丙泊酚減低EZH2對miR-34a抑制效應與腸癌細胞增殖侵襲能力變化的研究

梁偉華,蔣 淼

(復旦大學附屬華山醫院北院寶山分院 上海市寶山區仁和醫院麻醉科，上海200431)

結直腸癌(Colorectal cancer，CRC)為世界常見的惡性疾病，且發病率呈逐年上升趨勢[1]。手術治療仍為結直腸癌治療的主要方式；近年研究發現，麻醉劑可引起細胞代謝、炎癥或免疫狀態，并在圍手術期甚至長遠影響患者預后和復發，然而其機制不明[2-3]。丙泊酚(Propofol)為廣泛用于手術的麻醉劑。Wu等[4]發現丙泊酚用于結直腸癌治療與患者良好生存有關。機制研究方面，丙泊酚可增強T細胞殺傷能力，抑制腫瘤免疫逃避作用[5-6]；有研究發現丙泊酚可抑制結直腸癌細胞增殖、上皮間充質轉化和細胞轉移侵襲能力，發揮抗腫瘤活性[7-8]，但其具體調控靶點尚不明朗。

微小RNA(microRNA，miRNAs)為一類可調控細胞增殖、凋亡、氧化應激、炎癥等廣泛生物學反應的小分子非編碼RNA[9-10]。據報道微小RNA異常表達與腫瘤發生、發展密切相關[11-12]。miR-34為結直腸癌重要抑癌miRNA，可通過干預諸如STAT3、SNAIL、ZEB1等多種促癌因子表達抑制腫瘤細胞增殖、轉移、侵襲功能[13-14]。miR-34a在腸癌組織中表達下調[15-17]，其下調與一種表觀沉默蛋白卷曲同源2增強子(Enhancer of zeste homolog 2，EZH2)密切相關；研究證實EZH2可招募至miR-34a啟動子，引起組蛋白發生甲基化修飾，空間結構發生改變，抑制miR-34a轉錄[18-20]。因此，抑制EZH2結合、誘導恢復miR-34a表達水平具有重要的臨床價值。最新研究發現丙泊酚具有調控細胞miRNA表達水平的作用，如miR-141、miR-200c及miR-9等[21-23]。本文擬對丙泊酚對腸癌細胞增殖、轉移和侵襲作用進行研究；探究其對miR-34a是否存在誘導作用，并對誘導機制展開初步研究，為丙泊酚抗腫瘤活性提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人結直腸癌細胞SW480、HCT116購自中國科學院上海生命科學院細胞資源中心。丙泊酚購自美國Sigma Aldrich公司；miR-34a mimics及inhibitor由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；轉染試劑LipofectamineTM 3000試劑購自美國Invitrogen公司；EZH2及GAPDH定量采用逆轉錄-實時熒光定量PCR檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司；miR-34a及U6定量檢測試劑盒購自德國QIAGEN公司；染色質免疫沉淀-定量PCR(SimpleChIP Enzymatic Chromatin IP Kit)購自美國CST公司；CCK-8試劑盒購自碧云天生物有限公司；Transwell小室購自Corning公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：人結直腸癌細胞SW480、HCT116購自中國科學院上海生命科學院細胞資源中心。用含10%胎牛血清、100 μg/ml 鏈霉素和 100 U/ml青霉素的DMEM高糖培養液，置于27 ℃、5% CO2的培養箱中培養。收集對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.2.2 細胞處理和實驗分組：研究丙泊酚對EZH2和miR-34a作用，分成兩組：①對照組，即0.9%氯化鈉溶液處理；②丙泊酚組，即丙泊酚處理。研究丙泊酚和miR-34a對腸癌細胞增殖、侵襲作用，分成四組：①對照組，即0.9%氯化鈉溶液，同時細胞轉染了miRNA陰性對照mimics；②丙泊酚組，即丙泊酚處理；③miR-34a組，即細胞轉染miR-34a mimics；④丙泊酚+miR-34a inhibitor組，細胞同時受到丙泊酚及miR-34a inhibitor處理。丙泊酚用培養液稀釋與終濃度為10 μg/ml，與腸癌細胞共培養。miR-34a mimics及inhibitor轉染細胞采用Lipo3000，按廠商說明書進行轉染。

1.2.3 逆轉錄實時熒光定量(RT-qPCR)：EZH2定量按總RNA提取、逆轉錄及熒光定量PCR按試劑盒說明書操作。其中各基因引物為：EZH2：F：5’-AAT-CAGAGTACATGCGACTGAGA-3’，R：5’-GCTG-TATCCTTCGCTGTTTCC-3’；GAPDH為內參基因：F:5’-GACCTGACCTGCCGTCTA-3’，R:5’-AG-GAGTGGGTGTCGCTGT-3’。miR-34a定量按miRNA熒光定量PCR按試劑盒說明書操作，其中U6為內參基因。Real-time定量PCR條件為：95 ℃ 10 min后,95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 循環。Real-time定量PCR使用ABI 7500儀器進行。根據待測標本的Ct值，以GAPDH或U6作為內參照，采用2-△△Ct法計算相對表達倍數變化。

1.2.4 染色質免疫沉淀-定量PCR(ChIP-qPCR)：按說明書進行處理，通過細胞甲醛交聯、染色體酶促消化、EZH2免疫沉淀、洗脫及解交聯、最后純化DNA，利用qPCR檢測 EZH2沉淀DNA中靶基因的含量。

1.2.5 細胞增殖活性檢測(CCK-8)：對照組及各處理組細胞以每孔1000細胞接種96孔板，經過各種處理后，于終止時刻加入CCK-8溶液(10 μl/孔)，繼續培養4 h。通過酶標儀測量該樣品在450 nm處的吸光度值。

1.2.6 細胞侵襲能力：分析腸癌細胞制成單細胞懸液并調整濃度至5×104接種于Transwell小室(鋪有Matrigeal膠)，下室加入正常含胎牛血清完全培養基700 μl，培養48 h后取出小室。預冷甲醇，固定10 min，在PBS中用棉簽刮去小室上層細胞后，進行結晶紫染色，ddH2O清洗。倒置顯微鏡取3個視野，計數取均值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件進行分析。兩組比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用Dunnet-t檢驗；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 丙泊酚對miR-34a及EZH2表達的影響 分別對腸癌細胞株HCT116及SW480進行丙泊酚處理。與對照組比較，丙泊酚組細胞miR-34a表達顯著上調(P<0.01)，而EZH2表達水平明顯抑制(P<0.01)。見表1。

表1 miR-34a及EZH2在對照組及丙泊酚組中表達比較

2.2 對照組細胞和丙泊酚組細胞EZH2在miR-34a啟動子富集程度的比較 利用ChIP-qPCR方法，我們檢測了對照組細胞和丙泊酚組細胞中，EZH2于miR-34a啟動子富集程度的變化。如表2所示，丙泊酚組SW480及HCT116細胞的EZH2在miR-34a啟動子富集程度顯著低于對照組細胞(P<0.01)，提示EZH2對miR-34a轉錄抑制作用減弱。

表2 對照組細胞和丙泊酚組細胞EZH2在miR-34a啟動子富集程度的比較

2.3 丙泊酚、miR-34a mimics以及丙泊酚+miR-34a inhibitor聯合處理組與對照組腸癌細胞SW480增殖活性比較 鑒于丙泊酚對miR-34a抑制作用，我們分析了兩者對腸癌細胞增殖活性的影響。結果發現丙泊酚和miR-34a處理SW480、HCT116細胞48 h，顯著抑制其增殖活性(P<0.01)。為分析丙泊酚的抑制作用是否依賴miR-34a，我們又進行了丙泊酚與miR-34a inhibitor聯合處理，丙泊酚的抑制增殖活性被miR-34a inhibitor減弱，提示miR-34a是丙泊酚發揮抑制作用的重要干預靶點。見表3、4。

表3 丙泊酚、miR-34a mimics以及丙泊酚+miR-34a inhibitor聯合處理組與對照組腸癌細胞SW480增殖活性比較

表4 丙泊酚、miR-34a mimics以及丙泊酚+miR-34a inhibitor聯合處理組與對照組腸癌細胞HCT116增殖活性比較

2.4 丙泊酚及miR-34a對腸癌細胞侵襲的影響 Transwell小室試驗表明丙泊酚和miR-34a處理SW480、HCT116細胞48 h后，穿膜細胞數顯著減少。此外，我們也進行了丙泊酚與miR-34a inhibitor聯合處理，丙泊酚的抑制增腸癌細胞侵襲能力被miR-34a inhibitor減弱，提示miR-34a為丙泊酚重要靶點。見圖1(表5)。

圖1 丙泊酚、miR-34a mimics以及丙泊酚+miR-34a inhibitor聯合處理組與對照組腸癌細胞侵襲能力比較(迪夫快速染色，×20)

表5 丙泊酚、miR-34a mimics及丙泊酚+miR-34a inhibitor聯合處理組與對照組腸癌細胞侵襲能力比較

3 討 論

丙泊酚作為靜脈麻醉劑有諸多優點，如鎮靜、催眠、遺忘效應、作用時間短、起效快、易于控制、清醒時間快、不易藥物蓄積等[24-25]，因此廣泛用于腫瘤切除手術中。最近研究表明丙泊酚除麻醉效應外，還具有抗腫瘤活性，但其藥理機制不明確。miR-34a為抑制結直腸癌細胞惡性生物學表型的重要抑癌miRNA；然而在結直腸癌發生、發展過程中由于EZH2導致miR-34a啟動子區域染色質空間結構變化，顯著抑制了miR-34a轉錄表達[18,20,26]。因此，解除EZH2-miR-34a作用，可恢復miR-34a生物學功能，為前景較好的干預療法。

據報道丙泊酚具有調控細胞miRNA表達水平的作用，我們推測丙泊酚是否可能通過EZH2-miR-34a發揮其抗腫瘤活性呢？我們首先對腸癌細胞SW480和HCT116進行了丙泊酚處理，利用qPCR檢測發現，丙泊酚可明顯誘導miR-34a表達升高，并抑制EZH2表達，證實了丙泊酚對miR-34a和EZH2的調控作用。同時，我們也發現丙泊酚不僅可以減低EZH2的表達，而且也可影響EZH2在miR-34a啟動子區的結合程度。利用ChIP-qPCR發現，對照組細胞EZH2相對富集程度可達到38.20～69.36；而丙泊酚處理后，EZH2相對富集程度僅為6.28～11.25，EZH2對miR-34a啟動子抑制能力顯著減低，進一步闡明了丙泊酚對miR-34a的抑制機理。據文獻報道，EZH2結合靶基因啟動子后，可催化組蛋白3的第27位賴氨酸發生三甲基化(H3K27me3)修飾甲基化修飾，從而影響靶基因轉錄活性[27]；同時EZH2作為多梳復合物(Polycomb Group Protein)的催化亞單位，還與其他因子共同介導靶基因的表觀沉默[28]。本研究僅揭示了丙泊酚可減少EZH2在miR-34a啟動子的富集程度，可能丙泊酚還參與更為復雜的表觀調控網絡，尚需進一步研究。

我們揭示了miR-34a為丙泊酚靶點后，我們驗證了丙泊酚的抗腫瘤作用。有文獻報道，丙泊酚可抑制淋巴瘤、宮頸癌、乳腺癌細胞增殖和侵襲作用[20,23]，本研究也同樣發現了丙泊酚可在體外抑制腸癌細胞增殖和侵襲。此外，我們也證實了腸癌細胞過表達miR-34a具有抑制細胞增殖和侵襲作用。為進一步研究丙泊酚是否依賴miR-34a的表達發揮其抗腫瘤活性，我們也進行了補救實驗，即在丙泊酚處理同時，特異性抑制miR-34a，結果發現丙泊酚的抑制增殖和侵襲作用減弱，佐證了我們的推測。

綜上所示，我們發現丙泊酚對腸癌細胞的增殖和侵襲能力具有顯著抑制能力。丙泊酚通過減低EZH2的表達及在miR-34a啟動子的富集，促進miR-34a轉錄表達，從機理上揭示了丙泊酚的抗腫瘤作用，為其成為潛在臨床腫瘤治療提供了實驗依據。