右美托咪定在減輕脂多糖誘導人腎小管上皮細胞損傷中的作用研究

林宗斌 朱靜文 朱崢 邵自強 劉景全 孫仁華

重癥監護病房超過50%的急性腎損傷（acute kidney injury,AKI）與膿毒癥有關[1]。脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）引起的腎小管上皮細胞損傷是膿毒癥AKI發生的關鍵病理生理學環節，但其損傷機制不明[2]。干擾素調節因子1（interferon regulatory factor 1,IRF1）是一種重要的核轉錄因子，近年來的研究發現，IRF1可以對細菌感染產生響應，調控一系列與炎性反應、細胞增殖、凋亡相關的基因表達[3]。有研究顯示，IRF1在LPS及缺血-再灌注等原因導致的器官損傷過程中發揮著一定的作用[4]。右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）是一種鎮痛、鎮靜藥物，廣泛應用于手術麻醉。近期研究表明，DEX還具有減輕炎癥及調控免疫功能的作用。一些研究發現，DEX可以減輕包括膿毒癥引起的多種器官損傷[5]。但是DEX對膿毒癥患者臟器功能保護作用的機制尚不明確。本研究通過分析LPS及DEX處理后腎小管上皮細胞RNA測序的結果，探討DEX在減輕LPS誘導腎小管上皮細胞損傷中的作用，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 細胞培養 人腎小管上皮細胞（human kidney-2,HK-2）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。細胞培養采用添加10%FBS及1%青-鏈霉素的最低必需培養基（minimum essential medium,MEM），培養基購自武漢普諾賽生命科技有限公司（批號：PM150410P，規格：500 ml），培養環境為濕度恒定的37℃、5%CO2培養箱。2～3 d使用胰酶消化傳代1次，胰酶購自美國Gibco公司（批號：25200-056，規格：250 ml），取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.2 方法

1.2.1 高通量RNA測序 使用10 μmol DEX（揚子江藥業集團有限公司，批號：H20183220，規格：0.1 mg）或10 μg/ml LPS（上海 MedChemExpress公司，批號：HYD1056，規格：5 mg）處理HK-2 24 h，以未經任何處理的細胞作為對照細胞。使用Trizol試劑（美國Thermofisher公司，批號：15596018，規格：200 ml）提取細胞總RNA樣本，通過HiSeq 2500系統進行RNA測序。

1.2.2 細胞轉染 為上調細胞中的IRF1，以pcDNA3.0為骨架構建IRF1過表達質粒，命名為pcDNA3.0-IRF1。使用pcDNA3.0空質粒作為陰性轉染對照。轉染時質粒濃度為2 μg/ml。為下調細胞中的IRF1，設計合成針對IRF1的小干擾RNA（siRNA），命名為siRNAIRF1，使用不針對任何序列的siRNA作為陰性轉染對照。轉染試劑采用Lipofectamine 3000轉染試劑（美國ThermoFisher公司，批號：L3000015，規格：1.5 ml）。

1.2.3 細胞分組 為探討IRF1在DEX減輕LPS誘導的HK-2損傷過程中的作用，根據不同轉染或藥物處理方案將細胞分組：轉染過表達陰性對照質粒為pcDNA3.1組、轉染IRF1過表達質粒為pcDNA3.1-IRF1組、未經任何處理的細胞為空白對照組、轉染siRNA對照同時LPS處理24 h為LPS+siRNA組、轉染IRF1 siRNA同時LPS處理24 h為LPS+siRNA-IRF1組、LPS處理同時PBS處理為LPS+PBS組、轉染過表達陰性對照質粒同時接受LPS及DEX處理24 h為LPS+DEX+pcDNA3.1組、轉染IRF1過表達質粒同時接受LPS及DEX處理24 h為LPS+DEX+pcDNA3.1-IRF1組。

1.2.4 IRF-1 mRNA水平檢測 采用實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）法，使用Trizol試劑提取各種處理后細胞的總RNA樣本，利用Hifair?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（上海翌圣生物科技股份有限公司，批號：11119ES60，規格：100次）進行反轉錄以合成cDNA。將合成的cDNA使用Hieff UNICON?Power qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒（上海翌圣生物科技股份有限公司，批號：11195ES03，規格：1 ml）進行定量擴增。所有PCR反應體系及反應條件參照試劑盒說明書。IRF1的正向引物序列為5'-ATGCCCATCACTCGGATGC-3'，反向引物序列為5'-CCCTGCTTTGTATCGGCCTG-3'。以GAPDH為內參，其正向引物為5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，反向引物為5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。使用 2-ΔΔCT法計算靶基因的相對表達量。

1.2.5 IRF-1蛋白水平檢測 采用蛋白質印跡法，使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液（上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0013B，規格：100 ml）提取細胞的總蛋白樣本。使用BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0012S，規格：200次）定量后，與上樣緩沖液混合，98℃變性10 min。將樣品等量上樣于SDS-PAGE膠，100 V恒壓電泳1 h。將蛋白轉膜至PVDF膜，轉膜條件為90 V恒壓45 min。轉膜后，使用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，然后與1∶1 000稀釋的兔抗人IRF1多克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號：8478S，規格：20 μl）室溫孵育4 h。使用1∶5 000的GAPDH一抗作為內參一抗（美國Cell Signaling Technology公司，批號：5174S，規格：20 μl）。PBST洗去一抗后，與1∶2 000辣根過氧化物酶標記的抗兔lgG二抗（美國Cell Signaling Technology公司，批號：7074S，規格：1 ml）室溫孵育2 h，ECL超敏顯色液（上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0018FS，規格：100 ml）顯影、拍照。

1.2.6 細胞活性檢測 將各組細胞種植于96孔板，密度為5 000個/孔。貼壁24 h后，進行對應的各種轉染或藥物處理，使用細胞計數試劑盒-8（cell counting Kit-8,CCK-8）細胞活性試劑（上海碧云天生物技術有限公司，批號：C0037，規格：100次）檢測細胞活性，檢測時間點為0、24、48、72 h。0 h為細胞貼壁后未處理時。檢測時棄去原有培養基，加入100 μl 1∶10稀釋的CCK-8試劑，孵育1 h后使用酶標儀（美國BioTech公司，型號：ELX808）檢測450 nm處吸光度。相對細胞活性=其他時間點吸光度/0 h吸光度，計算各組細胞活性。

1.2.7 細胞增殖檢測 將各組細胞種植于96孔板，密度為5 000個/孔。貼壁24 h后使用BeyoClick EdU-488試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：C0071s，規格：100次）進行EdU染色并拍照，EdU染色陽性細胞為增殖細胞。

1.2.8 細胞凋亡檢測 將各組細胞種植于96孔板，密度為5 000個/孔。貼壁24 h后使用RealTime-Glo Apoptosis試劑盒（北京普洛麥格生物技術有限公司，批號：JA1000，規格：100次）檢測凋亡情況。反應體系和方案按照試劑盒說明書，使用化學發光檢測儀（瑞士Tecan公司，型號：SPARK 10M）以凋亡信號值記錄各組讀數。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LPS及DEX處理后HK-2細胞的RNA測序結果LPS處理后共測出1 934個顯著上調的基因（表達倍數＞1.5，P＜0.05），463個顯著下調的基因（表達倍數＜-1.5，P＜0.05），見圖1a；按照顯著性排名前10位的mRNA見圖1b。DEX處理后的HK-2細胞共測出3 712個顯著上調的基因（表達倍數＞1.5，P＜0.05），1 179個顯著下調的基因（表達倍數＜-1.5，P＜0.05），見圖1c；按照顯著性排名前10位的mRNA見圖1d。其中IRF1在LPS處理后的細胞中上調（表達倍數=6.65，P＜0.05），在DEX處理后的細胞中下調（表達倍數=-4.18，P＜0.05），見圖1e。

圖1 LPS及DEX處理后HK-2的RNA測序結果（a：LPS處理后HK-2的mRNA表達譜；b：LPS處理后變化顯著性排名前10位的mRNA；c：DEX處理后HK-2的mRNA表達譜；d：DEX處理后變化顯著性排名前10位的mRNA；e：LPS及DEX處理后的共同差異表達基因為IRF1）

2.2 LPS及DEX處理后HK-2細胞IRF1 mRNA表達水平比較 LPS處理后的IRF1 mRNA水平為2.69±0.33，高于對照組的1.00±0.12（P＜0.05），而DEX處理后的IRF1 mRNA水平為0.51±0.09，低于對照組的1.00±0.11（P＜0.05）。蛋白質印跡法檢測結果顯示，LPS促進IRF1的蛋白表達，而DEX抑制IRF1的蛋白表達，見圖2。

圖2 LPS及DEX處理后HK-2的IRF1 mRNA表達水平比較（a：LPS處理后IRF1 mRNA水平與對照組比較；b：DEX處理后IRF1 mRNA水平與對照組比較；c：LPS及DEX處理后IRF1蛋白表達電泳圖）

2.3 HK-2轉染過表達質粒及siRNA后IRF1 mRNA水平及蛋白水平比較 轉染IRF1過表達質粒后，HK-2細胞IRF1 mRNA水平由1.00±0.12升高至22.00±3.61（P＜0.05）。轉染IRF1的siRNA后，細胞內IRF1 mRNA水平由1.00±0.14降低至0.12±0.02（P＜0.05）。轉染IRF1過表達質粒后，IRF1的蛋白水平升高，轉染IRF1的siRNA后，IRF1的蛋白水平降低，見圖3。

圖3 HK-2轉染過表達質粒及siRNA后IRF1 mRNA水平及蛋白水平比較（a：HK-2轉染過表達質粒后IRF1 mRNA水平；b：HK-2轉染siRNA后IRF1 mRNA水平；c：轉染后IRF1蛋白表達電泳圖；與陰性轉染對照組比較，*P＜0.05）

2.4 改變IRF1水平后HK-2細胞活性、增殖及凋亡指標的比較 與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-IRF1組72 h細胞活性降低（2.10±0.02比 1.56±0.16，P＜0.05），見圖4a。EdU染色顯示，pcDNA3.1-IRF1組24 h細胞增殖減少，見圖4b。pcDNA3.1-IRF1組24 h的凋亡信號值為62 183.26±7 585.39，高于pcDNA3.1組的20 523±2 051（P＜0.05），見圖4c。LPS+siRNA組72 h細胞活性為0.65±0.08，低于空白對照組的1.91±0.21（P＜0.05），LPS+siRNA-IRF1組 72 h細胞活性為1.23±0.13，高于LPS+siRNA組（P＜0.05），見圖4d。Edu染色顯示，LPS+siRNA組24 h的細胞增殖減少，LPS+siRNA-IRF1細胞增殖高于LPS+siRNA組，見圖4e。LPS+siRNA組24 h的細胞凋亡信號值為85 233.59±7 952.23，高于空白對照組的32 100.02±4 253.63（P＜0.05），LPS+siRNA-IRF1組的24 h細胞凋亡信號值（62 187.24±8 742.68）低于LPS+siRNA組（P＜0.05），見圖4f。

圖4 改變IRF1水平后HK-2細胞增殖及凋亡指標的比較（a：IRF1過表達后不同時間點細胞活性比較；b：IRF1過表達后細胞增殖比較的EdU染色熒光圖；c：IRF1過表達后細胞凋亡比較；d：LPS及IRF1敲減后的細胞活性比較；e：LPS及IRF1敲減后細胞增殖比較的EdU染色熒光圖；f：LPS及IRF1敲減后細胞凋亡的比較；與對照組比較，*P＜0.05；與陰性轉染對照組比較，△P＜0.05）

2.5 DEX及LPS處理后HK-2細胞活性、增殖及凋亡指標的比較 空白對照組72 h細胞活性為2.53±0.23，LPS+PBS組為0.87±0.12；LPS+DEX+pcDNA3.1組72 h細胞活性為1.78±0.20，高于LPS+PBS組（P＜0.05）；LPS+DEX+pcDNA3.1-IRF1組72 h細胞活性為1.22±0.12，低于LPS+DEX+pcDNA3.1組（P＜0.05），見圖5a。EdU染色結果顯示，LPS+PBS組細胞增殖受到抑制，而LPS+DEX+pcDNA3.1組增殖得以部分恢復，LPS+DEX+pcDNA3.1-IRF1組增殖再次被抑制，見圖5b?？瞻讓φ战M24 h細胞凋亡信號值為29 000.68±3 212.55，LPS+PBS組24h細胞凋亡信號值為98 521.00±456.8.73；LPS+DEX+pcDNA3.1組24h細胞凋亡信號值為55254.64±6 211.53，低于LPS+PBS組（P＜0.05）；LPS+DEX+pcDNA3.1-IRF1組24 h細胞凋亡信號值為74 524.63±8 563.66，高于LPS+DEX+pcDNA3.1組（P＜0.05），見圖5c。

圖5 DEX及LPS處理后HK-2細胞增殖及凋亡指標的比較（a：LPS處理條件下，DEX及IRF1過表達后不同時間點細胞活性比較；b：LPS處理條件下，DEX及IRF1過表達后細胞增殖的EdU染色熒光圖；c：LPS處理條件下，DEX及IRF1過表達后細胞凋亡比較；與對照組比較，*P＜0.05；與PBS對照組比較，△P＜0.05；與pcDNA3.1空質粒相比較，▲P＜0.05）

3 討論

目前對于膿毒癥AKI的防治提倡“提高預防意識”“提高整體觀念”“動態評估”及“早期干預”[6]。腎小管上皮細胞是腎臟結構和功能的基礎，探討膿毒癥過程中腎小管上皮細胞損傷的分子機制對膿毒癥AKI的防治具有較大的臨床應用價值[7]。越來越多的證據表明，DEX具有應用于膿毒癥器官保護的潛力[8]，但在實現其在膿毒癥AKI治療的臨床應用之前，需要揭示DEX減輕膿毒癥引起的腎小管上皮細胞損傷的機制。本研究圍繞上述科學問題進行了研究，結果發現DEX通過介導IRF1的表達變化減輕膿毒癥過程中LPS對腎小管上皮細胞的損傷。

IRF1編碼的蛋白質是一種轉錄調節因子，參與先天性和獲得性免疫應答的基因激活；同時參與機體對病毒和細菌反應的基因轉錄，在細胞增殖、凋亡、免疫反應和DNA損傷反應中發揮作用[9]。近期的證據提示過高的IRF1參與LPS引起的細胞損傷。比如Yan等[10]發現IRF1調控LPS誘導的血管細胞粘附分子-1表達，引起內皮細胞的損傷；Yokota等[11]的研究發現IRF1通過產生IL-15/IL-15Rα促進肝移植后肝細胞的缺血/再灌注損傷。Deng等[12]的研究提出IRF1的過度激活參與LPS誘導的巨噬細胞線粒體損傷和氧化應激反應。還有研究發現，胡椒堿可以降低巨噬細胞中的IRF1水平，從而降低LPS造成的損傷[13]；本研究發現IRF1的過表達可以抑制細胞增殖，誘導凋亡，提示過高的IRF1可以引起細胞損傷。敲減IRF1后，LPS引起的腎小管上皮細胞損傷得以減輕。因此，本研究認為LPS可能通過上調IRF1來發揮腎小管上皮細胞損傷功能。

DEX對呼吸功能無抑制作用，并能保持患者的易喚醒狀態，除鎮痛、鎮靜外，還能抗焦慮、穩定循環等作用。如能將該藥用于膿毒癥器官保護，勢必能擴大其臨床價值。DEX對膿毒癥器官保護的作用已經在心臟、肝臟等器官中得到了證實[14-15]。DEX對膿毒癥條件下腎臟的保護作用機制主要包括DEX能夠減輕炎癥反應，減輕氧化應激、抑制細胞凋亡以及促進細胞自噬。如Zhao等[16]發現DEX通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路增強自噬抑制LPS介導的AKI。Feng等[5]的團隊指出DEX通過GSK-3β/Nrf2信號通路抑制炎癥和氧化應激，改善LPS誘導的大鼠AKI。Yang等[17]基于患者的研究發現DEX灌注保護了膿毒癥休克患者的腎功能。這些研究多關注腎功能整體水平，較少有研究基于腎小管上皮細胞這個層面。本研究利用體外細胞模型發現DEX抑制IRF1水平，而過表達IRF1抵消了DEX的保護功能。所以DEX可以通過抑制IRF1的水平發揮對腎小管上皮細胞的保護作用。盡管本研究發現IRF1在DEX及LPS處理后腎小管上皮細胞中存在表達變化，并初步分析了IRF1扮演的功能角色，證實了IRF1介導了DEX的腎小管上皮細胞保護作用，但是本研究未能揭示IRF1發揮作用的分子機制，有待未來進一步研究。

綜上所述，LPS誘導的腎臟上皮細胞損傷過程中存在IRF1的表達上調，IRF1對腎小管上皮細胞增殖和凋亡具有調控作用。DEX處理可以降低小管上皮細胞中的IRF1表達，其可通過抑制IRF1減輕膿毒癥誘導腎小管上皮細胞損傷的作用。本研究對DEX的器官保護作用做出了分子機制上的解釋，對DEX應用于膿毒癥導致的器官損傷的防治提供了依據。