多花黃精種子層積過程生理變化研究

張武君，趙云青，劉保財，陳菁瑛 ，黃穎楨，程遠航

（1.福建省農業科學院農業生物資源研究所，福建 福州 350003；2.福建省農業科學院藥用植物研究中心，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意義】多花黃精（Polygonatum cyrtonemaHua）為百合科黃精屬多年生草本植物，以干燥根莖入藥，其性甘平，歸脾、肺、腎經，具有補氣養陰，健脾，潤肺，益腎之功效，用于治療脾胃氣虛、胃陰不足，肺虛燥咳，精血不足，須發早白，內熱消渴等疾病[1]，是傳統經典的藥食兩用植物?，F代研究也表明其含多糖、甾體皂苷類、黃酮類、苯丙素類、生物堿類等多種成分，具有抗氧化、抗骨質疏松、抗腫瘤等廣泛藥理作用[2]。近年來，隨著黃精需求量的不斷增加，野生資源銳減，已不能滿足市場需求，因此各地開始對黃精進行人工栽培，目前主要采用塊莖和種子進行繁殖。塊莖繁殖應用較多，但其繁殖系數低，且存在多代繁殖后品質嚴重退化的問題[3]；種子繁殖具有繁殖系數高的優點，但其種子休眠周期長、成苗率低，嚴重影響了多花黃精種子育苗產業發展。研究多花黃精種子層積過程的生理變化，從而了解多花黃精種子萌發調控，對多花黃精產業發展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】已有研究表明多花黃精種子休眠由種皮[4]、胚[5]、 胚乳[6]、內源抑制物[7]等因素共同作用所致，戶外自然變溫沙藏或4 ℃低溫層積4—5月基本能打破休眠[8-9]，王占紅等[10]研究認為去果皮戶外沙藏效果更好，陳松樹等[11]認為從育苗質量和管理成本考慮，建議多花黃精果實采摘搓洗后的種子和濕沙混勻放在室外貯藏，待次年2月底播種較好?！颈狙芯壳腥朦c】陳怡等[9,12]研究表明黃精 在4 ℃濕沙層積和28 ℃催芽萌發條件下的內源激素吲哚-3-乙酸(IAA)、反式玉米素核苷(tZR)、赤霉素A3(GA3)、脫落酸(ABA)，淀粉酶、抗氧化酶、葡萄糖-6-6磷酸脫氫酶（G-6-PDH）等酶活性，可溶性糖、可溶性蛋白、淀粉等貯藏物質的變化。成京晉等[13]研究表明黃精在20℃、4 ℃和20 ℃與4 ℃交替等3種溫度模式下濕沙層積70 d的內源激素IAA、CTK、GA3、ABA的變化，在自然變溫條件下濕沙層積至種子大量萌發過程的生理變化、多花黃精層積過程中茉莉酸類、水楊酸類及乙烯類內源激素含量變化左究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究采用濕沙層積的方法，探究在自然變溫條件下多花黃精種子從采后到大量萌發5個月間的主要貯藏物質含量及酶活性變化，并采用超高效液相色譜-三重四極桿離子阱質譜聯用（UHPLC-QTRAP-MS/MS）技術，測定7類共17種內源激素含量變化，研究自然變溫條件下多花黃精萌發過程的生理變化，為縮短多花黃精種子萌發時間、提高萌發率的技術提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器 UV-1780分光光度計(日本SHIMADZU公司)；SCIEX 6500 QTRAP+三重四極桿質譜儀（美國SCIEX公司）；ExionLC System超高效液相色譜儀（美國SCIEX公司）；2.1 mm×150 mm， 1.7 μm Acquity UPLC CSH C18色譜柱（美國Waters公司）；JXFSTPRP-24研磨儀（上海凈信科技有限公司）；YM-080S超聲儀（深圳市方奧微電子有限公司）；12 position固相萃取儀（德國 CNW Technologies公司）；Oasis?PRiME HLB 1cc（30 mg）SPE固相萃取小柱（美國Waters公司）。

1.1.2 試劑 植物淀粉含量試劑盒、植物纖維素含量試劑盒、可溶性糖含量試劑盒、BCA法可溶性蛋白含量試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性試劑盒、過氧化物酶(POD) 活性試劑盒、過氧化氫酶(CAT)活性試劑盒、α-淀粉酶試劑盒、β-淀粉酶試劑盒、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6-PGDH) 試劑盒、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶（NADK）活性試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）；3-吲哚丁酸（批號G162446，德國DR.E公司）；順式玉米素（批號001-0321，捷克Olchemim公司）；3-吲哚乙酸、水楊酸（美國Merck-SIGMA公司）；3-吲哚甲醛（梯希愛上?；晒I發展有限公司）；吲哚-3-乙酸甲酯、異戊烯基腺苷、反式玉米素核苷、反式-玉米素、激動素、赤霉素A1、赤霉素A4、赤霉素A7、（±）-茉莉酸（+）-脫落酸（加拿大TRC公司）；二氫茉莉酸、N6-異戊烯基腺嘌呤（上海安譜實驗科技股份有限公司）；二氫玉米素、（±）-茉莉酸-異亮氨酸、茉莉酮酸甲酯、水楊酸甲酯、1-氨基環丙烷羧酸（上海甄準生物科技有限公司，試劑純度均大于98%）；赤霉素 A3（捷克Olchemim公司，純度＞90%）；試驗用水為超純水；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純（德國CNW Technologies公司），其余試劑均為分析純。

1.1.3 種子材料 試驗材料（自然成熟的果實）于2019年10月15日采自福建省邵武市和平鎮多花黃精種植基地，經福建省農業科學院陳菁瑛研究員鑒定為多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua。

1.2 試驗方法

1.2.1 多花黃精種子處理及取樣 果實發酵1周后，揉搓去掉果皮、果肉，漂洗干凈，拌5倍體積細河沙層積，細河沙濕度約30%左右、以手握成團一觸即散為度。層積處理的種子放置于室外避雨處，定時少量補水以維持沙子的濕度，每隔1個月取樣15 g，平均分成6份，每份2.5 g，液氮速凍后-80 ℃保存備用，樣品信息見表1，層積期間氣溫變化見圖1。

表1 樣品信息Table 1 Information on specimens

圖1 多花黃精種子層積期間氣溫變化Fig.1 Temperature changes during P.cyrtonema seeds stratification

1.2.2 貯藏物含量及酶活力變化測定 取每階段多花黃精種子-80 ℃凍存鮮樣3份，研磨粉碎后稱取適量測定淀粉、纖維素、可溶性糖（SS）、可溶性蛋白（SP）含量，以及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶 (POD)、過氧化氫酶(CAT)、α-淀粉酶、β-淀粉酶，6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6-PGDH)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶（NADK）活性，按照對應試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 內源激素提取 取每階段多花黃精種子-80 ℃凍存鮮樣3份，加入液氮采用研磨儀60 Hz研磨60 s后，精密稱取25 mg粉碎后的樣品，加入1 000 μL-40 ℃預冷的含同位素內標混合物50%乙腈水溶液，渦旋30 s，冰水浴超聲5 min；40 Hz研磨4 min，冰水浴超聲5 min，重復2次；10 000 r·min-14 ℃離心15 min；采用固相萃取小柱純化收集洗脫液并氮氣吹干，用100 μL 10%乙腈水溶液復溶，60 Hz勻漿 4 min，冰水浴超聲 5 min；12 000 r·min-14 ℃ 離心10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.2.4 內源激素測定 使用EXIONLC System超高效液相色譜儀，液相色譜柱為Acquity UPLC CSH C18（150 mm× 2.1 mm，1.7 μm）；流動相水（含0.01%甲酸）（A）-乙腈（含0.01%甲酸）（B）進行梯度洗脫（0～2.0 min，95% A；2.0～11.0 min，95%～43%A；11.0～11.1 min，43%～1% A；11.1～12.5 min，1% A；12.5～12.6 min，1%～95% A；12.6～15.0 min 95% A）；柱溫 50°C，流速 0.4 mL·min-1，樣品盤設為4°C，進樣量為 5 μL。使用裝備 IonDrive Turbo V ESI離子源的SCIEX 6500 QTRAP+三重四極桿質譜儀，以多反應監測（MRM）模式進行質譜分析。離子源參數：離子化電壓=±4 500 V，離子源溫度475 ℃，氣簾氣壓力：40 psi，噴霧氣：30 psi，輔助加熱氣：30 psi。將目標化合物標準溶液引入質譜中，針對每個目標化合物，選取信號強度最高的數個母離子-子離子對（transition），對其MRM參數進行優化，并選取其中響應最好的離子對用于定量分析，具體參數見表2，使用SCIEX Analyst Work Station Software（Version 1.6.3）和Sciex MultiQuant? 3.0.3進行質譜數據采集及目標化合物定量分析。

表2 23種目標成分測定中優化的質譜條件參數Table 2 Optimized MS/MS parameters on 23 components

1.2.5 內源激素方法學考察 參考?imura等[14]的方法，結果表明，色譜峰峰面積與化合物濃度間呈良好的定量關系，相關系數（r）均大于0.996。精密度、重復性、穩定性的方法學考察的標準相對偏差（RSD）值均小于3.03%；平均回收率為96.78%～113.82%，RSD值均小于10.28%，該方法能夠準確可靠地檢測出樣品中的目標激素含量。

1.3 數據統計與分析

采用Excel 2010 軟件進行數據整理、繪圖，應用SPSS 19.0軟件進行多重比較和雙變量相關性分析，差異顯著性檢驗采用Duncan’s法，相關性采用Pearson相關系數表示。

2 結果與分析

2.1 貯藏物質含量變化

2.1.1 淀粉含量變化 淀粉含量變化是種子代謝狀況的重要指標。層積過程多花黃精種子的淀粉含量呈連續下降的趨勢（圖2-A），2019-10-23含量為85.4 mg·g-1，2020-03-23 降至 57.5 mg·g-1，較層積初始下降了32.7%，表明層積階段多花黃精種子淀粉持續分解，為貯藏和萌發提供能量。

2.1.2 纖維素含量變化 纖維素是植物細胞壁的主要結構成分。層積過程多花黃精種子的纖維素含量呈持續下降的趨勢（圖2-B）。層積第一個月下降較快，2019-10-23 時含量為 263.5 mg·g-1，2020-11-23 降至225.2 mg·g-1，下降了14.55%，之后降幅不顯著，2020-03-23較層積初始下降了19.8%，表明層積階段多花黃精細胞壁發生降解弱化，并為貯藏和萌發提供能量。

2.1.3 可溶性糖含量變化 SS在種子萌發過程中可作為直接能量來源，同時又參與滲透調節，與抗寒性相關[15]。層積過程多花黃精種子的SS含量呈降-升-降-升的趨勢（圖2-C），2019-11-23降至18.8 mg·g-1，可能是層積過程呼吸作用消耗所致；之后受環境低溫影響緩慢上升，2020-01-23升至28.8 mg·g-1；2020-02-23小幅下降；萌發后由于貯藏的淀粉大量分解，SS含量迅速上升至35.1 mg·g-1，較最低值提高了86.14%，表明SS含量變化與抗寒和萌發物質動員有關。

2.1.4 可溶性蛋白含量變化 SP多數是參與各種代謝的酶類，也是重要的滲透調節物質和營養物質，SP的積累有利于抗寒性的提高[16]。層積過程多花黃精種子的SP含量呈下降-上升-下降的趨勢（圖2-D），2019-11-23較2019-10-23下降了13.8%，可能是由于層積過程部分SP轉化成貯藏蛋白；之后緩慢上升，2020-01-23 達到最高值，為 47.9 mg·g-1，2020-01-23至2020-02-23受環境低溫影響維持在較高水平；萌發后迅速降至24.1 mg·g-1，較最高值降低了49.8%，這主要是新組織形成和分化的消耗造成，表明SP含量變化與抗寒和萌發物質動員有關。

圖2 多花黃精種子層積過程貯藏物質含量變化Fig.2 Changes on accumulated substances in P.cyrtonema seeds during stratification

2.2 酶活力變化

2.2.1 保護酶活性變化 SOD、POD、CAT是植物細胞內較為重要的保護酶，它們協調作用，防止細胞內活性氧水平過高，低溫脅迫可誘發酶活性上升[16]。層積過程多花黃精種子的SOD、POD活性變化趨勢均為降-升-降，CAT活性變化趨勢為先升后降（圖3-A、B、C）。2019-11-23時，SOD、POD酶活性較2020-10-23顯著下降，CAT酶活性較2020-10-23略有上升但不顯著，之后3個保護酶活性持續上升，2020-01-23達到最大值后持續下降。2020-01-23時3個保護酶活性升高至峰值，很可能受到環境低溫的影響。

圖3 多花黃精種子層積過程期SOD、POD、CAT活性變化Fig.3 Changes on SOD, POD, and CAT activities in P.cyrtonema seeds during stratification

2.2.2 淀粉酶活性變化 淀粉酶根據作用的方式可分為α-淀粉酶與β-淀粉酶，二者共同將淀粉分解成麥芽糖、葡萄糖、糊精等可溶性糖類物質。后熟過程多花黃精種子的α-淀粉酶活性變化趨勢為降-升-降-升變化，β-淀粉酶活性呈升-降-升變化，二者均在2020-01-23和2020-03-23活性顯著提高，與SS含量的變化趨勢相同，表明SS含量變化與淀粉酶作用密切相關。（圖4-A、B）。

圖4 多花黃精種子層積過程α-淀粉酶、β-淀粉酶活性變化Fig.4 Changes on α- amylase and β-amylase activities in P.cyrtonema seeds during stratification

2.2.3 6-PGDH和NADK活性變化 許多休眠種子的休眠解除都檢測到與磷酸戊糖途徑（PPP）有關[17]，6-PGDH是PPP的關鍵限速酶，能夠催化6-磷酸葡萄糖脫氫，形成6-磷酸葡糖酸，同時將NADP+還原為NADPH，用于脂肪酸等的還原性生物合成。后熟過程多花黃精種子6-PGDH活性變化趨勢為升-降-升（圖5-A），2019-11-23活性較2019-10-23顯著升高，表明采后1個月種子內部仍在進行較強的還原性生物合成；2019-11-23至2020-02-23活性持續下降，2020-02-23降至最低，表明萌發前物質合成作用不斷減弱；2020-03-23的升高則表明萌發后隨著新組織形成，生物成合成作用再次加強。NADK能催化NAD+磷酸化，生成NADP+，其活性增加有利于抑制電子傳遞，降低呼吸作用[18]。多花黃精種子NADK活性變化趨勢為降-升-降（圖5-B），2019-10-23至2020-01-23變化較為平緩；2020-02-23迅速升高后大幅下降，表明萌發前的呼吸代謝受到明顯的抑制；萌發后NAD激酶活性大幅下降，表明萌發后電子傳遞活躍，呼吸作用增強。

圖5 多花黃精種子層積過程6-PGDH、NADK酶活性變化Fig.5 Changes on 6-PGDH and NADK activities in P.cyrtonema seeds during stratification

2.3 營養物質與酶活力含量相關性

由表3可知，纖維素含量與淀粉含量呈顯著正相關；SS含量與α-淀粉酶、β-淀粉酶活性之間均呈極顯著正相關；淀粉含量與SS含量、α-淀粉酶、β-淀粉酶活性呈顯著或極顯著負相關；SP含量與SOD、POD酶活性呈極顯著正相關，與β-淀粉酶、6-PGDH酶活性呈顯著負相關；SOD與POD、NADK酶活性呈極顯著正相關；POD和CAT酶活性呈極顯著正相關；NADK酶活性與SS含量、α-淀粉酶、β-淀粉酶活性呈顯著或極顯著負相關，與SP含量呈極顯著正相關；6-PGDH與NADK酶活性呈顯著負相關。表明纖維素和淀粉的變化趨勢相同，淀粉在淀粉酶的作用下轉化為SS，淀粉酶活性增強分解成SS表明呼吸作用加強，與NADK酶活性的作用相反，3個保護酶之間的變化有一定的正相關性。

表3 多花黃精種子層積過程貯藏物質與酶的相關性Table 3 Correlation between accumulated substances and enzymes of P.cyrtonema seeds during stratification

2.4 17種內源激素含量變化

基于UHPLC-QTRAP-MS/MS技術測定了多花黃精種子層積過程中6個不同時期的7大類23種內源激素含量，共測出17種內源激素，包括3種茉莉酸類、7種細胞分裂素類、3種生長素類，以及GA7、ABA、SA、ACC，結果見圖6～9。

2.4.1 茉莉酸類物質含量變化 茉莉酸類物質是參與調控種子萌發的一個重要內部因素，其與脫落酸(ABA)協同抑制種子的萌發[19]。由圖6可知，層積過程多花黃精種子的JA、JA-Ile含量變化均為先顯著升高后降低，且分別在2019-12-23和2020-01-23含量達到最高，較層積初始分別提高了6.0倍和9.6倍，H2-JA含量在前、中期較高，后逐漸下降。至萌發后 JA、JA-Ile已無法測出，僅能測出H2-JA。表明茉莉酸類物質通過在層積的前中期交替升高來維持種子的休眠狀態。

圖6 多花黃精種子層積過程茉莉酸類物質含量變化Fig.6 Changes on jasmonates content in P.cyrtonema seeds during stratification

2.4.2 細胞分裂素類物質含量變化 細胞分裂素(CTK)能通過與乙烯、ABA、生長素、赤霉素（GAS）等相互作用影響種子的萌發和幼苗早期發育[20-21]。由圖7可知，層積過程多花黃精種子的IPA、K、tZ、cZ、dh-Z含量均呈連續下降的趨勢，IP、tZR含量在 2019-10-23分別為 10.3、10.9 nmol·kg-1，之后連續緩慢下降，2020-02-23分別降至2.6、3.7 nmol·kg-1，萌發后分別快速升高至 21.3、8.6 nmol·kg-1，分別較2020-02-23上升了7.3、1.3倍，表明IP、tZR促進萌發。

圖7 多花黃精種子層積過程細胞分裂素類物質含量變化Fig.7 Changes on cytokinins content in P.cyrtonema seeds during stratification

2.4.3 生長素類物質含量變化 由圖8可知，多花黃精種子的IAA含量在層積一個月后從1 775.4 nmol·kg-1急劇下降至 263.1 nmol·kg-1，較層積初始下降了85.18%，至萌發前變化較為平緩；ICA、ME-IAA在采收后同樣呈下降趨勢，表明生長素類含量在層積過程中降低。萌發后由于胚的生長，IAA顯著升高至1 211.4 nmol·kg-1，較 2020-02-23 上升了 5.3 倍； ICA顯著升高至 148.4 nmol·kg-1，較 2020-02-23 上升了2.6倍，表明ICA、IAA促進萌發。

圖8 多花黃精種子層積過程生長素類物質含量變化Fig.8 Changes on auxins content in P.cyrtonema seeds during stratification

2.4.4 GA7含量變化 GA在種子萌發過程中起到增加胚的生長勢和弱化包圍胚根的屏障組織作用[22]。本研究測定了GA1, GA3, GA4和 GA7，僅測出GA7含量。由圖9-A可知，層積過程多花黃精種子的GA7含量呈上升趨勢。2019-10-23時含量僅為6.0 nmol·kg-1，2020-02-23升至231.7 nmol·kg-1，較層積初始上升了37.4倍，剛萌發時升至1 897.1 nmol·kg-1，較2020-02-23提高了7.2倍，表明GA7促進休眠解除和萌發。

圖9 多花黃精種子層積過程赤霉素A7、脫落酸、水楊酸、1-氨基環丙烷羧酸含量變化Fig.9 Changes on GA7, ABA, SA, and ACC contents in P.cyrtonema seeds during stratification

2.4.5 ABA含量變化 ABA是種子休眠誘導和維持的正調控因子，萌發的負調控因子[23]。由圖9-B可知，層積過程多花黃精種子的ABA含量呈連續下降趨勢。層積第一個月ABA含量從226.3 nmol·kg-1下降至69.4 nmol·kg-1，較層積初始下降了69.3%，剛萌發時降至27.3 nmol·kg-1，較層積初始下降了87.9%，表明ABA含量下降促進休眠解除和萌發。

2.4.6 SA含量變化 SA是一種酚類激素，不僅可以誘導植物抗逆反應，還具有促進種子萌發和幼苗生長的作用[24]。由圖9-C可知，的SA含量在萌發前呈小幅波動趨勢，萌發后急劇上升，較2/23未萌發時上升了12.4倍，表明SA促進萌發。

2.4.7 ACC含量變化 ACC為高等植物內源乙烯的前體物質，在氧化酶的作用下轉化為乙烯[25]。由圖9-D可知，層積過程多花黃精種子的ACC含量呈連續上升趨勢。2019-10-23 時含量為 484.2 μmol·kg-1，2020-02-23 升至 658.3 μmol·kg-1，較層積初始上升了36.0%，剛萌發時急劇上升至 6 464.0 μmol·kg-1，較2020-02-23提高了8.8倍，表明ACC促進休眠解除和萌發。

3 討論與結論

3.1 層積對多花黃精種子貯藏物質含量與酶活性的影響

陳怡[12]測得剛采摘的多花黃精種子淀粉含量為42.12%，認為其種子為淀粉性種子，而本研究測得多花黃精種子淀粉、纖維素含量最高值分別為8.5%和26.4%，纖維素含量為淀粉的3倍以上。對于多花黃精同屬植物黃精（Polygonatum sibiricumRed.）的淀粉測定也有類似差異，張玉翠[26]測得黃精鮮種子的淀粉含量為30%～40%，而程秋香[27]測得鮮黃精種子的淀粉8.50%，纖維素含量高達32.10%，且認為纖維素等是胚乳的主要代謝物質。本研究測得多花黃精種子初始層積至萌發期間，淀粉和纖維素含量分別下降了32.7%和19.8%，認為二者均為種子的主要代謝物質。陳怡[12]測得的酶活性及貯藏物質的變化趨勢與本研究有較大不同，可能是層積溫度不同導致，本研究中SS、SP以及3種保護酶和淀粉酶含量均在2020-01-23的取樣中顯著提高，很可能是植物對低溫天氣的適應性生理反應，2019-12-23至2020-01-23期間的最低溫達到了0 ℃，為全年最低。冷害脅迫可導致植物活性氧的增加[28]，而活性氧在種子萌發和休眠解除方面發揮著重要的信號作用[29]，活性氧參與生長組織的細胞壁松弛，分解細胞壁多糖、調節激素在細胞生長中的作用[30]，推測低溫處理有助于多花黃精種子的休眠解除。

3.2 層積對多花黃精種子內源激素含量的影響

成京晉等[13]測定了層積前70 d的種子IAA、GA3、CTK和ABA的含量變化，測定結果多為波動變化，無明顯變化規律。陳怡等[9]采用HPLC-MS的檢測方法，測定了多花黃精種子萌發過程的IAA、GA3、tZR和ABA含量變化，其中在層積至剛萌發階段，ABA含量呈連續下降趨勢與本研究相同，IAA、tZR含量變化趨勢為層積中期達到最高值與本研究不同，GA3含量的變化規律與本研究測得的GA7變化規律相同，但本研究未測得GA3含量，可能的主要原因是層積溫度以及測定方式的不同，其在種子洗去外種皮后有一個晾干水分備用的過程，且采用4 ℃低溫層積，而本研究在洗去外種皮后立即采用自然變溫沙藏，且本研究由于同時測定多個指標，具有一定的側重性和偏向性，無法測得含量相對較低的個別指標，但仍可表明多花黃精種子層積至萌發過程中GA7含量高于GA3含量。

多花黃精種子萌發過程中的茉莉酸類物質含量變化尚未見報道。茉莉酸可被甲基化為其揮發性對應物Me-JA，或與各種糖和氨基酸結合，其中以JAIle含量最為豐富[31]。Pan等[32]發現一種JA-Ile的結構類似物能顯著增強ABA對種子萌發的抑制效應，并揭示了擬南芥種子萌發過程中茉莉酸鹽對脫落酸信號協同作用的分子機制。Wang等[33]研究發現ABA促進JA的生物合成，協同抑制水稻種子發芽。本研究測得的H2-JA、JA、JA-Ile分別在ABA含量大幅下降后陸續提高，在萌發前降至較低值，表明茉莉酸類物質同樣協同ABA抑制多花黃精種子萌發。有報道，Me-JA能抑制玉米種子[34]、黃色羽扇豆[35]等種子的萌發，但本研究并未測得Me-JA，表明Me-JA不是多花黃精種子休眠中的主要調控物質。

高等植物中的CTK以IP、tZ、cZ、dh-Z、K，以及tZ和IP型糖的結合物tZR和IPA較為常見，它們在不同植物和組織發育階段的分布和作用不同，其中tZ型具有普遍的生物活性，cZ型活性較弱，但二者在植物界中廣泛存在，且cZ型是植物生長受限條件下CTK應答的精細調節因子[36-37]。本研究測得以上常見的7種CTK在多花黃精種子休眠階段含量均呈下降趨勢，萌發時僅IP和tZR含量顯著升高，表明IP和tZR為主要促進萌發的CTK。

植物生長素主要由吲哚類化合物組成，包括IAA、ICA、ME-IAA、IBA等，其中IAA為最主要的代表性成分。在擬南芥中，IAA在休眠過程中起正向調控作用，是第二類促進種子休眠的激素[38]。本研究發現，層積過程多花黃精種子的生長素類物質含量不斷下降，至萌發時再次上升，表明在多花黃精種子中生長素同樣有促進休眠的作用。

GA是一個四環二萜類的植物激素家族，目前已鑒定出136種GA結構，其中大多數GA是無生物活性的，主要的生物活性GA包括GA1，GA3，GA4和GA7

[22]。馬煥普等[39]發現，蘋果種子內不同種類GA的發生器官不同，子葉中以GA3為主，胚軸中以GA7為主， GA7可能通過促進胚軸中的合成代謝而直接參與胚軸休眠的解除，而GA3的變化受溫度影響較大，低溫處理后顯著升高。因此，陳怡[9]測得GA3可能與4 ℃低溫層積處理有關。此外，多花黃精種子萌發前胚呈棒狀[5]，并未分化出子葉結構，因此推測在萌發前起主要活性作用的GA可能是GA7。在美洲商陸種子萌發中也發現，外源GA7的刺激作用強于GA3[40]，表明不同赤霉素對萌發的促進效果不同。已有研究多采用GA3來促進多花黃精種子萌發[8]，而本研究測得層積過程內源GA7含量相對較高，推測外源施用GA7對多花黃精種子萌發有更好的促進效果。ABA和GAs拮抗調節種子休眠和萌發已被多項研究報道[41-42]，本研究發現多花黃精層積過程ABA含量下降，GA7含量上升，表明二者同樣起拮抗作用。

外源SA浸種處理能提高種子萌發后對寒冷、鹽、重金屬等非生物脅迫的耐受性[43-45]。本研究中SA含量在未萌發時變化較小，萌發后含量顯著升高，與葛娜等[46]對三七種子的研究結果相同。有報道在植物體內SA能大量轉變為Me-SA，二者在一定劑量下對擬南芥的萌發和初期生長有促進作用[47]。但本研究并未測得Me-SA，表明Me-SA可能在多花黃精種子的萌發過程中不是主要調控物質。

種子的萌發能力與乙烯的產生有關，ACC為乙烯前體物質，外源施用能明顯促進種子乙烯的生成及萌發[48-49]，因此，本研究中內源ACC含量的升高很可能伴隨著乙烯形成的增加，對休眠解除和萌發有促進作用。有研究表明ACC類似物乙烯利對打破黃精屬種子的休眠有一定效果[50]。

綜上，自然變溫層積期間，淀粉和纖維素均為多花黃精種子的主要代謝物質，保護酶、淀粉酶及SS、SP含量不斷變化，以適應溫度等環境變化、完成萌發所需的物質儲備，GA7、ACC含量不斷增加，ABA、茉莉酸類、生長素類等萌發抑制物含量下降。3月中下旬氣溫回升，多花黃精種子休眠解除開始大量萌發，內源激素GA7和ACC促進休眠解除和萌發；生長素ICA、IAA，細胞分裂素IP、tZR以及水楊酸促進萌發。因此，在多花黃精種子收獲后可采用洗去種皮果肉，室外保濕沙藏至2月底進行催芽，可采用ACC或GA7進行催芽，以加速打破休眠，萌發后根據生長情況采用生長素、細胞分裂素、水楊酸等物質進行組合調控，具體效果有待進一步研究。