超聲靶向微泡破壞技術介導自殺基因在惡性腫瘤中的研究進展

吳 桐 黃 馳 杜兆林 姚懿染 劉治軍

惡性腫瘤在全球的發病率和死亡率逐年上升，其治療被認為是臨床和科研問題中最關鍵和最重要的課題之一。盡管醫學在化學治療、放射治療和外科手術方面進步斐然，但腫瘤的治療效果并未達到同等程度的預期?；虔煼ㄈ諠u成為一種全新的腫瘤治療模式，包括免疫基因治療、反義基因治療、溶瘤病毒治療和自殺基因治療在內的多種基因治療方法已經取得了重大進展。其中自殺基因療法因其獨特的作用機制而備受關注，其利用基因工程技術將前藥轉換酶基因（自殺基因）轉導入腫瘤細胞進行表達，編碼產生的酶類將無毒或低毒的前藥轉化成毒性產物，隨后通過凋亡或非凋亡機制導致細胞死亡［1］。自殺基因系統主要包括單純皰疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鳥苷（HSV-TK/GCV）系統、大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶基因/5-氟胞嘧啶（CD/5-FC）系統，以及大腸桿菌尿嘧啶磷酸核糖轉移酶（UPRT）和硝基還原酶（NTR）等。達到特定的目的需要封裝自殺基因的載體，并將其傳遞給指定的腫瘤細胞或腫瘤局部環境。超聲靶向微泡破壞（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）技術將超聲與各種功能性微泡載體相結合，可增強靶基因的轉染和表達，已成為一種極具前景的無創定位基因轉移方法，廣泛應用于癌癥的基因治療。本文就UTMD 技術介導下自殺基因的轉染在惡性腫瘤治療中的研究進展綜述如下。

一、微泡載體系統及UTMD技術概述

1.微泡載體系統：作為非病毒表達載體，微泡具備安全性能高、制備成本低、易于快速代謝、可主動靶向腫瘤受體等獨特的優勢，成為惡性腫瘤治療方法中更為安全有效的替代方案。微泡在發展過程中經歷了豐富多樣的存在形式，從微氣泡、相變液滴、固體空化核到回聲脂質體、納米微粒及從細菌中提取的蛋白質包被的氣體囊泡［2］，不僅性能得到了優化，而且粒徑實現了從微米級到納米級的飛躍。與微米級造影劑相比，納米級造影劑具有更好的生物相容性、穩定性及易修飾性，可以提供優越的循環時間和組織滲透，以獨特的優勢成為新型的基因載體［3］。在微泡外殼加以特異性的配體修飾，形成能夠與腫瘤中的過表達受體特異性結合的靶向超聲造影劑，從而限制治療基因負載載體局部傳遞到腫瘤，提高療效，避免脫靶副作用。Johansen 等［4］合成了一種以受體蛋白酪氨酸磷酸酶mu（PTPmu）衍生的癌癥生物標記物為作用位點的靶向納泡，并與非靶向納泡進行了對比評估。結果表明，與非靶向對照納泡相比，PTPmu靶向納泡利用超聲分子成像識別腫瘤效果更強、更快，且在體內外均表現出良好的穩定性。Wu 等［5］制備了均勻的陽離子納泡，實驗表明其在超聲下顯示明顯的對比度增強，尤其對低頻超聲非常敏感；且帶有特異性配體的納泡對裸鼠前列腺特異性膜抗原陽性細胞和異種移植腫瘤較陰性對照組具有較高的親和力和特異性，說明靶向微泡可使基因實現更有效的轉染。

2.UTMD 技術：將超聲波與各種功能性微泡載體相結合形成了UTMD 技術，這是一種新的非病毒基因運輸方式。一方面，攜載基因的超聲微泡本身可作為良好的顯像對比劑實現在腫瘤部位成像；另一方面，在不同強度超聲波輻照下，微泡被逐一擊破，從而釋放基因到腫瘤部位。此外，在UTMD 作用過程中產生的聲孔效應及空化效應使得膜屏障作用減弱［6］，進而增加了治療基因向胞內運輸，使得治療效果大幅提升。UTMD 技術克服了病毒載體相關的免疫原性，并具有高時空分辨率的特點，能夠實時地監測和捕獲基因，在惡性腫瘤的治療中發揮了優勢。Li等［7］在一項研究下調miR-767抑制非小細胞肺癌的實驗中發現，應用UTMD 轉染miR-767 抑制劑的細胞與單獨轉染miR-767 抑制劑的細胞相比，其增殖、侵襲和遷移能力被進一步抑制，說明腫瘤的進展受UTMD介導的影響。

二、UTMD技術介導自殺基因在惡性腫瘤中的研究進展

UTMD 技術介導自殺基因形成了一種更有針對性、更為安全有效的自殺基因傳遞系統，以腫瘤特異性受體或組織特異性啟動子為作用位點，可在一定程度上避免由于缺乏腫瘤特異性而導致的治療失敗，實現更精準的基因治療。

1.UTMD 技術介導HSV-TK/GCV 系統：目前在實驗模型中應用的各種自殺基因，以HSV-TK/GCV 系統研究最為透徹。HSV-TK 可催化無毒性抗病毒藥物更昔洛韋（GCV）磷酸化反應，通過阻止DNA合成而發揮對腫瘤細胞的毒性殺傷作用。此外，旁觀者效應將GCV 轉導到鄰近細胞，從而引起周圍未轉染細胞的死亡。UTMD 技術介導HSV-TK/GCV 系統進行的實驗研究領域包括肝癌［8-11］、胃癌［12-13］、卵巢癌［14］、腦膠質瘤［15-16］、視網膜母細胞瘤［17］等；證明UTMD 技術不僅能夠提高TK 基因的轉染效率，同時腫瘤細胞和異種移植物的殺傷效果也進一步增強，為未來的臨床研究奠定了基礎。Wu 等［8］研究表明，UTMD技術介導HSV-TK 自殺基因系統不僅提高了基因靶向性，而且增強了基因轉染效率，在體內和體外均表現出顯著的抗癌活性。修陽陽等［18］研究表明，UTMD 技術介導 HSV-TK/GCV 系統還可作為高強度聚焦超聲（HIFU）治療后的一種新的輔助療法。HIFU 依據超聲波能夠穿透軟組織的原理，將高能量超聲聚焦于病變組織，憑借產生的瞬時機械效應和熱效應殺滅腫瘤細胞，但在肝癌治療中存在因消融不完全而導致癌組織殘留等問題。謝輝等［19］通過建立異種移植肝癌裸鼠模型，結果表明載HSV-TK 的液態氟碳納米粒聯合UTMD 技術可降低HIFU 治療后殘瘤組織中的血管內皮生長因子、缺氧誘導因子-1α 及微血管密度水平，破壞腫瘤生長的血供條件，進而抑制腫瘤生長，提高HIFU 的治療效果。因此，UTMD 技術介導HSV-TK/GCV 系統聯合HIFU對癌癥的治療有協同作用。

2.UTMD 技術介導CD/5-FC 系統：CD 基因可將無毒的前藥5-FC 轉化為有毒的代謝物5-氟尿嘧啶（5-FU）。由于體積小和中性電荷，5-FU 可以很容易地擴散到細胞中［20］。因此，與HSV-TK/GCV 系統相比，CD/5-FC 系統具有遠程旁觀者效應的獨特優勢，從而達到更大范圍的殺傷效果。研究［21］表明，在UTMD 技術作用下，攜載CD 基因的陽離子納泡能夠將自殺基因成功轉染并有效表達，提高殺滅膀胱癌T-24 細胞的效率，且恢復縫隙連接蛋白Cx26 表達，可改善細胞縫隙連接通訊并加強CD/5-FC 的旁觀者效應，在增強殺傷效應的同時又能夠預防和降低復發可能。

3.UTMD 技術介導雙自殺基因系統：隨著研究的不斷深入，發現當2 個自殺基因聯合后，各自不同的作用機制可以互相補充，進而大大提高腫瘤的殺傷效率［22］。由于載體轉載容量的限制，目前大多數為雙自殺基因系統，其中以CD/TK 雙自殺基因系統最為常用。UTMD 介導CD/TK 雙自殺基因系統在惡性腫瘤中的研究包括肝癌［22-23］、膀胱癌［24-26］、肺癌［27］、宮頸癌［28］等。Hu 等［26］發現，CD/TK 雙自殺基因負載納泡結合 UTMD 能夠抑制體外膀胱腫瘤細胞和裸鼠體內膀胱癌的增殖，而雙前藥較單前藥具有更顯著的作用。同時這項研究在肺癌模型中也得到了相同的結論［27］。除了上述的雙自殺基因，有學者對UTMD 技術介導CD/UPRT 和TK/NTR 雙自殺基因對乳腺癌的治療也進行了相應的研究。Paris 等［29］開發了一種新型的介孔二氧化硅納米粒用于制備超聲納泡，進而負載CD/UPRT 融合自殺基因，聯合UTMD 技術轉染骨髓間充質干細胞（DMSCs）。實驗結果表明轉染了自殺基因的DMSCs，當暴露于無毒的前藥物5-FC時，會產生一種有毒藥物，這種有毒物質從DMSCs源擴散，到達周圍的癌細胞，從而能夠誘導共培養的大鼠乳腺癌細胞死亡。Devulapally 等［30］合成了聚乙二醇（PEG）?；廴樗?乙醇酸/聚乙烯亞胺納米粒（PLGA/PEI NP），并與TK/NTR 融合基因結合。結果表明，UTMD 技術介導TK-NTR-DNA-NP 復合物轉染后，在體外三陰性乳腺癌細胞中用GCV/CB1954前藥處理顯示出有效的細胞殺傷作用；體內實驗結果表明，UTMD 技術可以成功地將TK/NTR 基因轉移到小鼠腫瘤中，并顯示出TK/NTR 蛋白的高表達水平，且其腫瘤體積顯著減?。≒＜0.05）。表明UTMD技術介導TK/NTR 基因可作為三陰性乳腺癌患者的潛在臨床治療選擇。除了自殺基因之間的相互聯合，自殺基因還可與其他介導腫瘤凋亡的基因形成融合基因，在UTMD 技術作用下，對腫瘤的抑制起到協同作用。Kumar 等［31］合成了一種三重治療基因TK-p53-NTR，結果表明TK、NTR 自殺基因與P53 抑癌基因對三陰性乳腺癌、肝癌細胞及裸鼠模型均有協同抗癌效果，且聯合miRNAs 使得前藥GCV 和CB1954 對腫瘤細胞有效致敏，增強細胞凋亡。此外，UTMD 技術顯著增加了體內負載miRNAs 和TK-p53-NTR 納泡的腫瘤內傳遞，從而增加了治療效果，可以實現較傳統治療方法更有效的抗癌治療。

4.多模態成像介導的自殺基因治療：目前的診斷成像方法，如超聲成像、光聲成像、熒光成像，均有其自身的局限性。隨著多功能造影劑的快速發展，超聲成像與其他成像方法相結合可以實現多模態成像。因而UTMD 技術與其他先進的治療技術相結合，使得自殺基因以更為完善的方式發揮療效。Wang 等［32］設計了一種雙模態的超聲/近紅外熒光（NIRF）造影劑，并將其應用從圖像對比度增強擴展到超聲定向和部位特異性靶向的聯合診斷和治療。通過體外和體內實驗評估聚乙烯亞胺和DNA 復合物偶聯的近紅外熒光金納泡（PEI-DNA/NIR797/AuMBs）作為雙模態造影劑的潛力，結果表明所開發的治療性AuMB 復合物不僅可以提供良好的超聲和NIRF 成像以檢測腫瘤，而且可以作為一種有效的超聲觸發載體，用于異種移植裸鼠腫瘤的基因傳遞和光熱消融。與單基因治療或單次暴露組（超聲或NIRF）比較，超聲+NIRF 暴露組細胞抑制率、細胞凋亡和壞死率，以及Bel-7402 異種移植物抑制率均較高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。表明超聲聯合近紅外熒光成像介導的雙融合自殺基因對于提供更全面的診斷信息，以及指導更準確、有效的協同癌癥治療具有重要價值。

三、總結與展望

總之，UTMD 技術介導自殺基因轉染是一種極具臨床應用潛力的無創靶向基因轉移方法，大量的臨床前研究不僅證明了基因傳遞的可行性，而且還有可量化的治療效果。然而，這項技術研究多停留在細胞、動物實驗階段，在向臨床轉化的道路上仍存在挑戰。酶和前藥的開發、轉染效率的優化、微泡造影劑的安全性及靶向性等問題仍需進一步探索。優勢互補的多模態成像是UTMD 技術應用于腫瘤治療的發展趨勢，有望實現惡性腫瘤的診療一體化。相信在國內外學者的共同努力下，UTMD 技術介導自殺基因治療惡性腫瘤終將從實驗研究過渡到臨床應用，以更全面、更實際的方式服務于人類健康。