鐵皮石斛葉干粉對蛋雞盲腸菌群、短鏈脂肪酸、免疫性能和腸道屏障功能的影響

張浩馨，汪 涵,2，金航峰,2，何 珂,2，顏菲菲,2*，趙阿勇,2*

（1.浙江農林大學動物科技學院·動物醫學院，浙江杭州 311300；2.浙江農林大學動物福利研究所，浙江杭州 311300）

動物腸道中存在一個數量龐大的菌群生態系統，腸道里的菌群和宿主動物相互作用，與宿主自身的營養物質的消化、代謝以及免疫功能密切相關[1-2]。腸道菌群與宿主的動態平衡對動物機體生命活動保持正常運轉有著重要意義[3]，一旦這種平衡被打破，條件性腸道致病菌會趁虛而入，從而引起一系列腸道疾病。腸道微生物失調不僅會造成腸道疾病，還會造成免疫性和感染性疾病的發生[4]。鐵皮石斛葉是草本中藥鐵皮石斛的副產物，與鐵皮石斛莖類似，鐵皮石斛葉主要由多糖、黃酮、生物堿等成分構成[5]，其多糖含量約為莖的三分之一[6]，黃酮含量高于莖[7]。研究表明，鐵皮石斛多糖可抑制豚鼠的腸管抑制，并可抑制小鼠的胃腸推進作用[8]，對大腸桿菌有抑制作用[9]，還能調節免疫活性[10]，促進腸道健康[11]。本團隊前期研究表明，鐵皮石斛葉可以降低蛋雞采食量，降低蛋破損率并且可以提高雞蛋蛋黃顏色、蛋黃比例等蛋品質指標（未發表）。本試驗旨在研究鐵皮石斛葉對蛋雞盲腸微生物多樣性、盲腸內容物短鏈脂肪酸含量的影響以及對腸道健康的影響，為鐵皮石斛葉在蛋雞生產中的應用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗動物為“京紅1 號”商品蛋雞。鐵皮石斛葉采摘于杭州震亨生物科技有限公司，用60℃烘箱烘干，再由破壁機打成細粉。

1.2 試驗設計 采用單因素試驗設計，選擇19 周齡，體重相近約為1 kg、采食量正常的京紅1 號蛋雞240 只，隨機分為3 組，每組10 個重復，每個重復8 只雞。對照組飼喂基礎日糧，試驗組在基礎日糧中分別添加鐵皮石斛葉干粉1 200、3 600 mg/kg。日糧中其他營養指標均滿足《雞飼養標準》（NY/T 33-2004）要求。粉料飼喂，自由飲水。試驗中使用的基礎日糧由杭州市愛咯禽業有限公司提供，日糧組成和營養成分見表1。

表1 基礎日糧組成和營養成分

1.3 盲腸內容物樣品采集 于蛋雞273 日齡，每組隨機選8 只蛋雞進行頸椎脫臼處死，剖開腹腔取出十二指腸腸段和盲腸內容物，腸組織用生理鹽水沖洗后置于2 mL凍存管中，于-80℃保存備用。

1.4 揮發性脂肪酸的測定 用萬分之一天平準確稱取0.5 g 盲腸內容物樣品放入離心管，加入1.5 mL 超純水，漩渦振蕩3～5 min 使盲腸內容物充分溶解，然后放入離心機中，10 000 r/min 離心10 min 使固液相分離，取上清液1 mL 于2 mL 離心管中，加入0.2 mL 25%偏磷酸溶液（上清液:偏磷酸=5:1），充分混勻后冰浴30 min，再以10 000 r/min 離心10 min，用0.22 μm 濾膜過濾到氣相小瓶待測。

分別取乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸（購自Sigma 公司，色譜純）1 000、400、100、200、100、100 μL，用萬分之一天平稱重，記錄各組分重量，用超純水定容至100 mL，配成儲備溶液，于4℃避光保存待測。參照耿梅梅[12]的方法將標樣儲備液梯度稀釋至相應濃度。采用氣相色譜（島津新氣相色譜儀系統GC2010）測定乙酸、丙酸和丁酸濃度，進樣量為2μL，色譜柱為HP-INNOWAX（19091N-133）毛細管柱（30m×0.25 mm×0.25 μm），注射器/ 檢測器的溫度為220℃，柱溫采用程序升溫，80℃持續1 min 后，以15℃/min 升溫至170℃后維持1.5 min，載氣為高純氮。

1.5 16S rRNA 基因測序 將采集到的盲腸內容物樣本送到上海美吉生物生物醫藥科技有限公司進行總DNA的提取。針對16SV3-V4 區進行Miseq 擴增子測序；測序數據經拼接、質控、去接頭之后獲得優化序列，基于優化序列進行OTU 聚類，獲得OTU 豐度表，用于后續生信分析。選擇3 個組，使用Venn 圖分析它們在獨有和共有的OUT 數目；計算Alpha 多樣性指數Shannon、Ace、observedOTUs（Sobs）、Chao1 和Coverage，并進行指數組間差異分析；對于Beta 多樣性分析使用PCoA 進行結果可視化展示；用Wilcoxon秩和檢驗分析各菌的占比，得出差異菌。

1.6 腸道炎癥和屏障基因表達量的測定 使用Trlzol 法提取十二指腸腸段的總RNA，通過ABM 反轉錄試劑盒中說明書的方法對十二指腸腸段RNA 進行反轉錄，得到cDNA。在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上找到雞的部分炎癥基因和腸道屏障功能相關基因的序列，通過Primer Premier 5 設計出相對應的引物，再通過TaKaRa 實時熒光定量試劑盒（RR420-A）對相關基因的表達量進行測定。引物序列見表2。

表2 引物序列

1.7 統計分析α多樣性和揮發性脂肪酸數據用Excel整理，用SPSS 25 軟件中ANOVA 進行單因素方差分析，并用Duncan's 法進行多重比較，P＜0.05 表示差異顯著，結果表示為平均值±標準誤。

1.8 圖表制作 圖由美吉生物云平臺網站制作（http://www.majorbio.com/）圖中CON 為對照組，DO_H 為3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組，DO_L 為1 200 mg/kg 鐵皮石斛葉組。各基因表達量試通過GraphPad Prism 制作柱狀圖。

2 結果

2.1 鐵皮石斛葉對蛋雞免疫性能的而影響 由表3 可知，3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組脾臟指數、血清總蛋白、血清球蛋白和血清IgG 含量顯著高于對照組，3 組間血清白蛋白、血清IgA 含量和血清IgM 含量無顯著差異。

表3 鐵皮石斛葉對蛋雞免疫性能的影響

2.2 組內特有及組間共有OUT 分析 由圖1 可知，3 個處理組共有的OUT 數目為934 個，對照組獨有的OUT數目為39 個，3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組獨有的OUT數目為30 個，1 200 mg/kg 鐵皮石斛葉組獨有的OUT數目為27 個。

圖1 Venn 圖

2.3α-多樣性分析 由表4 可知，鐵皮石斛葉對蛋雞盲腸菌群OTU、Shannon、Simpson、ACE 和Chao1 均無顯著數影響，1 200 mg/kg 和3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組的覆蓋率相較于對照組顯著提高。

表4 鐵皮石斛葉對蛋雞盲腸內容物菌群α-多樣性的影響

2.4 盲腸微生物結構分析

2.4.1β多樣性分析β多樣性分析主要是用來評判不同樣本間菌群菌落結構的相似性，PCoA 分析能夠反映出各個樣本之間的差異大小，樣本間距離越小，代表了樣本間菌群結構越相似。由圖2 可知，本試驗中，對照組和3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組明顯分離，說明3 組間菌群結構存在差異性。

圖2 PCoA 分析

2.4.2 盲腸菌群結構 各組盲腸內容物樣品中微生物的組成情況相近，但各種微生物所占比例有所差別，在門水平上占優勢的分別為擬桿菌門（Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）、脫硫菌門（Desulfobacterota）、放線菌門（Actinobacteriota），圖3 展示了豐度大于0.1%的門水平上的菌群。在屬水平上占優的分別為擬桿菌屬（Bacteroides）、理研菌屬（Rikenellaceae）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、乳桿菌屬（Lactobacillus），圖4 展示了豐度大于1%的屬水平上的菌群。

圖3 盲腸菌群門水平組成和分布

圖4 盲腸菌群屬水平組成和分布

2.4.3 盲腸微生物門和屬水平的差異菌 由圖5 可知，3 600 mg/kg 和1 200 mg/kg 鐵皮石斛葉組脫硫菌門（Desulfobacterota）相對豐度極顯著低于對照組。由圖6 可知，3 600 mg/kg 和1 200 mg/kg 鐵皮石斛葉組的脫硫菌屬（Desulfovibrio）相對豐度極顯著低于對照組（圖6-A），3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組的梅爾海拉菌屬（Mailhella）相對豐度顯著低于對照組（圖6-B），3 600 mg/kg 和1 200 mg/kg鐵皮石斛葉組的α-變 形菌屬（Alphaproteobacteria）相對豐度極顯著低于對照組（圖6-C），3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組的擬桿菌屬（Bacteroidales）相對豐度顯著高于對照組（圖6-D）。

圖5 各組脫硫菌門（Desulfobacterota）相對豐度的差異

圖6 屬水平上部分差異菌的各組相對豐度

2.6 鐵皮石斛葉對盲腸內容物中揮發性脂肪酸的影響由表5 可知，鐵皮石斛葉干粉對蛋雞盲腸內容物中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸含量沒有顯著影響。

表5 鐵皮石斛葉對蛋雞盲腸內容物中揮發性脂肪酸含量的影響 ng/μL

2.7 鐵皮石斛葉對蛋雞腸道緊密連接蛋白及部分炎癥細胞因子mRNA 表達量的影響 由圖7 可知，3 600 mg/kg鐵皮石斛葉組十二指腸Occludin、Cadherin、Claudin-1、Claudin-3、Claudin-5、ZO-1、ZO-2、ZO-3基因的mRNA表達量較對照組顯著上調，1 200 mg/kg 鐵皮石斛葉組十二指腸Occludin、Claudin-3、ZO-3基因的mRNA 表達量較對照組顯著上調。

圖7 鐵皮石斛葉對蛋雞腸道緊密連接蛋白mRNA 表達量的影響

由圖8 可知，3 600 mg/kg 和1 200 mg/kg 鐵皮石斛葉組十二指腸IL-1β、IL-2α、TLR2、IFN-γ、TGF-β3、TNF-α基因的mRNA 表達量較對照組顯著下調。鐵皮石斛葉對蛋雞十二指腸IL-6和IL-10基因表達量無顯著影響。

圖8 鐵皮石斛葉對蛋雞腸道炎癥細胞因子mRNA 表達量的影響

3 討 論

3.1 鐵皮石斛葉對蛋雞免疫性能的影響 機體的免疫器官指數是判定機體免疫功能水平的初步指標，免疫器官的發育狀況可以直接反映出機體的免疫應答水平[13]。宋美芳[14]研究表明，鐵皮石斛提取物可以提高小鼠的脾臟指數。本試驗中3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組脾臟指數也極顯著高于其他2 組。鐵皮石斛葉中起到免疫作用的主要成分是石斛多糖，它能夠刺激脾臟淋巴細胞增殖[15]，從而提高機體的脾臟指數。本試驗中高劑量鐵皮石斛組臟器指數顯著升高說明鐵皮石斛葉可以在一定程度上改善蛋雞的免疫性能。血清總蛋白和球蛋白也能夠反映機體的免疫能力[16]；IgA、IgG 和IgM 由主要由B 淋巴細胞分泌，對機體體液免疫有十分重要的作用，因此免疫球蛋白水平也是判斷機體免疫功能的重要指標。本試驗中，3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組脾臟指數、血清總蛋白、血清球蛋白和血清IgG 含量顯著高于對照組，說明3 600 mg/kg 劑量的鐵皮石斛葉可以改善蛋雞的免疫功能。

3.2 鐵皮石斛葉對蛋雞腸道菌群多樣性的影響α多樣性中OTU、Chao1 和ACE 指數是計算菌群豐度，Shannon和Simpson 指數是用來計算菌群多樣性，Coverage 指數是指各樣品文庫的覆蓋率，其數值越高，則樣本中序列沒有被測出的概率越低[17]。本試驗中，3 600 mg/kg和1 200 mg/kg 鐵皮石斛葉組的Coverage 指數顯著高于對照組，但3 組Coverage 指數都接近于1，說明本次測序代表了樣品中微生物的真實情況，而3 組間菌群豐度和多樣性無顯著差異。β多樣性結果顯示3 600 mg/kg鐵皮石斛葉組與對照組菌群組成相似度較低，說明蛋雞日糧中添加鐵皮石斛可以改善盲腸菌群結構。

3.3 鐵皮石斛葉對蛋雞腸道菌群組成的影響 在門和屬水平上，3 600、1 200 mg/kg 鐵皮石斛葉組的脫硫菌相對豐度極顯著低于對照組。有研究表明，脫硫弧菌（Desulfovibrio）會分解腸道中的短鏈脂肪酸[18-19]，使機體炎性因子水平升高。另外，脫硫弧菌還原硫酸鹽產生的硫化氫[20]會破壞腸道上皮細胞從而破壞腸道屏障功能[21]。本研究中，3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組梅爾海拉菌屬（Mailhella）相對豐度顯著低于對照組。梅爾海拉菌屬在羅曼蛋雞腸道里會生產丁酸、硫化氫，從而破壞腸道屏障，導致多種疾病，對蛋雞造成損害[22]。3 600 mg/kg 和1 200 mg/kg鐵皮石斛葉組α-變形菌屬（Alphaproteobacteria）相對豐度極顯著低于對照組，α-變形菌是常見的條件致病菌[23]，說明鐵皮石斛葉能夠抑制蛋雞盲腸內條件致病菌α-變形菌的生長。3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組擬桿菌屬（Bacteroidales）相對豐度顯著高于對照組，擬桿菌能抑制一些有害菌群的黏附與侵襲，能迅速恢復宿主失衡的內部微生態系統，維持平衡并改善宿主免疫力[24]，其成分多糖A 可抑制人原代胎兒小腸細胞IL-1β誘導的炎癥，減少腸道炎癥[25]。

3.4 鐵皮石斛葉對蛋雞盲腸揮發性脂肪酸含量的影響 揮發性脂肪酸是腸道微生物代謝的主要產物，作為微生物與宿主之間的主要調節器，影響著腸道內的穩態和防護病原體入侵宿主[26]。但是揮發性脂肪酸具有刺激性氣味，在養殖舍內濃度過高會引起動物食欲減退、免疫力下降、引發呼吸道疾病，嚴重的會導致肺水腫和充血[27]。本試驗中各組的揮發性脂肪酸含量沒有差異，說明鐵皮石斛葉對蛋雞盲腸中揮發性脂肪酸含量沒有顯著影響。

3.5 鐵皮石斛葉對蛋雞腸道緊密連接蛋白及部分炎癥細胞因子mRNA 表達量的影響 腸道上皮細胞是構成腸道屏障的基礎結構，也是腸道與機體內環境之間的物理屏障。腸上皮細胞之間不是密閉的，而是存在著間隙，間隙間被ZO、Claudins、Occludin、Tricellulin 4 類跨膜蛋白共同組成的緊密連接填充，構成了防止腸道內細菌和毒素發生轉移的重要屏障[28]。Cadherin蛋白是一種CDH1基因編碼的跨膜糖蛋白，在維持細胞黏附中起著至關重要的作用。Cadherin缺失可導致腸上皮細胞功能障礙[29]。本試驗中，3 600 mg/kg 和1 200 mg/kg 鐵皮石斛葉組十二指腸部分緊密連接蛋白的mRNA 表達量較對照組顯著上調，說明日糧中添加鐵皮石斛葉對蛋雞腸道屏障功能起了一定保護作用。

腸道功能和通透性受到多種細胞因子影響，這些炎性介質可能會通過腸道屏障進入機體內環境從而進入血液，然后破壞腸道上皮細胞和腸道的完整性和功能[30]。本試驗中3 600 mg/kg 和1 200 mg/kg 鐵皮石斛葉組十二指腸IL-1β、TGF-β3和IFN-γ基因的mRNA 表達量顯著下調。IL-1β是經典炎癥因子，在腸道炎癥中，IL-1β能夠通過激活CD4+細胞增加促炎因子IFN-γ分泌，從而加重腸道炎癥[31]。本試驗中，鐵皮石斛葉組十二指腸緊密連接蛋白mRNA 表達量較對照組上調，腸道通透性小，腸道內IL-β和受其調控的促炎因子TGF-β3 進入內環境的可能性變小，機體患上心臟衰竭的可能性變大[32]。另外有研究表明，IFN-γ能與TNF-a發生協同作用，通過刺激基質金屬蛋白酶表達誘導一氧化氮的合成，從而對機體腸道黏膜產生損害[33]。TLR2作為TOLL 樣受體家族的重要成員，能夠識別病原體表面糖蛋白，誘導免疫系統將其清除，同時一些病原體會帶有大量內毒素，通過促進TLR2 蛋白進一步激活巨噬細胞，進而分泌大量促炎因子，最終產生炎癥反應[34]。本試驗中，試驗組上述提及的炎癥因子的mRNA 表達量較對照組顯著下調，證明日糧中添加鐵皮石斛葉可以降低蛋雞十二指腸腸道炎癥。

本試驗中，日糧中添加鐵皮石斛葉的蛋雞十二指腸腸段腸道屏障相關基因表達量較對照組上調，腸道炎癥相關基因表達量下調，且以3 600 mg/kg 較好，主要原因是因為3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉可以有效減少盲腸菌群中脫硫弧菌（Desulfovibrio）和梅爾海拉菌屬（Mailhella）這2 種產硫菌的豐度，減少腸道炎癥，保護腸道屏障功能。

4 結 論

本試驗條件下，在日糧中添加鐵皮石斛葉干粉能提高蛋雞免疫功能，增加盲腸菌群β多樣性，降低產硫菌和條件致病菌α-變形菌的豐度，并促進腸道屏障功能，降低腸道炎癥，以添加量為3 600 mg/kg 為宜。