6種雞精液冷凍稀釋液以及凍后保存條件比較

何孟纖，汪俊躍，孫玲偉，徐皆歡，吳彩鳳，張樹山，戴建軍，楊凱旋*，張德福*

（1.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；2.上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海市農業遺傳育種重點實驗室，上海 201106）

精液冷凍保存技術是目前畜禽遺傳資源收集與保護中最有應用價值的技術之一，該技術已在多種哺乳動物的保種和商業化推廣中得到廣泛應用。在家禽上，精液冷凍雖已在其種質資源保護中得到了部分應用[1]，但存在凍后精子存活率低，輸精后種蛋孵化率不高等問題，因此，仍需對該技術進一步優化[2]。雞精液冷凍技術能最大限度地利用遺傳性能良好的種公雞，對禽類種質資源的保護具有重要意義[3]。與哺乳動物相比，禽類精子因結構細長，對冷凍損傷更為敏感，抗凍性較差[4]。近年來，中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所對雞精子抗凍性基因進行相關研究[5]。但到目前為止，家禽的精液冷凍技術尚未取得良好的效果，仍有待進一步完善。

雞精液冷凍保存技術主要包括精液的采集、稀釋液的添加、精液平衡、精液冷凍、解凍和輸精。禽類精液是由精清和精子組成，但其化學成分與哺乳類動物的精液差別較大，如禽類精液中幾乎不含果糖和檸檬酸，但含有粘多糖、葡萄糖和甘油等；家禽精子頭部直徑約為0.5 μm，其精子尾部直徑較頭部略小。精液冷凍過程中，一方面因精清中的成分不足以保護精子免受冷凍損傷[6]；另一方面因公雞一次射精量少，精液密度較高，需要適當進行稀釋[7]，因此研發高效冷凍稀釋液成為提高雞精液冷凍效果的關鍵因素。稀釋液中的果糖和葡萄糖可以為精子提供能量，鹽類物質等也可以為精液提供合適的滲透壓和pH 環境[8]。目前，已有多種稀釋液應用于雞精液冷凍保存，但不同研究結果差異較大?；诖?，本研究選擇6 種常用的、凍后效果較好的雞精液冷凍稀釋液，比較這6 種稀釋液對雞精子凍后活力、活率以及存活時間等的影響，篩選雞精液最佳基礎冷凍保護劑，為雞種質資源的收集與保護奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 公雞來源 本研究使用的6 只公雞來源于上海市農業科學院莊行綜合試驗站，品種為廣西容縣霞煙雞，22～30 周齡，健康狀況良好，精液質量穩定。

1.1.2 主要試劑 除特殊說明外，所有試劑均購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 精液采集 采用腹背按摩法[7]收集精液，將無糞便、雜物和血液污染的精液放入37 ℃水浴，鏡檢活力＞70 %的精液用于后續試驗。在運輸途中盡量避免劇烈晃動和陽光直射。

1.2.2 稀釋液的配制 6 種基礎稀釋液分別為LR[9]稀釋液、Lake’s[10]稀釋液、BPSE[11]稀釋液、Modified Sasaki[12]稀釋液、Beltsville[13]稀釋液和Nabi[14]稀釋液，組成成分詳見表1。冷凍稀釋液在基礎稀釋液的基礎上添加終含量為6%二甲基乙酰胺（dimethylacetamide，DMA）[15]。

表1 不同基礎稀釋液的配方Table 1 Formulations of different basic diluent

1.2.3 精液的稀釋與平衡 采用兩步法稀釋精液，首先將鏡檢合格精液混合（每次試驗混合不少于5 只），測量體積后按照試驗分組分為若干等分，按照1∶2 的稀釋比例加入等溫預熱的基礎稀釋液，用10層紗布包裹，避光放入4 ℃冰箱中平衡1 h[16]，再按照1∶1 的比例加入4 ℃預冷的冷凍稀釋液，繼續平衡10 min后裝管冷凍。

1.2.4 精液冷凍 將灌裝封口的0.5 mL 細管放入程序冷凍儀（Planer 公司，型號：Kryo 560-16）中并設定：5～-35 ℃時的降溫速率為7 ℃·min-1，-35～-120 ℃的降溫速率為9 ℃·min-1[17]，待冷凍結束后迅速投入到液氮中保存。

1.2.5 精液解凍 將裝有精液的0.5 mL 細管從液氮中取出，迅速置于37 ℃水浴鍋中30 s 水浴解凍，解凍后用對應的37 ℃基礎稀釋液按1∶1 的比例稀釋，并按照試驗設計的不同保存溫度（4 和37 ℃）和時間（0、15、30、45、60、90 和120 min）進行各項精液指標檢測，每組實驗至少重復3次，每次每組至少解凍2管。

1.3 精子質量檢測

1.3.1 精子活率與活力檢測 取10μL 解凍后的精液制片，使用精液自動分析儀在顯微鏡下隨機選取5 個視野觀察，使用Andro Vision 精液分析儀測定精子活力和活率。

1.3.2 精子質膜完整率檢測 采用低滲腫脹法（hypoosmotic swelling test，HOST）檢測精子質膜完整性[18]。配制HOST 低滲溶液，取10μL 精液樣品添加到100μL 等溫HOST 低滲溶液中，37 ℃水浴10 min，于光學顯微鏡下隨機觀察不少于4 個視野，統計精子數不少于200 個，統計彎尾精子數和總精子數。兩者間的比值即為精子質膜完整率。

1.3.3 精子頂體完整率檢測 采用吉姆薩染色法測定精子頂體完整率[19]。取適量解凍后精子涂片，風干。甲醛固定15 min后沖洗干凈，吉姆薩溶液染色12 h，沖洗干凈，風干后鏡檢。精子頂體結構明顯染色，頂體完整、外形正?；蝽旙w輕微膨脹為頂體完整精子，頂體嚴重膨脹或頂體脫落為頂體畸形精子[20]，于光學顯微鏡下隨機觀察不少于4個視野，統計精子數不少于200 個，頂體完整精子數和總精子數兩者之間的比值即為精子頂體完整率。

分別使用碧云天的試劑盒檢測凍后精子的丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。

1.3.4 精子線粒體活性檢測 采用羅丹明123（rhodamine 123,Rh123）染色檢測線粒體活性。取50 μL 精液樣本加入終濃度為100 nmol·L-1的染料，在暗處于37 ℃處理30 min。精子尾部呈現綠色熒光有線粒體活性，在熒光相差顯微鏡下觀察不少于4 個視野，統計精子數不少于200 個，統計尾部呈現綠色熒光的精子數、總精子數，兩者間的比值即為線粒體活性比值。

1.4 統計分析

采用SPSS 22.0軟件進行數據整理和分析。

2 結果與分析

2.1 不同冷凍稀釋液對雞精液凍后質量的影響

精子解凍后立即對其進行活率、活力和頂體完整率的檢測，結果（表2）表明，6 種不同稀釋液之間存在顯著性差異（P＜0.05）。在活率方面，Lake’s和LR稀釋液的凍后精子活率最高；Nabi次之；Beltsville最低。在活力方面，Lake’s和Nabi稀釋液的凍后精子活力最高，分別為45.70%和43.60%，顯著高于其他稀釋液。在頂體完整率方面，Lake’s 稀釋液最高，為45.26%；LR 和Nabi 次之，分別為41.33%和40.56%；Beltsville 最低，僅20.96%。綜上所述，Lake’s 稀釋液凍后精子的活率、活力和頂體完整性較高，Nabi次之；LR 雖獲得了較高的凍后活率，但精子活力較低；Beltsville稀釋液的冷凍效果最差。

表2 不同稀釋液下雞凍精的質量Table 2 Quality of frozen chicken semen in different diluents

2.2 不同保存溫度對3種冷凍稀釋液凍后精子活率和活力的影響

由于BPSE、Modified Sasaki、Beltsville3 種基礎稀釋液雞精子凍后的活力和活率較低，因此，后續試驗僅對LR、Lake’s、Nabi 基礎稀釋液進行比較。

2.2.1 37 ℃條件下3種稀釋液凍后精子的活率和活力 LR、Lake’s、Nabi 稀釋液解凍后精子在37 ℃、2 h 內的活率和活力如圖1 所示。在活率方面，LR 和Lake’s 稀釋液凍后精子的活率在解凍初始時顯著高于Nabi 稀釋液；但隨著保存時間的延長，LR 稀釋液的精子活率明顯下降，15 min 后顯著低于Lake’s 和Nabi 稀釋液。在活力方面，LR 和Nabi 稀釋液凍后精子活力在解凍初始時顯著低于Lake’s；隨著保存時間的延長，LR 稀釋液精子的活力則迅速下降，在15 min 后均顯著低于Lake’s 和Nabi 稀釋液；保存30～90 min，Nabi 稀釋液的精子活力略高于Lake’s，但差異不顯著；保存120 min后，Nabi稀釋液的精子活力高于Lake’s和LR。由此表明，Nabi 稀釋液在37 ℃條件下表現最佳，Lake’s稀釋液次之，LR稀釋液最差。

圖1 37 ℃條件下下3種稀釋液凍后精子的活率和活力Fig.1 Viability and motility of sperm frozen by 3 dilutions at 37 ℃

2.2.2 4 ℃條件下3 種稀釋液凍后精子的活率和活力 LR、Lake’s、Nabi 稀釋液解凍后精子在4 ℃、2 h 內的活率和活力如圖2 所示，3 種稀釋液均表現為隨著保存時間的延長，精子的活率和活力呈下降趨勢。其中，LR 稀釋液下降趨勢最為明顯，Lake’s稀釋液次之，Nabi稀釋液的耐保存性能最佳。在4 ℃保存條件下，Lake’s 和Nabi 稀釋液凍后精子的活率和活力隨著保存時間的延長均無顯著差異，其精子活率在保存60 min 后分別為31.75 %和31.60 %，活力在保存45 min 也仍保持在30%以上。與37 ℃保存相比較，4 ℃保存可使精子保持更高的活率和活力。

圖2 4 ℃條件下3種稀釋液凍后精子的活率和活力Fig.2 Viability and motility of sperm frozen by 3 dilutions at 4 ℃

2.3 不同保存溫度對凍后精子線粒體活性和質膜完整性的影響

不同溫度保存下凍后精子線粒體活性如表3所示。解凍初始，LR、Lake’s 和Nabi 稀釋液中高線粒體活性的精子比例分別為43.52%、43.72%和41.27%，三者間差異不顯著（P＞0.05）。在37 ℃條件下保存15和30 min時，Lake’s和Nabi稀釋液中精子的線粒體活性均顯著高于LR 稀釋液（P＜0.05）。在4 ℃條件下保存30 min 后，Lake’s和Nabi 稀釋液中精子的線粒體活性分別為32.09%和31.00%，顯著高于LR（P＜0.05），且明顯高于37 ℃條件下精子的線粒體活性（25.42%，27.17%和21.02%）。綜上所述，隨著保存時間的延長，3 種稀釋液中精子的線粒體活性均呈下降趨勢，而37 ℃條件下保存，降幅更大。多因素方差分析結果顯示，稀釋液類型、保存溫度和保存時間對凍后精子的線粒體活性影響極顯著（P＜0.01）。

不同溫度保存下凍后精子的質膜完整性如表3 所示。解凍初始，LR 和Lake’s 稀釋液精子的質膜完整率顯著高于Nabi 稀釋液。在37 ℃條件下保存15 和30 min，Lake’s 和Nabi 稀釋液中精子的質膜完整率均顯著高于LR 稀釋液（P＜0.05）。在4 ℃條件下保存30 min 后，Lake’s 稀釋液中精子的質膜完整率為37.56%，顯著高于Nabi 和LR 稀釋液（P＜0.05），且明顯高于37 ℃保存條件下的質膜完整率。綜上所述，隨著保存時間的延長，3 種稀釋液的質膜率均呈下降趨勢，而37 ℃條件下保存，降幅更為明顯。多因素方差分析結果顯示，稀釋液類型、保存溫度和保存時間對凍后精子的質膜完整性影響極顯著（P＜0.01）。

表3 不同保存溫度條件下3種稀釋液凍后精子的線粒體活性、質膜完整性Table 3 Mitochondrial activity and plasma membrane integrity of sperm frozen by 3 dilutions at different storage temperatures

2.4 不同保存溫度對不同稀釋液精液抗氧化性的影響

不同保存溫度下凍后精液的抗氧化性如表4所示。在MDA 含量上，Lake’s稀釋液凍后精液在初始解凍時MDA 含量最低，為7.23 nmol·L-1，但與LR 和Nabi 稀釋液差異不顯著（P＞0.05）；隨著保存時間的延長，3 種稀釋液的MDA 含量均呈上升趨勢；Lake’s 稀釋液處理的精液在37 和4 ℃條件下保存30 min 后，MDA 含量分別為10.43 和9.73 nmol·L-1，均顯著低于LR 和Nabi 稀釋液，且4 ℃條件下保存時，MDA 含量的上升速度較慢。在SOD 活性上，Lake’s 稀釋液凍后精液在初始解凍時SOD 活性最高，為119.72 U·mL-1，但與LR 和Nabi 稀釋液差異不顯著（P＞0.05）；隨著保存時間的延長，3 種稀釋液的SOD 活性均呈下降趨勢；Lake’s 和Nabi 稀釋液處理的精液在37 和4 ℃條件下保存30 min 后，SOD 活性分別為102.02、103.26 和109.91、113.05 U·mL-1，均顯著低于LR稀釋液（P＜0.05）；且4 ℃保存時SOD 活性的下降速度變慢。多因素方差分析結果顯示，稀釋液種類、時間和溫度間的互作對精液SOD 活性影響極顯著（P＜0.01）。

表4 不同保存溫度條件下3種稀釋液凍后精子的丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性Table 4 MDA content and SOD activity of sperm frozen by 3 dilutions at different storage temperatures

3 討論

稀釋液組成與精子凍后保存效果關系密切。本研究對6 種稀釋液凍后精子的活率、活力等指標進行分析比較，Lake’s稀釋液凍后精子的活率、活力、頂體完整性、質膜完整性、線粒體活性優于其他稀釋液；Nabi 稀釋液的凍后活率、活力低于Lake’s 和Nabi 稀釋液，但其表現為最佳的凍后耐保存性。由此說明，稀釋液保存效果的優劣與稀釋液的成分、滲透壓、pH等關系密切。

3.1 滲透壓對雞精子凍后活率、活力的影響

滲透壓是雞精液冷凍稀釋液的重要參數，一般為295～360 mOsm·kg-1。張兆旺等[21]研究表明，在等滲或接近等滲的稀釋液中雞精子凍后效果最優。王世銀等[22]研究表明，滲透壓為360～440 mOsm·kg-1時更有利于雞精液冷凍保存時精子的存活和保存后的受精力。合適的滲透壓可以緩解冷凍和解凍過程對精子造成的損傷。本研究中，冷凍效果較好的Lake’s和Nabi稀釋液的滲透壓分別為333 和310 mOsm·kg-1，屬于較低的滲透壓；Modified Sasaki稀釋液的滲透壓為415 mOsm·kg-1，凍后精子的活率和活力均顯著低于Lake’s 和Nabi 稀釋液，由此推測，較高的滲透壓可能不利于雞精液的冷凍保存。

3.2 pH對雞精子凍后活力、活率的影響

精液稀釋液的pH 對精子保存非常重要。精子運動性強，能量消耗快，因此，產生的大量代謝物使精液pH 降低，從而抑制一些酶活性，導致精子活力、活率降低，影響其受精能力[23]。丁瑜[24]認為pH 過高會影響精液凍后活性。一般雞精液稀釋液的pH 為7.2～7.6。姚希芳[25]研究顯示，當pH為6.7～7.2 時，精子存活時間最長。在本試驗中，冷凍效果最好的LR、Lake’s 和Nabi 稀釋液的pH分別為7.0、7.0 和7.4，均屬于較為理想的稀釋液pH；Nabi 稀釋液表現為最佳的凍后耐保存性能，可能與其pH 較高有關；Beltsville 稀釋液的pH 為7.5，其冷凍效果較差，由此推測，較高的pH 可能不利于提高家禽的精液冷凍保存效果。

3.3 稀釋液成分對雞精子凍后活力、活率的影響

不同稀釋液成分對精子凍后活力、活率的影響不同。楊小霞等[26]和金美林等[27]研究顯示，在稀釋液中添加果糖比添加葡萄糖效果好。張兆旺[28]研究表明，在稀釋液中添加谷氨酸鈉對精液有保護作用。王世銀等[29]研究顯示，稀釋液中的糖類物質對精子質膜起到保護作用。姚希芳[25]研究顯示，糖類物質和谷氨酸鈉能夠給精子提供能量，并對精子起到保護作用。王秀萍等[30]研究表明，少量的K+可延長精子的壽命。張彩云等[31]研究表明，過量K+會抑制精子活性，影響精子活力。Mg2+是參與多種酶促反應的重要輔因子，在精子發生和調節精子活力中發揮重要作用。在本研究中，BPSE 稀釋液中K+過高，且Mg2+缺乏；Lake’s、Nabi和LR稀釋液中K+和Mg2+含量適中，有利于凍后精子保有較高的活力、活率和頂體完整性。

3.4 保存溫度對雞精子凍后活力、活率的影響

在精液保存過程中，溫度對精子的保存效果有重要影響。雞精子運動較快，呼吸作用會產生大量代謝物，低溫保存可抑制精子活性，使精子活動減弱，降低代謝速率，從而減少酸性物質的累積[32]。1967 年，Van Wambeke[33]首次證明精子在5 ℃下保存24 h 后仍具有受精能力。姚希芳[25]和張兆旺等[21]證明雞精液在3～5 ℃中保存效果最優。本研究比較了Lake’s、Nabi、LR 3種稀釋液凍后在4和37 ℃保存下精子的活性，結果表明，保存于4 ℃條件下的精子在活率、活力、頂體和質膜完整性等均高于37 ℃。

3.5 不同稀釋液對精子抗氧化指標的影響

精子在冷凍保存過程中，細胞內外環境會發生較大變化，導致精子產生過量的活性氧，破壞精子自身的抗氧化系統。適當的pH 和滲透壓有利于維持精子正常的代謝活動，減少精子的氧化損傷。王世銀等[32]研究表明，稀釋液中緩沖物質濃度過低或過高都會使精子受到損傷，從而增加精子畸形率，破壞精子自身的抗氧化系統。精液中添加磷酸鹽、檸檬酸鹽等成分可抵消精子代謝產生的大量酸性物質[34]，減少精子的氧化損傷。隨著凍后精液保存時間的延長，如保存溫度過高，精子代謝會消耗大量能量物質，同時也會產生大量的代謝廢物，如乳酸、活性氧等，進而影響精子活力和受精能力[25,35]。本研究表明，Lake’s稀釋液在抗氧化性能上優于其他稀釋液，且4 ℃條件保存優于37 ℃保存。