應激致功能性下丘腦性閉經動物模型研究進展

萬坤銘，孫 帥，俞超芹

(上海長海醫院中醫婦科，上海 200433)

功能性下丘腦性閉經(functional hypothalamic amenorrhea,FHA)是除外下丘腦、垂體等器質性病變，由于循環中促性腺激素和雌激素水平均低而導致的一種好發于年輕女性的中樞性閉經。FHA是現代女性常見的閉經原因之一，據估計，在所有繼發性閉經中FHA占15%～48%[1]。FHA對女性健康包括生殖系統、心血管系統、骨骼和心理狀態等造成威脅。FHA的基本特點是下丘腦-垂體-卵巢(hypothalamic-pituitary-ovarian,HPO)軸的抑制。正常的生理情況下，下丘腦通過脈沖式分泌促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)促進垂體前葉分泌卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)和黃體生成素(luteinzing hormone，LH)，FSH的主要功能是刺激卵巢生長及卵泡發育；LH的功能是促進卵泡最后成熟，觸發排卵，促進黃體形成維持其功能；兩者相互配合促進卵巢合成分泌3種性激素，即雌激素、孕激素、雄激素，而雌激素、孕激素對下丘腦和垂體又有反饋調節作用[2]。FHA由于GnRH脈沖式分泌不足，導致FSH、LH水平降低致使雌激素水平低下，正常的生殖內分泌穩態被打破[3]。越來越多研究[4-6]表明，FHA的發生發展與能量代謝和精神壓力密切相關，其具體誘因一般包括體重減少或營養不足、高強度運動訓練、各種因素導致的心理壓力過大等[7-9]。為更好地建立穩定有效的FHA動物模型，筆者從FHA病理生理及臨床特點出發，結合相關文獻，探討可能有效的FHA的動物造模方式，為今后的相關實驗提供助益。

1 心理應激

1.1 造模方式及應用

1.1.1 束縛應激

束縛應激是目前常用的一種模擬心理應激的模型之一，它能較好地模擬人類社會生活中擁擠、壓力大、挫折等生活狀態。束縛應激通過固定實驗對象的四肢或將實驗對象放置于特制的容器內剝奪其一定程度的活動自由。YANG等[10]研究了急性束縛應激對雌性小鼠的LH脈沖、RFamide-related peptide 3(Rfrp3)、Kisspeptin的表達和相應神經元激活的影響。該實驗首先將小鼠雙側卵巢切除，之后進行180 min的連續LH監測(每5 min取3 μL尾尖血進行檢測)，前90 min所有小鼠處于自由活動狀態，后90 min對照組小鼠仍然自由活動，但應激組小鼠均被置于特制狹小容器內。結果顯示束縛應激能明顯地抑制LH的脈沖式分泌。式樣進一步研究發現束縛180 min后，相對于對照組，應激組Rfrp細胞數量顯著增加20%，Kiss1和cfos的共表達顯著減少(P<0.05)。KINSEY JONES等[11]發現相似的結果，他們的實驗中大鼠在束縛60 min后即出現LH的分泌抑制，以及下丘腦Kiss-1的表達量下降(P<0.05)。

除了急性束縛，在慢性束縛應激方面也有學者做了研究。韓潔等[12]建立重復制動大鼠模型，研究慢性束縛對雌性大鼠HPO軸的影響。他們將40只SD大鼠隨機分為對照組和束縛組各20只，對照組正常飼養，束縛組采取遞增負荷束縛應激，每天置于束縛器內束縛應激1次，第1日束縛2 h，以后采用遞增負荷，每日增加0.5 h，持續2周。結果發現束縛組大鼠動情周期明顯延長，LH、雌二醇(E2)含量顯著低于對照組(P<0.05)，下丘腦GnRH，垂體促性腺激素釋放激素受體(gonadotropin releasing hormone receptor,GnRHR)、FSH、LH的mRNA表達量顯著下降(P<0.05)。FOTSING等[13]同樣也發現，慢性束縛應激(每天束縛3 h，共造模28 d)造模下的雌性大鼠動情期時間減少，血清FSH、LH、E2水平都顯著低于對照組(P<0.05)。這些實驗都提示慢性束縛應激能干擾HPOA的內分泌調節功能。

1.1.2 慢性不可預測應激

慢性不可預測應激(chronic unpredictable stress，CUS)是一種多因素復合型應激方式，主要包括束縛、游泳、懸尾、晝夜顛倒、噪音、擁擠飼養、冷水刺激等，是目前最為常見的抑郁癥造模方式之一。一般來說，實驗動物每天會被隨機賦予一到兩種應激源的刺激，相鄰2 d的應激方式避免重復，或者同種應激方式強度逐漸增強，以避免動物出現適應現象，造模持續時長一般在2周以上。有研究[14]表明，慢性不可預測應激4周可導致雌性大鼠下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸興奮與HPO軸的抑制，導致血清皮質酮(corticosterone,CORT)、促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)、促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)水平顯著提高，FSH、LH、E2顯著降低(P<0.05)。

1.1.3 其他造模方式

王建紅等[15]采用聲-光-電復合刺激雌性大鼠，先是噪音加強光刺激大鼠10 s，之后立即加上點擊足底60 s，如此造模20 d，發現大鼠動情周期紊亂，血清E2、P水平顯著低于對照組，垂體、卵巢重量偏低(P<0.05)。而WAGENMAKER等[16]以母羊為研究對象，依照隔離飼養80 min、蒙住雙眼80 min、犬吠刺激80 min順序接受刺激，發現母羊的下丘腦GnRH、垂體LH的脈沖式分泌幅度被大幅抑制。

1.2 模型評價

依據文獻來看，各種心理應激造模方式相比，束縛造模方式更為穩定。FHA是長期因素導致的疾病，故而各種急性應激的造模方式，雖能導致LH或GnRH的脈沖式分泌被抑制，但終究不合適作為FHA的造模方式。長期束縛應激造模的缺陷在于，造模方式的單一容易引起動物適應，雖然可以通過增加束縛時長解決這一問題，但過長的造模時長也有問題，韓潔[17]的另一項研究發現每天束縛6 h，3個月后會出現卵巢損傷，導致FSH水平上升。

CUS造模方式差異性大，從KATZ等[18]于1981年創立至今，具體采用哪些應激源，采用怎樣的應激強度，仍然千差萬別，不同的應激源和應激強度會導致不同的造模效果。比如，同樣是CUS法造模，FU等[19]顯示大鼠卵巢早衰發生，FSH水平顯著提高；GAO等[20]的結果之一也是FSH水平的顯著上升。這與FHA的激素變化特征不一致。

總之，對于FHA的造模，在心理應激方面，慢性束縛應激可能是較為穩定的一種造模方法。

2 能量限制

2.1 造模方式及應用

控制能量維持在低水平，其最直觀最常用的方法就是控制食物攝入量，只為實驗動物提供少于其正常需求量的食物。以老鼠為例，通常將其單籠飼養，通過前期測定或根據對照組的進食量預估其每日食物正常需求量，之后每日提供其少于此量的食物，以達到食物限制的目的。栗麗[21]依據此法研究能量限制對成年雌性大鼠生殖潛能的影響，他們將成年雌性SD大鼠隨機分成對照組、25%能量限制組(每只大鼠每日攝食量為對照組的75%)、45%能量限制組(每只大鼠每日攝食量為對照組的55%)，結果發現實驗結束后，25%能量限制組大鼠有25%動情周期不規則，45%能量限制組有60%動情周期不規則；通過對血清激素的檢測，發現實驗第4周時，兩能量限制組大鼠血清LH、FSH與對照組相比均有明顯下降(P<0.05)。陳曉純等[22]同樣發現25%能量限制8周時有近55%(6/11)SD雌性大鼠出現動情周期紊亂。AHMED等[23]發現50%食物限制的SD大鼠，1個月后LH、FSH、E2水平均顯著降低(P<0.05)，并且發現這可能與其下丘腦kisspeptin、細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,cdc2)、細胞周期蛋白B的表達量下降有關。

也有研究者選取其他哺乳動物進行實驗。LI等[24]將青春期前母羊分為對照組、低限食組(每天每只羊食物攝入量為對照組70%)、高限食組(每天每只羊食物攝入量為對照組50%)，限食53 d后，發現與對照組相比，兩限食組的下丘腦RFRP-3表達量顯著增加，下丘腦和垂體的GnRHR表達量顯著下降，垂體中的FSHR以及下丘腦中的LHR表達量也顯著低于對照組(P<0.05)。ZHOU等[25]觀察了營養限制對母豬生殖內分泌相關激素水平的影響，發現與正常飼養母豬(每只每天進食量為2.86 kg)相比，營養限制的母豬(每只每天進食量為1 kg)循環血中IGF-1、E2、FSH、LH、孕酮、瘦素水平顯著下降(P<0.05)；同時明顯下調了下丘腦kisspeptin、GnRH、ERα的基因表達(P<0.05)。

這些研究都提示，食物限制對于雌性哺乳動物HPOA有著明確的抑制作用，并且與下丘腦的變化緊密相連。

2.2 模型評價

一定程度的食物限制能明確地下調血清LH、FSH、E2水平，但如果這一過程過長，則造模效果可能會下降。上述栗麗[21]的研究進行到第10周時，與對照組相比，FSH水平已無明顯差異(P>0.05)，LH水平反而較第4周時有所回升。林旋豪[26]開展了類似研究，卻發現40%能量限制1個月后LH水平與對照組無明顯差異(P>0.05)。這提示，若要嘗試用食物限制的方法造模FHA，其造模強度和時長需要進一步探索。

3 運動疲勞

3.1 造模方式及應用

3.1.1 跑臺運動

跑臺運動是常見的強迫實驗動物運動的方法之一，通過長期遞增負荷的跑臺運動可以使動物進入并長期處于運動疲勞狀態。一般而言，研究者會通過定時增加跑步時間、跑臺速度、跑臺坡度來增加實驗動物的運動負荷量，從而達到造模效果。

鄭陸等[27]依據此法造模發現，長期遞增負荷跑臺運動的大鼠其動情周期逐漸紊亂，其下丘腦GnRH、血清LH、E2、孕酮(P)、睪酮(T)水平均隨著運動周數的增長逐漸下降，自第7周開始均有顯著差距，至第9周達到最低值(P<0.05)；而血清FSH水平雖有下降的趨勢，但始終與對照組相比無明顯差距(P>0.05)。王人衛等[28]進行了相似研究，通過血清學檢測獲得類似結果，但他們同時發現長期遞增負荷跑臺運動，大鼠下丘腦及血漿中的β-內啡肽(β-EP)顯著增高(P<0.05)，下丘腦弓狀核神經元軸突髓鞘分離、樹突腫脹、核周質線粒體空泡變，這說明這一造模方式確實能在下丘腦層面引起病理變化。

3.1.2 強迫游泳

強迫游泳也能造成實驗對象運動疲勞狀態。其基本原理是利用實驗對象的恐水特性，強迫其進行游泳活動，使其力量便逐漸衰竭，重復這一過程就能達到運動疲勞狀態。以大鼠強迫游泳為例[29-31]，通常其水深必須在大鼠全長的1.5倍以上；水溫需要控制在一定范圍內；為加快其力量耗竭，可在大鼠尾部懸掛重物，質量為3%～5%大鼠體重；當大鼠游泳動作明顯失調，沉入水面以下10 s未能浮出水面，則判定為力竭，立即撈出，撈出后必須擦干身體，然后放回原鼠籠。多項研究表明[31-32]，應用此法造模3周，能使得雌性大鼠FSH、LH、E2、P、T水平均顯著下降；周圓[29]使用類似方法，造模6周后所有大鼠動情周期消失。而另有研究[33]表明，強迫游泳致動情周期紊亂的大鼠，其下丘腦多種單胺類遞質水平顯著下調，如多巴胺、5-羥色胺等，而這些遞質與下丘腦GnRH的脈沖分泌密切相關。

3.2 模型評價

兩種運動造模方法相較而言，跑臺運動造?？倳r長似乎比強迫游泳更長，但跑臺運動造模的優勢在于實驗條件更易于控制，包括跑臺的坡度、跑臺的速度等可以精準地調節。相比之下，強迫游泳的水溫、懸掛重物都難以精準控制。并且實驗條件的控制各研究均不完全統一，比如水溫的控制，在20～34 ℃區間內，浮動較大；是否懸掛重物，懸掛重物質量的大小也沒有統一。這些因素對于游泳達到力竭狀態的時長均有很大影響。同時，有很多研究[29-31]報道，強迫游泳至力竭對卵巢有直接損傷，包括卵巢形態學的改變和對卵泡細胞的影響。

4 多因素復合

4.1 造模方式及應用

利用心理應激加上能量限制復合因素，或許能更好地達到造模目的。胡文曉等[34]利用束縛加食物限制的方法制造神經性厭食癥模型，他們將大鼠每日束縛2 h，定時移除飼料和水2.5 h。造模35 d后，其動情周期紊亂率達100%，血清E2、FSH、LH水平顯著低于對照組，其下丘腦β-EP水平顯著高于對照組(P<0.05)。

還有研究者[35]將心理應激與運動疲勞相結合進行造模，利用束縛+游泳+晝夜顛倒+空瓶刺激雌性大鼠，每日游泳30 min，束縛60 min，隔日進行1次晝夜顛倒(白天置于黑暗環境。夜晚給予模擬的日光照明)，隨機給與空瓶刺激(每籠2個水瓶，隨機撤去其中0～2個水瓶中的水)。造模46 d后，動情間期明顯延長，血清LH、FSH，以及下丘腦GnRH顯著低于對照組(P<0.05)。

此外，BETHEA等[36]將心理應激、能量限制、運動疲勞三者結合，以食蟹獼猴為研究對象進行FHA造模。通過將獼猴單獨移動至陌生環境，使其被陌生動物包圍模擬心理應激；減少其每日進食量的20%達到能量限制；將獼猴置于封閉跑步機內強迫其以80%最大速度奔跑1 h，每周跑步運動5 d，從而造成運動疲勞。實驗分5個周期進行，每個實驗周期持續一個完整的月經周期。第1個周期是完全空白對照，不做任何處理；第2個周期是對跑步機的學習訓練；第3個周期開始造模；第4個周期仍然是造模，不過模擬心理應激的陌生環境被更換；第5個周期是無應激的恢復期。結果有1/3獼猴于第3個周期結束時沒有月經，1/3獼猴于第4個周期結束時沒有月經。并且通過對整個月經周期血清學的監測，發現獼猴的雌、孕激素周期性的升高消失。進一步對獼猴下丘腦進行神經生物學研究，發現月經消失的獼猴其下丘腦弓狀核與正中隆起處的表達GnRH的神經元數量顯著低于對照組(P<0.05)。

4.2 模型評價

從FHA的病因上看，復合因素造模更為貼合臨床FHA患者的病史特征，多重因素的復合應激造模應該更容易成功造模，但這些復合造模法并沒有表現出比單一因素造模更好的造模效果或更優的造模流程。同時，多種因素的復合意味著更多無關變量的增加，實驗條件的控制更難。

5 結語

成功制造FHA動物模型須緊緊圍繞FHA的三大誘因：即心理壓力、過度疲勞運動，能量攝入不足。心理應激主要是激活機體的HPA軸，而HPA軸的過度激活與HPO軸的抑制密切相關[37]，并且這一特征與FHA患者的臨床觀察指標相一致[38-39]，而在能量限制的造模中，通常血清CORT也會顯著升高[40-41]。相比之下，運動疲勞造模法則不完全一樣，運動和限食對于HPA的影響更為復雜。比如，有研究[42]發現負重游泳的大鼠，2周后，其下丘腦CRH，垂體ACTH，血清CORT均顯著降低，HPA軸被抑制,在使用過度運動法造模時需要注意這一問題。

此外，使用心理應激與過度運動應激應該注意應激強度和造模時長的控制，過長的造模時長與過強的應激強度都會導致實驗動物的卵巢嚴重損傷，導致FSH不降反升，目前尚未在能量限制造模中發現這一問題；并且諸多研究[40,43]發現,長時間限食對大鼠卵巢生殖壽命還有一定的延長作用，較低程度的限食能使30%的大鼠限食93 d后，較對照組的卵巢原始卵泡明顯更多，卵巢儲備增加；而20%限食的大鼠不僅能增加卵巢儲備，還能維持正常生殖功能。