Luciference 標記胰島及在體外和裸鼠體內的熒光表達研究

夏楚睿，壽辰菲，金明，葉澤嵐，宋益康，章余旋，傅紅興

（1.浙江樹人學院樹蘭國際醫學院，浙江 杭州 312028；2.浙江大學醫學院附屬第二醫院，浙江 杭州310000）

胰島移植是目前臨床上唯一微創并能實現血糖精確調控的外科治療手段，隨著近幾年胰島移植臨床治療方案和標準的純化人胰島生產方法的公布［1-6］，國內外已有越來越多的醫療機構正在開展或準備開展該項手術。但胰島移植依然存在體內移植的胰島追蹤、存活評價困難等問題［7-8］，成為該技術研究和推廣應用的一個障礙。

活體生物體內光學成像技術在近20 年里發展迅速［9-10］。其中熒光素酶（Luciference，LUC）基因可整合到細胞染色體DNA 上，表達的偏紅外熒光在體內穿透性強，無需激發光，使用底物熒光素（D-Luciferin）即可在小動物活體光學成像系統中觀察標記的細胞或蛋白在體內的存活和運行軌跡，在腫瘤、干細胞和蛋白因子的表達、測定研究中應用廣泛［11-12］。本研究采用慢病毒載體將熒光素酶基因導入分離后的胰島中，并移植至裸鼠腎被膜下，在成像系統中定期觀察LUC 基因轉染后胰島在體外和體內的熒光表達，為胰島的LUC 標記和體內移植后的跟蹤研究提供方法參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：ICR 小鼠、Balb/c-nu 裸鼠（雄性，SPF 級，6 ～ 8 周，杭州醫學院實驗動物中心）。

1.1.2 實驗試劑和器材：慢病毒Luciference 基因質粒（HBLV-LUC-PURO）、慢病毒ZsGreen 基因質粒（HBLV-ZsGreen-PURO）、溴化己二甲銨（Polybrene）〔漢恒生物科技（上海）有限公司〕；D-熒光素鉀鹽（D-Luciferin，貨號：MB1834，大連美侖生物技術有限公司）；胎牛血清（Gibco，Thermo Fisher Scientific，美國）；Ficoll-1077、Ficoll-1119、FDAPI 雙染細胞活力檢測試劑盒、CMRL-1066（溫州市怡康細胞移植技術開發有限公司）；全自動活細胞成像系統（EVOS M7000，Invitrogen，美國）；IVIS Lumina LT 小動物活體光學成像系統（Series Ⅲ，PerkinElmer，美國）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠胰島的分離和培養：參考前期工作基礎［13-14］，簡述如下：取ICR 小鼠，頸椎脫臼法處死，U 型切口剪開腹部肌肉層；夾閉膽總管入十二指腸口；逆行膽總管灌注V 型膠原酶溶液2.5 ml，膨脹的胰腺放入含2 ml 同濃度V 型膠原酶的15 ml 離心管中，在（37.0±0.5）℃恒溫水浴中振搖消化呈乳糜狀，用Ficoll-1077、Ficoll-1119 進行密度梯度純化，得到高純度的小鼠胰島，用CMRL 1066 胰島培養液（含10%胎牛血清和青鏈霉素）在37℃、5% CO2培養箱中培養6 ～ 8 h 后進行后續實驗。

1.2.2 慢病毒LUC 基因轉染胰島

1.2.2.1 慢病毒-LUC 胰島培養液的配制：基于前期慢病毒ZsGreen 基因轉染胰島預實驗，本實驗選擇慢病毒的感染復數為10 MOI。慢病毒-LUC 胰島培養液的配制方法：取病毒-LUC 原液（病毒滴度：108TU/ml）10 μl，加入CMRL 1066 胰島培養液990 μl，混勻后得到含10 MOI 病毒-LUC 基因質粒的胰島培養液1 ml。

1.2.2.2 胰島經慢病毒LUC 基因轉染：將需轉染的胰島細胞團（約200 IEQ）放置于24 孔板中，盡量去除胰島培養液；快速加入1 ml 10 MOI 的慢病毒-LUC 胰島培養液，放于37℃、5%CO2培養箱中分散后培養24 h。將轉染慢病毒后的胰島取出后至新的12 孔板中，用胰島培養液洗滌1 遍后加入2 ml新鮮的CMRL 1066 胰島培養液，37℃、5%CO2培養24 h 后進行后續的實驗。

1.2.3 LUC 基因轉染后胰島的體外發光檢測：取不同當量的上述轉染LUC 基因的小鼠胰島（約100、200、250 IEQ，各3 份），加入50 μl 底物D-Luciferin溶液（取D-Luciferin 原料，用無菌水配制成15 mg/ml 的熒光素溶液），在小動物活體光學成像系統中測定胰島在體外的LUC 熒光表達，作為培養后第0 日熒光表達；取測定熒光后的小鼠胰島（約100 IEQ），用胰島培養液洗滌1 遍后，放置在新的12 孔板中，加入2 ml 胰島培養液繼續37℃、5%CO2培養；在培養1、7、14 d 進行相同的活體光學成像系統觀察，得到LUC 標記胰島在體外培養不同時間的熒光表達變化。

1.2.4 腎被膜下胰島移植：將培養第0 天后約200 IEQ 轉染慢病毒LUC 基因的胰島移植至正常裸鼠的腎被膜下。方法簡述如下［14］：異氟烷吸入麻醉正常Balb/c-nu 裸鼠，用眼科剪在右腎背側皮膚和肌肉上開1 cm 小口暴露右腎。用針在腎被膜上刺一小口，并使用自制的移植工具將胰島移植到腎背膜下?？p合切口并用聚維酮碘消毒，皮下注射1 ml 生理鹽水補液。術后小鼠每日皮下注射100 μl 頭孢唑啉鈉預防感染，持續1 周。

1.2.5 LUC 基因轉染后胰島的體內發光檢測：取胰島移植后的裸鼠，異氟烷吸入麻醉后，腹腔注射100 μl 底物D-Luciferin 溶液，5 min 后在小動物活體光學成像系統中測定LUC 標記胰島在體內的熒光表達。對同一小鼠在胰島移植術后的同一位置，術后第0、1、3、5、7、14、21、30 日監測1 次熒光表達，以未轉染慢病毒LUC 基因的胰島移植為對照組進行相同的觀察。

1.2.6 胰島活性：使用FDA-PI 雙染細胞活力檢測試劑盒評估胰島的活性。方法：取25 個經慢病毒基因轉染后的胰島細胞團（約0.5 ml），加入10 μl PI 和10 μl FDA 溶 液 后，室 溫 下 避 光 孵育30 s，使用EVOS M 7000 細胞成像系統，在藍色激發光下發綠色熒光的為活細胞；在綠色激發光下發紅色熒光的為死細胞。用發綠色熒光的組織面積占胰島總面積的百分比進行胰島活性的評估。

1.2.7 統計學分析：數據采用SPSS 17.0 統計學軟件進行處理，所有數據用均數±標準差（±s）表示，并采用成對樣品t 檢驗進行統計學分析。

2 結 果

2.1 小鼠胰島的分離、培養及LUC 標記后胰島的活性結果：1 只ICR 小鼠可分離得到（166±47）個胰島，當量為（183.6±36.5） IEQ；胰島形態圓整，經雙硫腙（dithizone，DTZ）染色后，純度＞90%。經培養6 ～ 8 h 后的胰島經熒光素雙醋酸酯-碘化丙啶（fluorescein diacetate-propidium iodide，FDA-PI）染色后，活性達（93.6±3.1）%。胰島經慢病毒LUC 轉染24 h和再培養24 h 后，可見LUC 標記后的胰島外形圓整（圖1A），經FDA-PI 染色后大部分體積呈綠色，胰島活性為（86.7±6.7）%（圖1B）。

圖1 LUC 標記后小鼠胰島的形態和活性

2.2 LUC 標記胰島在體外隨時間的熒光表達結果：不同當量上述LUC 標記的胰島培養第0 天，在小動物活體光學成像系統中測定的胰島LUC 熒光的表達結果如下圖2A（白色箭頭）、2B 所示；取約100 IEQ LUC 標記胰島，在培養第0、1、7、14 日的LUC 熒光表達結果如下圖2C 所示。

體外培養的LUC 標記胰島在小動物活體成像儀中可見熒光表達（圖2A 中白色箭頭所示），且熒光表達量與胰島當量有關（圖2B）；LUC 標記胰島在體外培養2 周內的熒光表達強度呈現逐漸增強趨勢（圖2C）。

圖2 LUC 標記胰島在不同胰島當量、培養時間的熒光表達結果（n=3）

2.3 LUC 標記胰島移植至裸鼠體內后隨時間的熒光表達結果：培養第0 天的LUC 標記胰島移植至裸鼠腎被膜下后，在小動物活體光學成像系統中的成像結果如下圖3A 所示。移植術后第0、1、3、5、7、14、21、30 日的體內LUC 熒光表達結果如下圖3B所示。

在小動物活體成像儀中，裸鼠腎被膜下移植的LUC 標記胰島可見熒光表達（圖3A 中白色箭頭所示），并可實現在活體狀態下長期觀察（＞30 d）；但熒光表達的強度隨時間變化有較大差異（圖3B）。對照組移植未轉染LUC 基因的胰島的裸鼠，在活體成像儀中無熒光表達。

圖3 LUC 標記胰島移植至裸鼠體內后隨時間的熒光表達結果

3 討 論

關于LUC 標記胰島的研究有經腺病毒載體轉染分離后的胰島［15］和轉染胰島素Ⅰ啟動子控制的LUC 基因至小鼠［16］等，但存在LUC 表達時間短，模型構建難度大等問題。本研究中LUC 基因經慢病毒穩轉，可實現LUC 的長期表達，轉染方法簡便。

LUC 標記的胰島在體外培養2 周內，隨培養時間的延長熒光強度表達增強，說明胰島細胞內LUC的表達隨時間逐漸增加。LUC 標記胰島在體內移植后的熒光表達的差異較大，且不像體外胰島LUC 的表達逐漸增加，這可能與體內腎被膜下環境復雜，胰島細胞團內表達LUC 的細胞在腎被膜下移植后有部分死亡，存活的表達LUC 細胞數量差異較大有關；且在活體成像儀下測定時裸鼠的體位、測定時間對熒光強度的結果也具有一定的影響。為提高慢病毒對細胞的感染效率，慢病毒基因轉染中常加入Polybrene；但在本實驗中慢病毒-LUC 胰島培養液中添加Polybrene 后，標記的胰島細胞病死率大大增加，因此后續LUC 轉染胰島實驗中未加該成分。本研究LUC 標記的胰島移植至裸鼠體內后，可實現在活體狀態下長期觀察體內胰島的存活情況，為后續研究胰島在移植部位的存活和功效研究提供一定的參考。