eccDNA在癌癥中的研究進展

于承平 崔永康 綜述 李林強 審校

染色體外環狀DNA(extrachromosomal circular DNA，eccDNA)是近年來發現的，并存在于染色體外的環狀DNA分子。Stahl首次提出，DNA可能在高等生物的染色體外以一系列環狀形式存在。1965年，Zuo等[1]對公豬精子DNA分離提取并發現eccDNA，并進一步驗證該理論。目前研究發現eccDNA具有獨立存在于染色體之外的、呈獨立的環狀DNA結構、重復的基因組序列、與染色質基因序列相同、數百堿基至數千堿基組成等一系列特征。越來越多的證據已經證明了eccDNA在腫瘤的異質性、侵襲性、進化和化學抗性方面發揮功能，大體總結為通過驅動腫瘤異質性使癌細胞可以快速適應治療方案和環境變化。因此，有人提出eccDNA將會是癌癥治療的新靶點，還可作為新型生物學標志物用于癌癥診斷和治療預后評估。本文就eccDNA的分類、形成機制、在癌癥中的表達及作用進行綜述。

1 eccDNA的分類

1.1 小多分散DNA(spcDNA)

spcDNA最初是在19世紀70年代由Radloff在一篇介紹染料浮力密度離心純化環形DNA的文章中提出的[2]。研究發現，spcDNA的長度為數百堿基至數千堿基不等[3]，來源于基因組的重復序列[2，4-5]。Krolewskla等[4]對非洲綠猴腎細胞分離純化得到spcDNA，大小約為300 bp。Hollis等[2]在外周血淋巴細胞的spcDNA中分離得到人類基因組中短且重復的序列-Sau3A家族。研究表明，范可尼貧血(Fanconi Anemia，FA)、著色性干皮病(Xeroderma Pigmentosum，XP)、結腸癌細胞和宮頸癌上皮細胞(HeLa)等組織和細胞中富含spcDNA[5]。在致癌物誘導正常細胞癌變的過程中，細胞產生大量spcDNA[3]：藥物環乙酰亞胺或抑制DNA復制的藥物如羥基脲(HU)或1，7-二甲基苯并蒽(DMBA)加萘二酸處理小鼠的細胞后，細胞中spcDNA水平升高；同樣在對細胞進行烷化劑甲基硝基亞硝基胍(MNNG)和其他致癌物處理后，嚙齒動物細胞中的spcDNA數量增加。由此可見，spcDNA的產生與基因組不穩定密切相關。在spcDNA形成過程中，在致癌原影響下染色體重組會提高基因組的不穩定性；spcDNA形成后，致癌原誘導的spcDNA可能作為突變體，進一步促使染色體異常[3]。

1.2 端粒環

端粒是位于每個染色體臂末端的核蛋白結構，由一個高度保守的六聚體(TTAGGG)串聯重復DNA序列形成[6]，大小約為738bp的整數倍[7]。其作用在于保護DNA不被降解和融合。端粒環最初在哺乳動物中被發現，隨后相繼在原核生物、植物、線蟲和鳥類的端粒中被發現[8]。端粒環是端粒DNA的3′末端外伸突出形成單鏈富G重復序列的套索樣結構，本質是保護端粒的3′末端[6，9]。端粒環的形成是端粒重復序列間的基因重組或從端粒中切除的結果[10]。研究發現，端粒重復序列結合因子2(Telomere repeat binding factor 2，TERF2)促進端粒3′端DNA的末端卷曲，并在端粒環形成和維持過程中至關重要[9]。當端粒環形成后，其通過滾動循環擴增不斷增大，產生端粒重復序列，使端粒延長[10]。由此可見，端粒環在維持端粒長度中起重要作用。也有文獻報道，端粒環形成調控相關蛋白，如起源識別復合物(Origin recognition complex，ORC)和Werner綜合征蛋白(Werner syndrome protein，WRN)[11]，在端粒環的形成中發揮重要作用。已有研究發現端粒替代延長機制(Alternative lengthening of telomeres，ALT)在肉瘤、胃癌、中樞神經系統惡性腫瘤、腎癌(Wilm′s腫瘤)、膀胱癌、間皮瘤、惡性黑色素瘤和生殖細胞睪丸癌等中發揮重要作用[7]。目前尚沒有文獻具體闡述端粒環在ALT中的作用。

1.3 染色體外rDNA環(Extra-chromosomal Ribosomal Circles，ERCs)

ERCs首次在衰老酵母的核仁中被發現[11]。rDNA基因序列位于染色體1、12、13、14、15、21、22上，由150～200個串聯重復序列組成[11-13]。DNA重復序列的存在，使核糖體DNA基因組具有不穩定性[12]。在DNA復制過程中，DNA雙鏈斷裂可以通過同源重組來修復，同源重組修復缺失，導致ERCs的形成[13]。也有證據表明，酵母中核糖體DNA復制岔口停滯，從而形成ERCs[14]。在衰老的細胞中，ERCs的含量大量增加。研究發現酵母細胞進入衰老之前，ERCs的表達水平呈指數形式增加[11]。由此可見，ERCs的積累與酵母細胞衰老呈正相關。

1.4 微DNA(microDNA，miDNA)

miDNA最早在小鼠的大腦細胞中發現，曾被認為是eccDNA的唯一存在形式[15]。miDNA長度僅在200～400 bp之間[16]，主要來源于非重復基因組序列[17]。研究發現，小鼠組織及人類細胞系的基因組5′端、外顯子和CpG基因組中高度富集miDNA。miDNA中含有豐富的GC堿基對[18]。另外，在miDNA起始段和末端存在長度為2 bp～15 bp的重復基因序列[15，17-18]。有文獻報道，miDNA的產生在一定程度上也與轉錄和RNA代謝有關[17]。Paulsen等[16]應用LAMA(Ligase-assisted mini-circle accumulation)技術對人腫瘤細胞的miDNA進行測序，并人工合成相應的miDNA，進行體內外轉染，發現其可以轉錄為相應的miRNA，這一過程不依賴于經典的啟動子機制。不僅如此，miRNA可以發揮相應的作用，通過調控下游靶基因的變化，進而影響腫瘤的進展[19]。

2 eccDNA的形成機制

2.1 損傷修復機制的缺失

正常細胞通過激活強勁的DNA損傷修復機制(DDR)途徑對DNA損傷做出反應，每一種修復都通過不同的機制。在細胞周期的不同階段，至少有七種主要的DNA修復途徑——堿基切除修復(BER)、核苷酸切除修復(NER)、錯配修復(MMR)、同源重組(HR)和非同源端連接(NHEJ)、直接化學逆轉切除以及鏈間交聯(ICLs)修復，使細胞能夠修復DNA損傷[20]。BER和NER具有相對保真性，但大量堿基或核苷酸切除時，可能意外激活某種DNA聚合酶，引起堿基、核苷酸聚集，從而產生長度不一的eccDNA。NHEJ通路以一種靈活的方式利用蛋白質識別、切割、聚合和連接DNA末端。但NHEJ的缺失極易引起DNA雙鏈斷裂(DSBs)。DSBs是最危險的DNA損傷類型，因為DSBs可以導致大的染色體結構的游離丟失[21]，且存在產生eccDNA的可能。

2.2 DNA復制過程中出錯

DNA復制過程中錯誤地激活DNA聚合酶且在模板鏈上產生一個環形DNA分子，這個環被切除并形成一個圓形結構，并在染色體上留下一個微小缺口[22]。DNA復制具有相對保真性，當然這種出錯的概率較小，但不排除產生eccDNA的可能。

3 eccDNA的研究新進展

越來越多的研究表明，eccDNA在癌癥中異常表達且發揮重要作用。Kumar等[15]對23例惡性腫瘤患者(12例肺癌和11例卵巢癌)的血清及血漿樣本分析發現，12例肺癌患者中有8例，11例卵巢癌患者中有7例，即近三分之二的患者在腫瘤切除后血漿中miDNA長度減少，原因可能是原位生長的腫瘤釋放出更長的miDNA進入血液循環中。由于涉及倫理學，尚不能確定其余三分之一患者術后miDNA較術前長是否與腫瘤復發有關[15]。Mehanna等[23]用甲氨蝶呤(MTX)和L-天冬酰胺酶(ASP)處理人淋巴母細胞樣細胞系(LCLs)誘導其細胞凋亡和DNA斷裂，然后提取miDNA并測序發現，兩種藥物治療的LCLs產生的miDNA數量顯著多于對照組，且在MTX組中這一現象更為明顯，表明化療可能影響miDNA的產生及表達。

文獻報道，使用中性二維(2D)凝膠電泳，通過與總基因組DNA或特定探針雜交后，可以區分典型的超卷曲分子、圓形及線性分子[3]。這使得在相對較小的總DNA樣本中識別環形分子，并便于eccDNA的結構及功能研究。果蠅胚胎含有豐富的松弛的環形分子組成的eccDNA，約占總DNA含量的1%～2%。在通過研究果蠅衰老與eccDNA的關系時發現，果蠅的衰老并不伴隨eccDNA的積累；相反，它的水平可能會逐漸降低[24]。Tunner等[25]通過全基因組測序，結合癌癥基因組圖譜(TCGA)，分析13種不同的癌癥發現，所有擴增癌基因均可以以eccDNA的形式存在。eccDNA的表達水平在不同類型的腫瘤中有所不同。在惡性膠質瘤中，eccDNA陽性率較高；而在結腸癌和血液病中eccDNA陽性率較低[25]。

eccDNA除了在腫瘤組織中表達豐富外，在自然界生物體也存在環狀DNA，如乙型肝炎病毒(HBV)通過誘導DNA的前基因組RNA(pgRNA)逆轉錄復制，產生異常結構的松弛環狀DNA(RC-DNA)。RC-DNA通過復雜的轉化形成閉合環狀DNA(cccDNA)，進而在體內尤以在肝臟器官中表達顯著[26]。cccDNA 作為新興研究的治愈性靶點，在未來慢性乙型肝炎可能被治愈[27]。

此外，eccDNA與癌癥的耐藥密切相關。順鉑(DDP)耐藥是降低化療效果的重要因素，從而導致下咽鱗狀細胞癌(HSCC)局部復發和淋巴結轉移。Wu等[28]證實eccDNA上編碼的癌基因在腫瘤轉錄組中高度表達。Lin等[29]對HSCC細胞系FaDu和DDP抗性細胞系FaDu/DDP中eccDNA提取分析發現，DDP抗性細胞系FaDu/DDP存在大量的eccDNA；eccDNA上RAB3B基因過表達提高FaDu細胞對DDP的抗性，誘導FaDu細胞的自噬，進而促使HSCC耐藥。文獻報道，膠質母細胞瘤組織標本的eccDNA中檢測出大量表皮生長因子受體(EGFR)[30-31]，其易突變為活躍的變異體EGFRVⅢ[31]，而EGFRVⅢ對酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)不敏感，從而使腫瘤細胞對TKIs耐受，導致治療效果不佳。另外，eccDNA與宮頸癌的耐藥可能相關[32]。

4 小結與展望

目前，eccDNA的神秘面紗已逐漸被揭開，其在癌癥中的表達及重要作用等已逐漸顯現，但這只是冰山一角。以往對于癌癥的研究報道，多是基于染色體的基因進行研究，而忽視了染色體外的基因，如eccDNA。另外，eccDNA也可以重新嵌合至染色體形成線性DNA，方式發生改變且進一步發揮作用，這可能是臨床癌癥治療效果差強人意的重要原因之一。相信隨著研究的逐漸深入、數量的增多及相關技術的不斷成熟，eccDNA在癌癥發生發展中的機制會逐漸明晰，可為癌癥的早期診斷、治療提供更多的靶點和思路。