銅基單原子納米酶結合酸堿誘導分散液液微萃取分光光度法測定地表水中揮發酚

閆 琨， 馮 暉， 祝 艷， 李秋蘭， 楊德志， 楊亞玲*

(1.云南省生態環境廳駐昆明市生態環境監測站，云南昆明 650028; 2.昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明 650500)

揮發酚一般是能與水蒸汽一起蒸發、沸點小于230 ℃的一元酚[1]，它是現代工業產生的有機污染物，其進入到環境中會對人和動物體健康造成很大的危害[2 - 4]。水中揮發酚含量是我國飲用水和地表水必須檢測的項目，檢測方法主要按照(HJ503-2009)《水質揮發酚的測定4-氨基安替比林分光光度法》進行[5]，通過分光光度法直接測定的檢出限為0.01 mg/L，萃取之后再用分光光度法測定的檢出限為0.3 μg/L。該方法用到了有毒的K3[Fe(CN)6]溶液作氧化劑，且萃取中用到大量的有機溶劑氯仿，對環境及檢測人員可能會造成一定的危害。

2007年，研究者初次發現Fe3O4磁性納米顆粒具有過氧化物酶活性，從此開創了納米酶研究先河[6]。納米酶是一種具有酶活性的納米材料，擁有天然酶的特性和催化能力[7]。納米酶在一定程度上克服了天然酶存在的固有缺點，具有容易制備和保存、適用條件更廣等優勢?，F如今多種不同類型的納米酶都實現了廣泛的應用[8 - 11]。單原子納米材料就是其中之一，在腫瘤治療、抗菌、抗氧化及生物傳感等領域均得到了廣泛應用[12 - 17]。設計和制備性能優于天然酶的納米酶已經成為科學研究的熱點，其中單原子納米材料對原子利用率的顯著提升，使納米酶活性得到了很大程度的改善。有研究者報道，單個鐵原子具有優良的酶活性，其酶活大大超過了Fe3O4納米酶[18 - 20]。在此，受配位設計策略的啟發，鑒于葉綠素銅鈉具備與天然葉綠素相同的金屬卟啉結構(圖1)，我們以葉綠素銅鈉為原料，將葉綠素中的氮作為銅原子的節點，防止金屬原子的遷移和耦合，用鹽模板法合成了一種在氮摻雜碳納米片表面高濃度孤立Cu原子的單原子納米酶(Cu SAzymes，Cu-N-C)，所制備的Cu-N-C具有優越的過氧化物酶活性。Cu-N-C不僅能催化苯酚和4-氨基安替比林(4-AP)的偶聯，還能催化氧化傳統4-AP法中不能氧化和測定的硝基酚類物質。結合分散液液微萃取技術，研究基于納米酶的催化氧化建立了揮發酚比色檢測的方法。該測定方法操作簡便、快捷、靈敏度高、選擇性好，并能實現實時快檢，對于建立現場分析技術具有借鑒和指導意義。

圖1 葉綠素銅鈉結構式Fig.1 Structure of sodium copper chlorophyll

1 實驗部分

1.1 儀器與化學試劑

場發射透射電子顯微鏡(TEM，Tecnai G2 TF30，荷蘭FEI公司)；紫外-可見分光光度計(UV-2600，日本島津公司)；X射線衍射儀(XRD，德國Bruker公司)；傅立葉變換紅外光譜分析儀(FTIR，TENsoR27型，德國Bmker公司)；X射線光電子能譜(XPS，ESCALAB 250Xi，賽默飛世爾(中國)公司)；電子自旋共振光譜儀(ESR，ABrukerEMX,Billerica，MA)；高速離心機(HC-3018R型，安徽中科中佳科學儀器有限公司)；石英管式爐(SG-GS 1200，上海識捷電爐有限公司)；精密酸度計(pHS-3B，德國賽多利)；磁力加熱攪拌器(78-1型，上海南匯電訊器材廠)；電子分析天平(AB204-S，梅特勒-托利多)。

苯酚標準溶液(500 mg/L)和揮發酚標準樣品購買自環境保護部標準樣品研究所。鄰苯二胺(OPD)、葉綠素銅鈉(≥99%)、正庚酸(99%)、2,2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)和3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(TMB)購自阿拉丁生化科技股份中國有限公司，4-氨基安替比林(4-AP，99%)、H2O2(30%)、KCl(AR)、H2SO4(98%)、HCl(36.5%)、NH3·H2O(28%)和薄荷醇(≥99%)購買自上海麥克林生化科技有限公司；實驗用水為去離子水。

1.2 Cu-N-C的合成

將0.7 g葉綠素銅鈉、10 mL甲醇與50 g KCl加到圓底燒瓶中，密封并室溫攪拌10 h。然后將其放置到真空干燥箱中，80 ℃干燥24 h以除去甲醇。得到固體顆粒后，放置于管式爐中，氮氣保護下750 ℃煅燒3 h，產物通過0.5 mol/L的H2SO4浸泡24 h，并用去離子水洗滌多次，即得到Cu-N-C。

1.3 Cu-N-C的表征

用場發射透射電子顯微鏡(TEM)對Cu-N-C的粒徑和形貌進行測試；利用紫外-可見吸收光譜(UV-2600)和傅里葉紅外光譜分析Cu-N-C的光譜學特性和基團等；在2θ為20°～100°的范圍內通過X-射線衍射儀對納米Cu-N-C進行物相鑒定；采用電子自旋共振光譜儀測試反應中自由基的產生。

1.4 過氧化酶活性測定

在25 μL Cu-N-C(35 μg/mL)和2 mL HAc-NaAc緩沖溶液(pH=4.0)中，通過加入不同濃度的H2O2和TMB，混勻并室溫孵育30 min后，在波長654 nm處進行吸光度測定。利用經典的米氏方程模型，對Cu-N-C的酶活進行評估：1/v=(Km/Vmax)·(1/[S]+1/Km)，式中v為反應速率，Km為米氏常數，Vmax為最大反應速率，[S]為底物TMB濃度。

1.5 揮發酚的測定

在50 mL具塞比色管中加入濃度范圍在1.25～250 μg/L苯酚標準溶液，5 mL的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液(pH=7.0)，1.5 mL 4-AP，0.1 mL 35 μg/mL的Cu-N-C，0.2 mL 40 mmol/L的H2O2。用去離子水稀釋至50 mL并混勻，于室溫下放置5～10 min。然后加入2 mL低共熔溶劑作萃取劑，加入1 mL NH3·H2O作乳化劑，渦旋1～2 min形成均勻乳液。靜置2 min后，加1 mL HCl，4 000 r/min下離心5 min分相。最后取上層低共溶溶劑萃取相，于波長508 nm處測定吸光度。

2 結果與討論

2.1 Cu-N-C納米酶的表征分析

Cu-N-C納米酶的形貌特征用透射電鏡(TEM)測試，結果如圖2A所示。從圖中可以看出合成的產物呈現納米片狀結構。Cu-N-C的X射線衍射(XRD)圖譜在2θ=25.2°處的峰與碳材料的峰對應(圖2B)。圖2C為Cu-N-C的傅立葉變換紅外(FTIR)光譜圖，如圖所示，3 417、3 236 cm-1位置的峰歸因于O-H和N-H的伸縮振動，2 924 cm-1處的峰主要是由于C-H的伸縮振動，1 639 cm-1處的峰是C=O和C-N 的振動特征峰，1 224 cm-1處的峰歸屬于C-N的伸縮振動，1 072 cm-1位置的峰可能是Cu-N的伸縮振動引起[21]。圖2D為Cu-N-C的X射線光電子能譜(XPS)譜圖，從其特征譜圖中可以看到5個不同的特征峰，分別為C 1s，N 1s，O 1s，Cu LMM和Cu 2p，表明該材料存在C、N、O和Cu元素，這與紅外光譜的檢測結果相一致。

圖2 Cu-N-C的TEM圖(A)，XRD譜圖(B)，FTIR譜圖(C)和XPS譜圖(D)Fig.2 TEM image (A),XRD spectrum (B),FTIR spectrum (C),and XPS spectrum (D) of Cu-N-C

2.2 Cu-N-C納米酶的酶活分析

在H2O2存在下，對一些典型的致色底物，包括TMB、OPD、ABTS、4-AP/Phenol(圖3)，Cu-N-C均可催化這些底物變色，表明所制備的Cu-N-C單原子納米酶催化性能優異?？疾炝薚MB作為底物時，Cu-N-C和辣根過氧化物酶(HRP)的酶促反應動力學。由圖4A可知，在合適的條件下，Cu-N-C催化底物H2O2-TMB反應的動力學特征與典型的米氏動力學方程相符合，催化反應的速度隨著TMB底物濃度的增加明顯增加，表明Cu-N-C可能先與底物H2O2反應產生·OH，進一步氧化底物TMB生成藍色氧化oxTMB。米氏常數Km和最大反應速率Vmax相關數據列于表1中。結果表明：Cu-N-C對TMB，其動力學參數Km比HRP的低，表明其對TMB的親和力高于HRP，而Vmax比HRP高，展示了更高的催化反應速度。

圖3 Cu-N-C氧化不同底物的紫外-可見光譜圖Fig.3 UV-vis spectra of reaction systems treated with different substrates

圖4 H2O2濃度不變Cu-N-C (A)和HRP (B)存在下TMB濃度變化的動力學實驗Fig.4 Kinetic assay with the variation of TMB concentration at constant H2O2 concentration in the presence of (A) Cu-N-C and (B) HRP

表1 以TMB為底物的米氏常數(Km)和最大反應速率(Vmax)的比較Table 1 Comparison of the Michaelis-Menten constant (Km) and maximum reaction rate (Vmax) for TMB as substrate

2.3 過氧化物酶活性的機理研究

圖5 Cu-N-C-H2O2體系的電子自旋共振(ESR)譜圖Fig.5 ESR spectra of the Cu-N-C-H2O2 system

2.4 酸堿誘導的低共熔溶劑微萃取水質中揮發酚

2.4.1 微萃取條件優化Cu-N-C納米酶表現出的優異過氧化酶催化活性，通過其催化氧化酚類化合物和4-AP的顯色反應，建立揮發酚的測定方法。揮發酚類化合物在水中存在的濃度非常低，且環境水樣基質較為復雜，因此在測定之前一般需要預富集和凈化。本研究利用環保綠色的低共熔溶劑(DES)作萃取劑進行Cu-N-C-H2O2-苯酚-4-AP體系的萃取，結果表明，以正庚酸與薄荷醇摩爾比為1∶1的DES為萃取劑，用NH3·H2O作為乳化劑促進DES萃取劑的分散。之后再利用HCl作為破乳劑實現DES萃取劑的分相，最后，通過離心手段分離后，取上層萃取相進行光度測定。整個實驗流程如圖6所示，通過酸堿誘導結合DES萃取劑，可以達到非常好的萃取分離效果。經過條件試驗優化之后，發現在總體積為50 mL的溶液中，以0.2 mL摩爾比為1∶1的正庚酸-薄荷醇的DES作為萃取劑，加入1 mL NH3·H2O乳化和1 mL HCl破乳時，萃取效果最佳。

圖6 酸堿誘導的低共熔溶劑微萃取示意圖Fig.6 Schematic illustration of acid-base induced DES extraction

2.4.2 Cu-N-C納米酶檢測體系優化在H2O2或者O2參與下，以苯酚為模型底物，利用納米酶的過氧化酶活性與4-AP反應生成紅色產物[22]。如圖7所示，在沒有H2O2存在下，Cu-N-C也能催化4-AP和酚的偶聯顯色，但H2O2存在下，其顏色將更深，表明該納米酶具有氧化酶和過氧化物酶雙重酶活。通過測定不同pH值(用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液調節)下Cu-N-C的催化活性，如圖8A所示極酸條件下Cu-N-C的催化活性幾乎為零，pH=7.0時催化活性最高，pH高于7之后，活性逐漸降低，表明酶對極端條件(極酸、極堿)較敏感。推測H2O2在Cu-N-C催化作用下，能產生·OH，自由基的產生加速了催化反應速度，使紅色物質得以快速生成。因此，H2O2的濃度對Cu-N-C的過氧化物酶活性有著良好的催化能力。

圖7 Cu-N-C-H2O2氧化苯酚體系Fig.7 Phenol oxidation system of Cu-N-C-H2O2

在Cu-N-C/H2O2/苯酚/4-AP體系中，苯酚濃度在1.25～250 μg/L范圍內與氧化產物的吸光度呈現良好的線性關系，因此該方法可用于揮發酚的檢測(圖8B)。同時，在3個不同加標濃度(5，100和200 μg/L)條件下，方法的加標回收率均在96.8%以上(表2)。

圖8 pH的影響(A)；苯酚檢測線性范圍(B)Fig.8 (A)Effect of pH;(B)Linear range of phenol detection (B)

3 結論

本研究建立了一種銅基單原子納米酶結合酸堿誘導分散液液微萃取技術的分光光度法測定地表水中揮發酚的方法。研究以鹽模板法合成了具有雙重酶活(過氧化物酶和氧化酶活性)的銅基單原子納米酶(Cu-N-C)。利用Cu-N-C的過氧化物酶活性，催化H2O2產生·OH，促進酚與4-AP偶聯顯色，結合低共熔溶劑酸堿誘導分散液液微萃取，實現水質中揮發酚的快速、高靈敏檢測，方法檢出限為0.5 μg/L，且成功用于實際地表水樣中揮發酚的檢測。該方法在實際檢測應用中具備一定的可信度和可能性。