北京某豬場斷奶仔豬呼吸道疾病的診斷

陳泓岑，劉世洲，王 樂，?？尚?，盧天航，雒星辰，鄧 楊，李子萱，劉博文，張永紅 ，崔德鳳

（北京農學院動物科學技術學院／獸醫學（中醫藥）北京市重點實驗室，北京 102206）

病毒、細菌和環境應激等諸多因素可誘發呼吸道疾病綜合征（Porcine respiratory syndrome，PRDC），其病毒類病原主要包括豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）、豬圓環病毒2型（Porcine circovirus，PCV2）、豬巨大細胞病毒等；細菌類病原包括豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）、多殺性巴氏桿菌（Pasteurellamultocida，Pm）和副豬嗜血桿菌（ Haemophilus parasuis，Hs）等。呼吸道疾病綜合征發病豬的主要癥狀為較高的體溫，同時伴有咳嗽、體型消瘦、喘氣、呼吸困難、食欲減退等癥狀，最終導致降低經濟價值或死亡。本病主要發生于斷奶仔豬，因為母乳中含有抗體，而斷奶仔豬缺乏抗體會導致免疫功能低下而患病，本病的發病率高達30%～80%，且病死率高達5%～30%。呼吸道疾病綜合征（PRDC）主要與規?；B豬場的密集養殖、通風不良、衛生環境不良和環境應激刺激等諸多因素有關，這些是引起該病在養豬業的發病率高的重要原因。一般而言，豬場在發生呼吸道疾病的前期，常見各種應激因素，如：寒冷潮濕、轉群或運輸、突然冷熱交替、豬群密度大過于擁擠、氨氣味過大、疫苗免疫等；還有營養不良或不均衡、免疫力低和豬流感或感冒共同作用，故而使豬呼吸道疾病頻頻發作交叉感染，最終導致多種致病因素的混合感染，并導致死亡率增加。

1 疾病簡介

1.1 豬傳染性胸膜肺炎

放線桿菌可導致高傳染性、高致死率的豬傳染性胸膜肺炎。劉奎昊等人對山東某豬場的病死豬剖檢，發現豬的心包有擴張、肺臟胸膜表面出現纖維素滲出，還有研究表明有的豬會出現淋巴結腫大。董發明等人對一豬場的傳染性胸膜肺炎進行了調查，發現斷奶仔豬和育肥豬的發病率高，最急性、急性、慢性型3種發病形式均存在，其中最急性型發病率僅0.98%，但是病死率極高，約為91.43%，呼吸困難是該病導致豬死亡的主要原因，病死豬皮膚往往呈現藍紫色。該病在我國流行的血清型為1型、5型和7型。

1.2 豬支原體肺炎

豬肺炎支原體又稱豬氣喘病。有研究表明，該病在春冬季節的陽性檢出率高，分別為66.67%和77.78%；育肥豬以及繁育母豬陽性率較高，分別為63.41%和86.49%。李石對北疆地區的豬場發病情況進行調查后發現，染病后的豬會出現明顯的咳嗽，腹式呼吸等癥狀，對病死豬進行剖檢后發現肺部有不同程度的肺氣腫和肺實變。

1.3 豬圓環病毒病

豬圓環病毒（PCV）是已知最小的動物病毒之一，現已知有四種血清型，主要病原為PCV2。在尹麗萍等人的研究中，41到90日齡的豬只PCV2抗體檢出率最高，為47.92%；PCV2還常與其他病原混合感染，其中與PRRSV的混合感染率最高為30.43%。PCV2可以造成母豬生殖障礙；生長發育豬呼吸道疾??；皮膚炎癥和腎衰；仔豬先天震顫，仔豬一出生就會震顫，也稱“抖抖豬”和斷奶仔豬多系統衰竭綜合征，該病可直接、間接、垂直傳播。

1.4 豬繁殖與呼吸綜合征

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）主要引起病豬的皮膚發紺、呼吸障礙和雙耳皮膚變藍，所以又稱為“藍耳病”，可直接、間接和垂直傳播。2020年一研究表明，保育豬陽性檢出率最高，為32.24%，其次是哺乳豬，為19.09%。賈義平等人對一豬場的發病情況進行調查后發現該病可導致育肥豬發育緩慢，厭食沉郁，母豬流產，死胎，而后陸續傳染到其他豬舍，仔豬舍和保育豬舍。

2 材料與方法

2.1 發病情況與樣品采集

北京市某規?；B豬場自2021年9月以來，該場斷奶仔豬（40日齡）進入保育舍20 d左右出現咳嗽、氣喘、呼吸困難、持續性消瘦以及嚴重急性死亡等臨床癥狀，通過統計后死亡率在10%～30%。對病死豬進行病理剖檢，結果顯示，肺組織有不同程度的間質性肺炎，肺組織間水腫，淋巴結腫脹出血；肝腫大，呈黑褐色，有血水流出；腎臟表面存在白色壞死斑點；脾臟腫大，邊緣呈鋸齒狀，部分呈黑褐色。選取病豬進行前腔靜脈采血10 mL，于4℃ 3 000 r/min 離心20 min分離得到血清，用于后續病毒DNA、RNA的提取與鑒定。將病死豬進行剖檢，采集肺臟、肝臟、 脾臟、腎臟、淋巴結、氣管及支氣管分泌物、扁桃體及滲出液進行常見病原檢測。

2.2 主要試劑及儀器

LB營養瓊脂購自北京奧博星生物技術有限責任公司，血瓊脂平板、血清瓊脂平板和巧克力瓊脂平板自制，革蘭氏染色液購自碧云天，細菌核酸提取試劑盒購自康為世紀，病毒 DNA/RNA提取試劑盒、2×Pro Taq預混液、Evo M-MLV反轉錄預混型試劑盒購自艾科瑞生物；PCR引物為生工生物工程（上海）股份有限公司合成。電泳儀（WH-600-LCD）購自上海雙琪生物科技有限公司，PCR儀T100購自Bio-Rad，全自動高壓滅菌鍋TMQR-3250購自山東新華醫療器械有限公司。

2.3 實驗方法

2.3.1 樣品處理

將豬場采集的病豬組織切成小塊，用剪刀剪碎，放入組織勻漿器中，加入適量滅菌PBS緩沖液反復研磨，置-80℃的超低溫冰箱內反復凍融3次以上，最后將組織勻漿離心，提取上清液備用。

2.3.2 病毒DNA和RNA的提取

用制備好的組織勻漿上清液及血清作為待檢樣本，采用 Steady Pure 病毒DNA/RNA 提取試劑盒，依據試劑盒說明書進行病毒核酸提取、純化，將得到的 DNA和RNA保存于-20℃冰箱中備用。

2.3.3 cDNA的制備

將提取的病毒RNA根據反轉錄試劑盒說明書進行 PT-PCR擴增，首先去除基因組DNA，5Xg DNA Clean Reaction Mix加 入 2μL和RNA樣本8μL，反應條件：42℃2 min后進行反轉錄反應，然后將該病毒的cDNA置于-20℃冰箱保存。

2.3.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

PRRSV和PCV2的檢測都選擇20μL的反應體系，反應體系為 10μL 的 2×SYBRGreen Pro Tap HS Premix；上游引物和下游引 物 各 0.4 μL；模 板 2.0 μL；ROX Reference Dye（20μmol/L）0.4 uL；RNase Free dH2O 為6.8 μL。PRRSV的引物F為AAT AACAACGGCAAGCAGCAG；R為CCTCTGGACTGGTTTTGT反應條件為95℃預變性30 s；然 后 95℃ 5 s，55℃ 30 s重 復40個 循 環。PCV2的 引 物F為GCGGGCCAAAAAAGGTACAG TTCC；R為 ACCAGCGCACTT CGGCAGCGGCAG，反應條件為95℃預變性 30 s；然后 95℃ 5 s，66℃ 30 s重復40個循環。各自分別使用10倍稀釋的自建標準質粒進行絕對定量PCR擴增。

2.3.5 PCR擴增

PCR擴增體系為2×Pro Taq預混液10 μL，上游引物和下游引物（10 μmol/L） 各 1 μL，cDNA模板2μL，無酶無菌水6μL；反應條件為先94℃預變性3 min，然后94℃變性30 s，退火45 s（退火溫度根據表1中各自的退火溫度設定），72℃延伸 45 s，35個循環，72℃延伸7 min。取5μL擴增終產物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件110 V，30 min。

2.3.6 細菌分離

從病死豬采集的臟器等樣品，用燒灼滅菌的接種環釣取組織，進行血清營養肉湯增菌37℃培養24 h，分別劃線接種于血瓊脂平板、血清瓊脂平板、巧克力瓊脂平板，置于37℃恒溫箱培養24 h；進行細菌純培養，細菌形態觀察和細菌16SrRNA鑒定。采用細菌16SrRNA 通用引物和特異性引物，詳見表1，按照細菌常規方法進行PCR擴增，凝膠電泳成像，觀察結果。

表1 病原菌和病毒引物序列

2.3.7 病原菌和病毒引物

3 結果與分析

3.1 PRRSV檢測結果

根據本研究設計的以PRRSV ORF7基因為目的片段的引物，對19個血清樣品進行了PRRSV檢測，PRRSV陽性樣品可于434 bp處看見高亮條帶。如圖1中樣 本 編 號 3、5、6、7、11、12、13、15、16、17、18、19的 樣本在434 bp處可以觀察到陽性條帶。

圖1 PRRSV RCR電泳結果

使用PRRSV N蛋白基因特異性引物，對PRRSV陽性樣本進行實時熒光定量PCR檢測病毒載量，檢測結果與普通PCR結果相一致，其中編號為17、18的樣本PRRSV N蛋白mRNA表達量較高（見圖2）。

圖2 PRRSV陽性樣本qRT-PCR結果

在 19 份血清樣品中檢出PRRSV 陽性有12份，檢出率為63.15%。據了解，該豬場目前正在使用天津株豬藍耳病弱毒疫苗，經過基因序列比較，結果表明，所檢出病毒不屬于疫苗毒株，而屬于流行毒株。

3.2 PCV2檢測結果

運用普通PCR的方法對9份組織樣品與10份血清樣品進行豬圓環病毒2型（PCV2）的檢測，PCV2陽性樣品可于494 bp處看見高亮條帶。如圖3中樣本編號為1、4、5、8、10的樣本在494 bp處可以觀察到陽性條帶。

圖3 PCV2 PCR電泳結果

使用PCV2 Cap蛋白基因特異性引物，對PCV2陽性樣本進行實時熒光定量PCR檢測，結果與普通PCR 電泳結果相一致，其中編號為4的樣本PCV2 Cap蛋白mRNA表達量最高（見圖4）。

圖4 PCV2陽性樣本qRT-PCR結果

在9個組織樣品本中，4份樣品檢出PCV2，在10個血液樣本中，1個樣本檢出PCV2，累計檢出率達26.3%。據了解，該場目前采用的是PCV2 2a型豬圓環病毒疫苗，經基因序列比較，顯示PCV2病毒為2d型。

3.3 細菌檢測結果

通過細菌分離培養，PCR擴增SS、App、Pm、MH的核酸，病原菌均未檢出，結果都為陰性。

3.4 檢測結果統計

在檢測的19例斷奶仔豬的樣品中，有12例感染PRRSV和5例感染PCV2，檢測樣品中未撿出SS、Hps、Pm、Bb等病原。經基因序列比較，結果顯示，PRRSV和PCV2與接種疫苗的基因序列存在很大的差異。

4 討論

豬呼吸道傳染病是集約化豬場養殖中的大問題，豬場因此病引發的經濟損失也是不可估量的。該病的發病率約在30%～80%之間，病死率在5% ～ 30%之間，甚至會超過上限值。在該豬場的19例病豬中，PRRSV的檢出率是63.15%，PCV2的檢出率為26.3%，雖然該豬場已經接種過疫苗，但是由于基因型不一致而導致免疫效果不理想，而無法起到有效的保護作用。

有研究表明，從2015到2019年我國各地發現PCV2的總患病率為46%，母豬患病率為48.8%，公豬患病率為47.6%，新疆的患病率最高為86.3%。PCV2進入機體以后，可感染淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等，引起免疫抑制；PCV2感染淋巴組織后，可導致淋巴細胞凋亡、破壞淋巴濾泡結構，淋巴組織流失并被結締組織取代，最終導致免疫抑制，機體對其他病原的抵抗能力減弱導致繼發感染。有研究表 明，2016-2018年PRRSV的 檢出率逐年上升，從21.08%上升到41.72%，并且育肥豬、保育豬和哺乳仔豬的感染比例分別為35.29%、41.83%和56.67%。在豬場中，PRRSV與PCV2常常處于共感染狀態，并且這種狀態有助于PCV2的復制，在共同感染狀態下，病豬的臨床癥狀要比單獨感染更強，死亡率也更高。

養豬場在疫病防治上不能松懈，在加強硬件設備基礎的同時應著重加強對病毒的管理，加強對疾病的防治。同時，獸醫應適時、有序地對豬場的免疫情況進行監控、評價，并制定出一套科學、有效的疫苗接種方案，這對提高養豬場的經濟效益、提高生產的穩定性起到了關鍵作用。從養豬的飼養管理上，對存在的問題進行及時的補漏，才能達到預防或減少疫情發生的目的。

防控措施：

1）接種疫苗，在豬場采集樣本送實驗室檢查，針對豬場現有病原接種相應疫苗；

2）使用抗菌藥，如泰樂菌素、恩諾沙星等藥物，以“預防為主，治療為輔”為用藥原則；

3）合理運用中藥、中藥組方及其衍生物等作為飼料預添加劑來達到預防疾病的作用，如蒲公英、淫羊藿、板藍根等；

4）改善豬場的飼養環境：

①斷奶仔豬不能密度太大，會影響采食、飲水和休息，主要容易產生應激；

②保持每天通風、換風，保持環境衛生干凈；

③本病在秋冬季節要做好豬舍的防寒、保溫工作，以免天氣驟變對生豬產生應激，降低其免疫力；

④對病死豬及時進行隔離以及無害化處理，以免造成大面積傳染。