯?54個氮添加實驗的Meta分析，Zhou等[77]發現氮的添加降低了真菌與細菌(F:B)的比率，但是提高了革蘭氏陽性菌與陰性菌(G+∶G-)的比率；同時，一定程度氮的添加(< 100 kg/(ha·a))對微生物的生長有正效應。Guo等[78]研究有機質添加對稻田土壤細菌和真菌群落結構及微生物CUE的影響時發現，當土壤細菌而非真菌的群落結構發生變化時，土壤微生物CUE亦有顯著性變化，表明細菌在該條件下對微生物CUE起主導作用。還有多項研究結果表明：真菌與細菌(F∶B)值與CUE呈現負相關關系，即在真菌生物量更高時，CUE較低。如Silva-Sánchez等[58]在土柱實驗中發現：當土壤pH較高而N的養分更低時，細菌在與真菌的競爭關系中表現為主導作用，此時微生物群落的CUE更高；當細菌被低pH或者高無機氮抑制時，真菌的生物量和對碳底物的利用增大，但CUE更低。Soares等[57]在溫帶和亞寒帶的森林和農田土壤中也發現，當有機質質量較高時，細菌在對碳源利用中占主導且CUE較高。Fitch等[79]對溫帶森林土壤的研究也發現類似的規律；但他們同時發現，外生菌根的相對豐富度增加時，CUE也同時增加。這表明僅將微生物分為細菌和真菌兩組(或者依靠較高級的系統發育水平的分類)來判斷不同微生物對CUE的影響可能是不準確的，因為具有相似功能的微生物類群通常在系統發育上是多樣化的，而同一分類下的菌株也可能具有不同的生理代謝特征[80]。

1.5 外源底物及養分對土壤有機質的激發效應(priming effect)

新鮮底物的輸入為土壤微生物提供了更多的能量和養分。由于新鮮底物(比如凋落物)的C∶N∶P遠高于土壤有機質，因此刺激微生物分解土壤中原有的有機質以獲取氮和磷用于細胞生長[81]。根據激發方向可分為正激發和負激發效應。負激發效應主要表現為：微生物優先利用外源底物，或者微生物對有限養分的強烈競爭導致活性下降，從而降低了對土壤有機物的分解。短期負激發效應可能伴隨之后的正激發效應：當外源底物的能量耗盡之后，生物量已有較大提高的微生物轉而分解土壤有機質獲取能量和養分，從而促進本土有機質的分解[82]。激發效應較高時，如果微生物受到養分限制，則有機碳分解更多分配于呼吸作用，CUE則較低[83]。添加外源氮磷養分時，微生物通過分解有機質以獲取養分的需求減少，理論上而言可以降低外源有機質對土壤有機質激發效應，并改變微生物對于外源底物的CUE。Liu等[84]探索了長期施氮對易降解碳(葡萄糖)和難降解碳(苯酚)的激發效應及CUE的影響，發現氮的添加降低了2種碳的激發效應；但只增加了易降解碳的CUE。而Mehnaz等[32]通過添加不同種類的有機碳和磷的實驗，則發現與假設相反，磷的添加增加了激發效應而對CUE則沒有影響。這可能是由于單一養分添加更促使微生物從有機質中獲取另一養分。Vain等[85]基于秸稈和復合養分添加的實驗發現，有無養分添加的土壤中秸稈引起的激發效應相似，但無養分添加的土壤中秸稈添加導致更高的呼吸作用，即更低的CUE。他們認為，低養分土壤的激發效應可能是通過刺激K-策略的微生物生長并分解有機質獲得的。養分添加所帶來的有機質的激發效應高低和對CUE的影響及土壤酸化亦有關系，相比糞肥，礦質氮的施入導致土壤酸化，可能使其CUE降低而激發效應升高，因此不利于土壤長期碳固持[86]。綜上，外源底物及養分添加帶來一系列效應，如養分相對比例的不平衡，土壤理化性質及微生物群落結構的變化均可以對激發效應和CUE產生影響。而具體的影響因素可能與底物、養分和土壤有機質含量和質量有很大關系[87]，其機制需要進一步深入研究。

2 影響CUE的其他間接因素

如前所述，當研究養分及其化學計量特征對微生物CUE的影響時，常常得到不一致的結果。這表明，養分對于微生物群落結構及生理活性的影響同時受到其他一系列因素，比如土壤溫度和濕度、植被類型或土地利用方式、土壤理化性質等的聯合作用。這些影響因素對CUE的影響機制復雜，本文只側重于討論它們通過影響有機質和養分而對CUE產生的間接作用。目前，不同控制因素之間的交互作用對CUE的影響研究尚處于探索階段，需在未來結合更多研究成果得到更系統性的認識。

2.1 土壤溫度和濕度

土壤溫度和濕度等由氣候調控的因子被廣泛認為是微生物生理學(例如呼吸和生長)的主要控制因素。前人研究發現，微生物CUE隨溫度的升高而降低，總體呈現溫帶比熱帶高的特征[88]。高溫加速微生物活性，提高養分的周轉速率，促進土壤呼吸作用[89]，并導致底物消耗和營養限制[90]，從而降低微生物生長和CUE。熱帶土壤中有機質含量和生物可利用性均更低，造成CUE在氣候帶之間的差異[13, 91]。而土壤濕度則更多地通過影響氧氣擴散，從而改變微生物代謝有機碳的途徑和能量的獲取效率，進而影響CUE[92]。Ullah等[93]發現，季節比干旱對澳大利亞草地土壤微生物CUE的影響更大，而CUE的最高值出現在濕潤的冬季而非干旱的夏季，主要機制是季節變化對于微生物群落結構的影響。Domeignoz-Horta等[94]接種不同的微生物群落到滅菌土壤中并控制土壤溫度和濕度，發現盡管群落結構是最重要的CUE影響因子，溫度和濕度調控微生物多樣性與CUE之間的關系，但是CUE僅在土壤高濕度時與微生物多樣性有正相關關系。

2.2 生態系統類型及土地利用方式

不同生態系統和土地利用方式，植被類型和凋落物輸入也不同。通過植物—根系—微生物—土壤動物相互影響的網絡對水分、養分、有機質、礦物組成等一系列土壤因素有復雜的作用[49, 95]。強烈的人為干擾進一步塑造了不同土地利用方式中土壤特性和功能特征。所有這些因素直接或者間接地改變了土壤有機質的周轉和固持特征[82]。從有機質和養分角度而言，如下3種機制可能對微生物CUE的影響較大：1)植被類型及多樣性、不同凋落物及其他外源有機質的輸入，有機質的總量和質量有差異[96-97]；2)植物地下碳的分配方式[98]和根系分泌物[99-100]的不同；3)人為施肥和其他土地管理方式改變了土壤養分及其化學計量比。盡管不少研究報道了土地利用方式對于微生物生長和CUE的影響[101-102]，亦有研究發現，土壤微生物CUE更多受到溫度和濕度等環境因子的控制，不同生態系統和土地利用方式對CUE的影響相對較小[103]。

2.3 土壤理化性質

土壤pH、粘土礦物、鐵鋁氧化物形態和團聚體構成等土壤理化性質改變了土壤養分的有效性和微生物可獲取程度，從而改變了土壤微生物養分供給，進而對土壤有機質周轉和CUE產生影響。Zhang等[104]在對不同pH土壤添加不同底物的培養實驗中發現，pH和底物質量均對土壤呼吸產生作用，土壤CUE隨著pH值的增大而升高。他們認為這是由于pH對細菌和真菌群落結構的塑造作用所引起的。Silva-Sánchez等[58]將較高pH的土壤其微生物CUE較高歸結為土壤細菌的主導地位。Malik等[105]發現當土壤pH接近中性時，微生物CUE最大，最利于土壤有機碳固持。低pH條件下更高的鋁含量也被認為是低CUE的原因之一，因為更多的能量被分配于降低微生物的鋁脅迫[59]。不少研究發現，土壤剖面深度對微生物CUE亦有明顯影響，大多數研究認為這是由于不同土壤剖面底物和養分含量差異造成的。但研究所得到的規律并不一致：Spohn等[106]發現，森林土壤的CUE不受土壤剖面影響，而草地土壤的CUE則隨深度增加而降低。而Li等[107]和Zhran等[108]分別在濕地、草地、森林土壤和長期施肥的水稻田土壤中研究均發現CUE隨土壤深度的增加而增加。

3 研究前景

由于新研究技術的發展，對于微生物CUE的研究近幾年來迅速發展，在生態系統碳輸入—微生物固碳—土壤碳貯存之間架起了一座橋梁，成為研究生態系統碳儲存潛力和調控機制的關鍵環節。要更好地通過CUE指導生態系統和土地管理，促進土壤固碳，仍然有一些亟待解決的機制和一系列需要回答的科學問題。

首先，土壤微生物CUE測定方法一般分為13C或3H-底物標記法、18O-水標記法、熱量測量比法、代謝通量分析法和化學計量學模型法[25]。這些方法的應用基于不同假設，對微生物代謝特征的不同方面各有側重[109]。如13C或3H-底物標記法采用生物易利用碳，導致CUE偏高，并不能反映環境中微生物對真實底物的利用[16]。13C或3H-底物和18O-水2種標記法只能用于短期培養，無法考察微生物周轉和評估微生物長期碳利用效率[106]。熱量測量法需要微生物生物量和底物碳的氧化狀態等信息用于計算[92]。代謝通量分析法無法計量微生物周轉的影響及分泌物的去向[110]?；瘜W計量法計算所需的微生物胞外酶活性和微生物生物量的碳氮比等參數需要有大量數據，但未涉及微生物代謝過程，僅可視為CUE的代用指標，主要用于模型評估[46]。Geyer等[109]通過應用上述方法對同一土壤微生物CUE進行估測，測定結果有較大差異：其中不使用特定底物的18O法和化學計量學模型法所得CUE較低(< 0.4)，而使用特定底物的13C-3H法、熱量測量法和代謝通量分析法所得數值較高(> 0.6)。這為研究CUE與其他不同測定方法對比，尤其是對大數據整合和模型模擬帶來了挑戰。

其次，微生物CUE研究的另一個挑戰來自當前研究中的生態學尺度和時間尺度的不整合。如前所述，CUE的概念可能涉及某種微生物生理特性、某些微生物之間的種間關系，或是整個生態系統尺度的微生物群落有機碳代謝特征。從微觀生理到宏觀生態尺度的調控機制和影響因子相異。另外，短期實驗主要反映的是微生物對環境變化的短期反應，可能不同于微生物適應新環境條件后所表現的長期響應機制；在不同時間尺度下，碳在不同代謝過程中的分配方式不同，從而影響CUE的大小。因此，需要分析不同研究的生態尺度和時間尺度，明晰在不同尺度下所需要回答的科學問題。對整個生態系統尺度碳循環和儲存的模型需要建立在更細致的尺度上考察底物資源、養分生態計量的限制、微生物群落的組成和生理代謝特性，闡明不同尺度下微生物碳轉化過程及其對環境變化的響應，以預測整個微生物群落的CUE[111]。

第三，微生物CUE決定了土壤微生物將有機質轉化為自身生物量的效率，而微生物殘體是土壤有機碳庫的重要貢獻者，微生物殘體的穩定性決定了土壤碳固持的長久性[10]。因此，要闡明何種機制及哪些影響因素可能影響、調控和增加土壤碳庫時，需要將CUE的提高和微生物殘體的穩定作為一個整體進行考慮。同時，需要在研究中納入多影響因素的交互作用并開展短期和長期研究，以揭示在多個時間尺度上不同影響因素對微生物CUE及微生物殘體穩定性影響的主導因素差異。

最后，氣候變化有可能改變森林生態系統中影響碳儲存的植物和土壤過程。土壤微生物有機質呼吸作用的提高，可能造成土壤碳庫損失的風險[94]。研究氣候變化對微生物CUE的影響有助于判斷微生物調節土壤碳動態的主要響應機制：例如微生物群落組成改變對碳轉化過程溫度敏感性的影響、微生物對限制性養分的開發和利用效率及微生物利用有機質的過程中碳氮磷循環間的耦合關系等。闡明微生物介導的反饋對于理解生態系統對氣候變暖的反應至關重要，并將為氣候變化碳排放和儲存建模提供理論基礎，也為通過人為管理促進養分利用效率，從而進一步提高土壤固碳潛力提供科學指導。