二甲雙胍對大鼠關節軟骨細胞的影響及機制

邢亨特，梁傳財，王晨宇，邱 波

骨關節炎(osteoarthritis， OA)是一種慢性關節疾病，常伴隨關節軟骨退變、骨質改變和關節滑膜炎癥等病理變化。傳統觀點認為性別、衰老、肥胖、關節創傷和遺傳易感性等因素與OA的發生和發展緊密相關，但其確切致病因素現尚無定論[1]。近年，越來越多的研究證實了OA與代謝綜合征有密切聯系，因二者的核心都是慢性低度全身性炎癥，有學者甚至認為OA可能屬于代謝綜合征的范疇[2]。代謝綜合征被認為是導致動脈粥樣硬化、心血管疾病和糖尿病的危險因素[3]。有研究顯示，與普通人群相比，OA患者患動脈粥樣硬化的風險更高,其中脂質代謝的改變可能發揮著關鍵作用[4]。有文獻報道，OA患者的軟骨細胞中存在特異性脂質沉積，而膽固醇的異常沉積能破壞細胞膜的結構和功能，導致細胞死亡[5]。還有研究顯示，高膽固醇血癥能觸發軟骨細胞的線粒體過度氧化應激，促進其凋亡和炎癥反應。有細胞水平研究也發現，在外源性給予膽固醇后，可加速軟骨細胞外基質的降解，嚴重影響關節軟骨的質量[6-7]?？梢?，膽固醇在OA的發生和發展中發揮著重要作用，故調節軟骨細胞內膽固醇含量可能延緩OA的進展。

目前，二甲雙胍(MET)是治療2型糖尿病的一線藥物之一。隨著研究的深入，發現MET除了降糖的作用外，在調節脂質代謝方面也發揮著出色的作用[8-9]。有研究發現，MET能通過降低乳腺癌MDA-MB-231細胞系中膽固醇含量，抑制癌細胞的生長和轉移[10]。此外，還有研究顯示MET可降低血液總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平，這可能是治療動脈粥樣硬化和2型糖尿病的有效策略[8]?？梢?，MET的降脂活性可能對多種疾病具有一定療效，但其對OA的療效鮮有報道。因此，本研究構造Wistar大鼠OA軟骨細胞模型，分析MET對關節軟骨細胞基質合成、降解及膽固醇合成通路相關基因表達的影響，探討膽固醇對OA軟骨細胞的作用機制，以期為OA發病機制研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1主要儀器和試劑 qRT-PCR儀(美國ABI公司)，紫外分析儀(北京君意有限公司)，酶標儀(美國Thermofisher公司)，倒置顯微鏡(廣州明美科技有限公司)，微量分光光度計(杭州奧勝儀器有限公司)，Trizol(美國Amibon公司)，兔多抗GAPDH(杭州賢至生物有限公司)，兔多抗Ⅱ型膠原蛋白(ColⅡ)、兔多抗SREBP-2(美國Affinity公司)，兔多抗基質金屬蛋白酶-13(MMP-13)(武漢三鷹生物技術有限公司)，兔多抗HMGCR(英國Abcam公司)，白細胞介素-1β(IL-1β)(美國Pepeotech公司)，MET(上海阿拉丁公司)，CCK-8細胞增殖及毒性檢測試劑盒(上海皓元生物醫藥科技有限公司)，總膽固醇(TCH)測定試劑盒(南京建成生物科技有限公司)。

1.2Wistar大鼠關節軟骨細胞培養和處理 在無菌環境下處死Wistar大鼠，取雙側膝關節軟骨組織，剪刀剪碎，用0.1%胰蛋白酶浸泡60 min，在培養箱中過夜；收集消化后的細胞，重懸在軟骨細胞培養基中培養；然后將培養基中的軟骨細胞置于細胞培養箱中傳代，后續實驗采用第二代軟骨細胞。

1.3細胞存活率檢測 采用CCK-8法進行細胞存活率檢測。取生長狀態良好的軟骨細胞以5×103個接種于細胞培養96孔板中，在37 ℃、5% CO2培養箱中過夜；用IL-1β(1 ng/ml)和不同濃度MET(5、10、15 mmol/L)對細胞處理24 h。每孔加入10 μl CCK-8反應液，37 ℃培養2 h;用酶標儀測定吸光度(OD)值,波長450 nm,計算細胞存活率。

1.4關節軟骨細胞mRNA表達檢測 采用TRIzol法提取軟骨細胞總RNA。用cDNA合成試劑盒合成互補鏈DNA；采用SYBR Green Marter Mix 實時定量PCR技術檢測目的基因的mRNA表達，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。采用ABI Quant Studio6 對cDNA進行定量分析。熱循環條件：95 ℃孵育10 min，95 ℃變性15 s，共40個擴增循環，60 ℃退火延伸。以GAPDH為內參，比較定量采用2-ΔΔCt法。引物序列(5'-3')：GAPDH上游ACAGCAACAGGGTGGTGGAC，下游TTTGAGGGTGCAGCGAACTT，產物253 bp；MMP-13上游ACCAGAGAAGTGTGACCCAG，下游CTCGGGATGGATGCTCGTAT，產物191 bp；ColⅡ上游TGACTTTCCTCCGTCTACTGTC，下游AGGTCTTCTGTGATCGGTACTC，產物249 bp。

1.5關節軟骨細胞蛋白提取 用預冷的PBS洗滌3次軟骨細胞，然后用RIPA裂解液溶解細胞，按1 ml裂解液加10 μl PMSF(100 mmol/L)，搖勻置于冰上。裂解完后將細胞碎片和裂解液移至1.5 ml離心管中，離心后取上清于離心管中放置于-20℃保存。用于后續Western Blot法檢測原代軟骨細胞目的基因的表達。

1.6關節軟骨細胞TCH含量 采用TCH測定試劑盒檢測軟骨細胞TCH含量。通過裂解和離心收集細胞，然后根據試劑盒說明書，在96孔板上操作，并使用酶標儀測量每個孔的OD值，波長510 nm。

2 結果

2.1關節軟骨細胞CCK-8法檢測結果 在用IL-1β制備的OA軟骨細胞模型中分別加入濃度為5、10、15 mmol/L的MET處理24 h后，進行CCK-8法細胞增殖分化活性檢測，發現在MET濃度為10 mmol/L時細胞增殖分化活性較佳，見圖1，后續實驗采用濃度為10 mmol/L MET進行。

圖1 Wistar大鼠關節軟骨細胞CCK-8法檢測結果

2.2MET對關節軟骨細胞基質合成和降解的影響 與正常軟骨細胞比較，OA軟骨細胞ColⅡ mRNA顯著降低，而MMP-13 mRNA則顯著升高(P<0.05)。與OA軟骨細胞比較，經10 mmol/L MET干預后的OA軟骨細胞Col Ⅱ mRNA明顯升高，MMP-13 mRNA顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 MET對Wistar大鼠關節軟骨細胞基質合成和降解的影響

2.3MET對關節軟骨細胞膽固醇合成通路的影響 與正常軟骨細胞比較，OA軟骨細胞膽固醇調節元件結合蛋白-2(SREBP-2)和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)蛋白明顯升高(P<0.01)。與OA軟骨細胞比較，經10 mmol/L MET處理后的OA軟骨細胞SREBP-2和HMGCR蛋白顯著降低(P<0.01)。見圖3。

圖3 MET對Wistar大鼠關節軟骨細胞膽固醇合成通路的影響

2.4MET對關節軟骨細胞TCH的影響 與正常軟骨細胞比較，OA軟骨細胞TCH明顯升高(P<0.01)。與OA軟骨細胞比較，經10 mmol/L MET處理后的OA軟骨細胞TCH顯著降低(P<0.01)。見圖4。

圖4 MET對Wistar大鼠關節軟骨細胞TCH的影響

3 討論

OA是導致老年患者慢性殘疾的主要原因，其病因復雜多樣，尚無定論。近年，越來越多的學者認為脂質代謝異?？赡芘cOA的發展存在關聯。有文獻報道內分泌器官的脂肪含量增加被證明是關節異常負荷和脂肪因子、炎性因子過度產生的原因[11-12]。有研究顯示膽固醇代謝失調與軟骨細胞中異常脂肪堆積有關，從而導致OA表型產生[13]。還有文獻報道在家族性高膽固醇血癥患者關節內也能見到明顯的膽固醇沉積，可能與手部OA發生密切相關[14]。因此，調節軟骨細胞內異常膽固醇代謝可能對OA治療發揮作用。

隨著研究的不斷深入，MET的諸多潛在作用被發現，它可能對多種疾病具有一定作用。在肌肉骨骼系統疾病中，FENG等[15]研究顯示MET可能通過調節AMPK/mTOR信號通路，延緩軟骨衰老和退化。還有研究發現，MET能減輕OA軟骨細胞氧化應激、炎癥反應和線粒體損傷；此外，MET還能通過AMPK/SIRT1通路，調節軟骨細胞自噬與凋亡之間的相互作用，抑制OA表型表達，抑制OA軟骨細胞外基質降解，保護關節軟骨[16-17]。本研究結果顯示，與正常軟骨細胞比較，OA軟骨細胞ColⅡmRNA顯著降低，而MMP-13 mRNA和TCH顯著升高；與OA軟骨細胞比較，經10 mmol/L MET處理后的OA軟骨細胞Col Ⅱ mRNA明顯升高，而MMP-13 mRNA和TCH顯著降低。說明IL-1β誘導的OA軟骨細胞TCH表達顯著升高，而MET能有效降低OA軟骨細胞內膽固醇含量，同時促進OA軟骨細胞的ColⅡmRNA表達，抑制OA軟骨細胞MMP-13 mRNA表達。提示MET能減少軟骨細胞內TCH含量，促進軟骨細胞基質合成，抑制基質降解，保護軟骨。

膽固醇是細胞膜的重要成分，包括軟骨細胞在內的多類細胞都能通過生物合成途徑合成膽固醇，并且在其生物合成途徑中與其他中間體一起調控信號分子[18]。有研究表明，膽固醇調節元件結合蛋白是調節脂質代謝的關鍵轉錄因子，其中SREBP-2參與激活膽固醇代謝和生物合成基因[7]。KOSTOPOULOU等[19]研究發現，miR-33a通過轉化生長因子/Akt/SREBP-2途徑調控OA軟骨細胞中膽固醇的合成，并且HMGCR作為SREBP-2靶基因，在OA軟骨細胞中表達是顯著升高的。本研究結果顯示，與正常軟骨細胞比較，OA軟骨細胞SREBP-2和HMGCR蛋白明顯升高；與OA軟骨細胞比較，經10 mmol/L MET處理后的OA軟骨細胞SREBP-2和HMGCR蛋白顯著降低。說明MET能減少OA軟骨細胞膽固醇合成通路中關鍵基因SREBP-2和HMGCR蛋白表達，結合胞內TCH表達的變化，提示MET可能通過減弱軟骨細胞SREBP-2/HMGCR通路，抑制胞內膽固醇合成，減少膽固醇蓄積?？梢?，膽固醇合成異?？赡苁怯绊慜A發生和發展的因素之一。

綜上所述，MET能有效減少IL-1β誘導的Wistar大鼠OA軟骨細胞中的膽固醇含量，同時能夠減少關節軟骨細胞外基質的降解，而這可能是通過抑制SREBP-2/HMGCR信號通路、減少膽固醇合成實現的。本研究有助于我們進一步認識膽固醇代謝與OA的關系，為OA的早期防治提供新的思路。然而，本研究尚未證明膽固醇流出通路對OA的影響，以及膽固醇合成與流出之間的相互關系，尚待進一步研究。