兩株ALV-K重組病毒感染性克隆的構建及病毒拯救

王 淼，陳雪陽，王興明，梁雄燕，楊玉瑩

(長江大學動物科學學院，荊州 434025)

禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)是反轉錄病毒科、α反轉錄病毒屬的一員，根據病毒囊膜基因env和宿主范圍等的不同可將ALV分為11個亞群，其中A～E、J和K亞群的自然宿主是雞[1]。ALV不僅可以引起雞產生腫瘤性疾病，還可以引起雞出現亞臨床癥狀，如雞體消瘦、產蛋下降等，給中國養禽業帶來了巨大的經濟損失[2]。目前市場上仍沒有出現針對ALV的疫苗和有效的治療藥物，主要通過撲殺陽性雞的方法來凈化雞群。禽白血病病毒K亞型(ALV-K)是自2012年新出現的亞型[3]，多來自于無癥狀或亞臨床癥狀的雞，其可能是由于亞群之間的自然重組[4-7]。研究表明，ALV在不同年齡、不同毒株中致病力不同，經試驗接種后，發病情況各不相同，這與毒株、雞品種、接種途徑、劑量、雞的日齡有很大關系[8-9]。

RNA病毒在復制過程中的不穩定性較高，其中的非逆轉錄RNA病毒并不經過DNA階段復制，因此很多情況下無法應用DNA重組技術開展病毒基因組的分析，使得研究存在很大的局限性。反向遺傳學研究是在已知DNA序列的前提下，通過核苷酸定點突變、插入或缺失等基因改造手段，獲取病毒基因組的cDNA，再借助體內、外轉錄等技術獲得具有感染性的轉錄體，通過在易感細胞內的包裝、病毒拯救等重新獲得改造的活病毒粒子或者類似病毒物質[10-11]，研究病毒改造后產生的表型效應，進而研究相關的生物學功能，這類能夠拯救病毒的遺傳材料稱為感染性克隆。近年來，反向遺傳學技術不斷發展，廣泛地應用于在體內對病毒基因結構、功能和病毒-宿主的相互作用以及新型疫苗的研發等方面。

本試驗基于分離到的兩株致病力不同的ALV-K，通過測序分析顯示兩株病毒核酸序列差異集中在5′-端長末端重復序列(5′-LTR)，為研究病毒的致病性是否與5′-LTR相關，使用反向遺傳學技術對這兩株病毒的5′-LTR進行置換，并進行感染性克隆構建及病毒拯救，為進一步研究ALV-K的致病性打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

感染性克隆TOPO-HB2015032-ABC[12]和TOPO-HB2018003-ABC[13]由本實驗室凍存；UMNSAH/DF-1細胞株購自中科院上海細胞庫，由本實驗室凍存。

2×F8 FastLong PCR MasterMix (PC8002)、One Step Seamless Cloning Kit(CV1901)和Zero Background pTOPO-Blunt Simple Cloning Kit(CV1701)均購自北京艾德萊生物科技有限公司；組織/細胞DNA提取試劑盒(GK0122)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(GK2403-50)和質粒提取試劑盒(GK2004-50)均購自上海捷瑞生物工程有限公司；0.25%胰酶(GP3108-100ML)購自Genview公司；胎牛血清(FBS,900-108)購自Gemini公司；DMEM細胞培養基(C11995500BT)購自Gibco公司；禽白血病抗原P27 ELISA檢測試劑盒購自IDEXX公司;TurboFect Transfection Reagent購自賽默飛生物有限公司；FITC標記的羊抗鼠 IgG (D110105)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 引物設計及合成

參考HB2018003毒株和HB2015032毒株基因序列(GenBank登錄號：KY581580)，根據用HB2018003毒株5′-LTR替換HB2015032毒株5′-LTR和用HB2015032毒株5′-LTR替換HB2018003毒株5′-LTR的原則，分別設計擴增HB2018003株5′-LTR和除5′-LTR外的基因組，HB2015032株5′-LTR和除5′-LTR外的基因組的引物(表1)；參考GenBank已發表ALV基因序列設計ALV-A/J/K特異性鑒定引物(表1)；M13引物為Zero Background pTOPO-Blunt Simple Cloning Kit中所列鑒定引物(表1)。引物由武漢擎科生物有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3 目的基因的PCR擴增

以質粒TOPO-HB2015032-ABC為模板，分別以TOPO-032和032-LTR為引物PCR擴增TOPO-032和032-LTR；以質粒TOPO-HB2018003-ABC為模板,分別以TOPO-003和003-LTR為引物擴增TOPO-003和003-LTR，4個片段均使用25 μL反應體系：2×F8 FastLong PCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，質粒模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性 1 min；94 ℃變性 10 s，退火 10 s(溫度見表1)，72 ℃延伸(時間與產物大小相關)，共33個循環；72 ℃延伸 5 min。使用1.0%瓊脂糖凝膠檢測PCR擴增產物并切膠回收。

1.4 感染性克隆的構建及鑒定

使用One Step Seamless Cloning Kit將切膠回收的DNA片段TOPO-032和032-LTR、TOPO-003和003-LTR分別進行重組連接。TOPO-003-032反應體系為2×OneStep Cloning Mix 5 μL，TOPO-032 4 μL，003-LTR 1 μL；TOPO-032-003反應體系為2×OneStep Cloning Mix 5 μL，TOPO-003 3 μL，032-LTR 2 μL。上述反應體系50 ℃孵育1 h后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，復蘇后均勻涂布在Amp抗性平板上，37 ℃過夜培養。

為了鑒定感染性克隆是否構建成功，以TOPO-HB2015032-ABC為對照，M13R和003-LTR-R為引物通過PCR的方法檢測重組質粒TOPO-003-032；以TOPO-HB2018003-ABC對照、M13F和032-LTR-R為引物檢測TOPO-032-003是否重組。PCR反應體系25 μL：2×F8 FastLong PCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，質粒模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性1 min； 94 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共30個循環； 72 ℃延伸5 min，使用1.0%瓊脂糖凝膠進行檢測。

1.5 病毒拯救及鑒定

將易感的DF-1細胞鋪6孔板，待生長至80%匯合度時，將鑒定和測序正確的質粒TOPO-003-032和TOPO-032-003使用轉染試劑TurboFect Transfection Reagent分別轉染鋪好的DF-1細胞，利用宿主細胞酶系統進行病毒的拯救。將轉染質粒的DF-1細胞置于5% CO2的37 ℃細胞培養箱過夜培養；棄去培養基，PBS洗兩遍，加入1%血清DMEM培養基，72 h后收取細胞上清進行群特異性抗原P27 ELISA檢測。提取盲傳3代后DF-1細胞基因組DNA并使用ALV-A/J/K多重PCR對其進行鑒定。PCR反應體系為：2×F8 FastLong PCR MasterMix 12.5 μL，ALV-A/J/K-F 2 μL，ALV-AR 1 μL，ALV-JR 1 μL，ALV-KR 0.5 μL，DNA模板 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性1 min；94 ℃變性 10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共30個循環；72 ℃延伸5 min，使用1.0%瓊脂糖凝膠進行PCR擴增產物檢測。

1.6 間接免疫熒光試驗(IFA)鑒定

將檢驗陽性的細胞培養物上清接種于DF-1細胞，在含有5% CO2的37 ℃培養箱培養1 d后棄去培養基，PBS洗滌3次；用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3 次；加入0.5% Triton X-100作用15 min，PBS洗滌后加入10% FBS封閉1 h，PBS洗滌3次；以本實驗室制備的抗ALV-K 抗體KM3為一抗(1 000倍稀釋)，孵育45 min，用PBS洗滌，最后加入200倍稀釋的FITC標記的羊抗鼠IgG，PBS洗滌后于倒置熒光顯微鏡(萊卡 DMi8)觀察。

2 結 果

2.1 目的基因擴增

PCR擴增結果顯示，TOPO-032、032-LTR、TOPO-003和003-LTR分別擴增出9 243、314、9 247和345 bp的條帶(圖1)，與預期結果一致。

M1，DL10000 DNA Marker；1，TOPO-003；M2，DL2000 DNA Marker；2，032-LTR；3，TOPO-032；4，003-LTR圖1 目的基因擴增Fig.1 Objective gene amplification

2.2 重組感染性克隆PCR鑒定

通過PCR對構建的重組質粒TOPO-003-032和TOPO-032-003進行鑒定，結果顯示以TOPO-003-032質粒為模板的擴增出417 bp大小的條帶，而以TOPO-HB2015032-ABC質粒為模板未見任何條帶，表明已重組(圖2A)；以TOPO-032-003質粒為模板的擴增出369 bp大小的條帶，而以TOPO-HB2018003-ABC質粒為模板未見任何條帶，表明已重組(圖2B)。

M，DL2000 DNA Marker；1，TOPO-003-032；2，TOPO-HB2015032-ABC；3，TOPO-032-003；4，TOPO-HB2018003-ABC圖2 重組感染性克隆TOPO-003-032(A)和TOPO-032-003(B)的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of recombinant infectious clones TOPO-003-032 (A) and TOPO-032-003 (B)

2.3 病毒拯救及鑒定

提取轉染重組質粒TOPO-003-032和TOPO-032-003并盲傳3代的DF-1細胞基因組DNA，應用ALV-A/J/K多重PCR鑒定，結果顯示均在535 bp(ALV-K)處出現預期條帶，未出現715(ALV-A)和430 bp(ALV-J)條帶(圖3)。

M，DL2000 DNA Marker；1，ALV-A/J/K陽性對照；2，陰性對照；3，轉染重組質粒TOPO-003-032的DF-1細胞；4，轉染重組質粒TOPO-032-003的DF-1細胞 M，DL2000 DNA Marker；1，ALV-A/J/K positive control；2，Negative control；3，DF-1 cells transfected with recombinant plasmid TOPO-003-032；4，DF-1 cells transfected with recombinant plasmid TOPO-032-003圖3 ALV-A/J/K多重PCR鑒定Fig.3 Mulit PCR identification of ALV-A/J/K

2.4 間接免疫熒光試驗鑒定

以本實驗室制備的抗ALV-K單抗KM3為一抗孵育接種了拯救的兩株病毒的DF-1細胞出現明顯的亮綠熒光，陰性對照則沒有出現熒光(圖4)。結果表明成功拯救出病毒，并分別將拯救的病毒命名為rHB2022050(TOPO-032-003)和rHB2022051(TOPO-003-032)。

A，rHB2022050(TOPO-032-003)；B、D，陰性對照；C，rHB2022051(TOPO-003-032) A，rHB2022050(TOPO-032-003)；B and D，Negative control；C，rHB2022051(TOPO-003-032)圖4 間接免疫熒光試驗(200×)Fig.4 Indirect immunofluorescence assay (200×)

3 討 論

ALV可引起禽類免疫抑制病，生長緩慢，同時也可以引起多器官腫瘤，導致死亡，與馬立克氏病、網狀內皮組織增生癥并稱禽類三大腫瘤性疾病，ALV感染后可導致髓細胞瘤、淋巴細胞瘤、成紅細胞瘤等[14]。2012年，自王鑫等[3]發現ALV-K后，在中國其他地區陸續發現該毒株，海外地區如日本等也有相關報道[5-7,15-16]。由于ALV-K多在無臨床癥狀或者亞臨床癥狀的雞群中分離，且該亞群病毒致病力和病毒復制能力等較弱，在實際生產中極易被忽視。中國科學院國家基因研究中心(NCGR)對ALV-K進行監測和分離，發現ALV-K的分離率逐漸上升，且新分離的毒株復制能力明顯增強，對新的ALV-K分離株進行序列分析等發現，pol基因存在單核苷酸缺失，導致病毒的逆轉錄酶活性、病毒復制能力和垂直傳播水平等都有顯著提高[17]。在病毒復制過程中突變時發生，只有能夠幫助病毒獲得新功能或競爭優勢的突變才能穩定保留下來。ALV-J在5′-端非編碼區插入19個堿基可以提高其在DF-1細胞中的復制能力[18]，而在3′-端非編碼區缺失會使其致瘤性和致死率急劇上升[19]，說明病毒基因組在進化過程中保留的突變會帶來生物學特性極大的變化。ALV-K可能成為繼J亞群禽白血病病毒之后成為中國養雞業新的重大潛在威脅[6,20]。

ALV屬于RNA病毒，病毒在復制過程中極容易發生突變，而反向遺傳學技術是研究病毒分子特性的重要工具，可以獲得較為穩定且遺傳背景清晰的病毒[21]。HB2015032為致瘤型ALV-K[22]，而HB2018003自然病例在剖檢等研究過程中未發現明顯的病變。通過基因序列比對發現HB2018003和HB2015032兩株病毒的核苷酸同源性約為94.7%，且變異的區域主要集中在5′-LTR[23]。為驗證這種致瘤性的差異是否是由這種集中在5′-LTR區域的變異引起的，因此將兩株病毒的5′-LTR區進行互換后重組，以本實驗室前期構建的HB2018003和HB2015032的感染性克隆為模板，使用PCR擴增相關的基因并進行同源重組，成功構建出5′-LTR相互置換的兩株ALV-K。酶切法是構建感染性克隆的經典方法，應用廣泛，但病毒基因組中可能需要插入相關的分子標記，此過程中可能會出現移碼、突變等問題。在設計引物的過程中添加20 bp左右病毒基因組作為同源臂從而避免引入外源酶切位點的問題。同源重組法可同時將2條或以上的片段一次性連接，并且操作相對簡單快捷，陽性率高，從而減少浪費大量時間。兩株重組病毒的構建為后續研究ALV-K相關的生物學特性、致病性等方面提供材料，同時也為進一步了解ALV的進化和發展提供了一定的參考。

4 結 論

本研究以兩株ALV-K(HB2015012和HB2018003)為親本株采用同源重組的方法構建了5′-LTR互換的感染性克隆TOPO-003-032和TOPO-032-003，并成功拯救出病毒rHB2022050(TOPO-032-003)和rHB2022051(TOPO-003-032)。