Fe3O4納米酶對潛指印中物質信息的可視化識別

黃 銳, 周 毅

(1.西南政法大學刑事偵查學院,重慶 401120;2.重慶高校物證技術工程研究中心,重慶 401120;3.重慶高校刑事技術重點實驗室,重慶 401120)

0 引言

汗潛指印(潛指印),即通過手指汗孔分泌的汗液在載體上形成的實際存在而裸眼不易見的指印,是犯罪現場和日常生活中“常見”的指印遺留形態。汗液作為人體的重要代謝產物,包含了諸多代謝物質[1];根據洛卡德物質交換原理,指印中保留了接觸物的信息,即“觸物留痕”[2]。這兩個因素使得無處不在的潛指印不僅包含了認定遺留人身份的指紋二維形態信息,還隱藏了更高維的物質信息。在顯現潛指印形態的同時,挖掘其中的物質信息可進一步推斷更多的個體信息,如指印遺留時間、指印遺留人是否患病等[3]。另外,當指印紋線模糊殘缺時,對其中物質信息的挖掘具有重要意義。

潛指印中的物質分為外源性物質、內源性物質、半內源性物質[4]。外源性物質為“觸物留痕”所產生的指印中本身不存在的殘留物;內源性物質為指尖汗液中自然的分泌物;半內源性物質為吸食香煙、毒物或藥物等后指尖皮膚異常分泌的代謝物。對指印中物質成分的挖掘主要集中在外源性和半內源性物質,如Lees H等人對不同載體上指印中10種爆炸殘留物進行了定性和定量分析[5];其中內源性物質多是用于保證指印紋線的顯現和指印遺留時間的推斷,如Xu等人以指印中內源的蛋白質/多肽分泌物為基礎,研究了指印化學成像和模式識別的交叉融合[6];Girod等人使用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)研究了指印遺留時間[7]。然而,現有的關于指印中物質信息挖掘的技術方法多是借助大型儀器,如光譜法、質譜法、電化學法等[3],這些技術雖然準確度和靈敏度較高,但其技術成本高、操作流程相對復雜,使其大多滯留于科研試驗,并未給偵查實踐帶來實質性的提升。因此,亟需開發出一種低成本、高效率的指印物質信息識別技術。

2007年,我國科學家首次發現無機材料Fe3O4在納米尺度呈現出類似天然酶——辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)的生物活性,其催化效率與天然酶相近,并首次提出納米酶的概念[8]。納米酶是一類既有納米材料理化特性,又蘊含酶學催化功能的新一代人工模擬酶。與傳統的模擬酶相比,納米酶具有更高的催化效率,其還具備對熱、酸和堿的穩定性,可規?；苽?價格較低等優點[8-9]。在指紋成像領域,納米Fe3O4因其無毒、表面易于修飾且具有超順磁性,許多研究者將其功能化形成磁性熒光納米材料,應用于犯罪現場潛指印的顯現,取得良好的效果[10-11]。

然而,現有的將納米Fe3O4相關材料應用于指紋成像的研究中,只運用了超順磁性,未曾運用其納米酶催化特性。因此,利用材料的多重特性來降低指印物質識別的成本或許是一種可行途徑。同時,借助計算機識別進一步提升識別效率,特別是當肉眼難以辨別是否產生顏色變化時,其具有更大的優勢。HSV、RGB和灰度,是不同的表達色彩的顏色空間(色彩空間)[12-14],將其應用于對潛指印物質顏色的分析,有助于對識別效率和準確率的提升。H2O2既是外源性物質的產物,又是內源性物質的產物。作為過氧化炸藥爆炸后的殘留物,對H2O2進行快速檢測能為案件提供更多的線索與物證[15];同時H2O2還是汗液分泌物中葡萄糖、乳酸、尿素等的中間產物,這些分泌物與人體疾病,如糖尿病、癌癥、風濕病等息息相關[16-17]。

因此,本文以H2O2為突破口,協同納米酶Fe3O4的超順磁性和辣根過氧化物酶樣活性,并在Matlab中設計和運用HSV、RGB和灰度程序對潛指印圖像進行分析,實現了對潛指印二維形態的顯現及其中H2O2的定性與半定量分析,并初步實現了葡萄糖的定性分析,提供了一種低門檻、高效率的潛指印物質識別新方法和新思路,流程如圖1所示。

圖1 整體流程示意圖

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)、氯化高鐵(FeCl3·6H2O)、無水乙醇(C2H5OH)、過氧化氫(H2O2,30wt%)、冰醋酸(CH3COOH)、醋酸鈉(CH3COONa)、PBS緩沖液、四甲基聯苯胺(TMB)、葡萄糖(D-Glucose)、葡萄糖氧化酶(GOx,180 U/mg)均購于上海阿拉丁生化科技有限公司;所有化學試劑為分析純,實驗中所用水均為超純水。

Milli-Q超純水機(美國密理博公司);pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司);JP-040超聲儀(上海精宏實驗設備有限公司);ESJ200-4B分析天平(沈陽龍騰電子有限公司);DZF-6020真空干燥箱(上海申賢恒溫廠);TG16B臺式高速離心機(湖南凱達科學儀器有限公司);Thermo-Fisher DXR2拉曼光譜儀(美國賽默飛)。

1.2 潛指印中H2O2的原位可視化方法

志愿者將手洗凈并用紙巾擦干,用指尖擦過額頭,收集一些皮脂,然后用指尖蘸取H2O2溶液(5×102mM)。將指尖和拇指揉搓,使該物質與指尖上的皮脂混合。在載玻片上捺印指印,獲得汗潛指印樣本。用我們之前的方法[11]合成納米Fe3O4,將Fe3O4與TMB按質量比1∶1混合并充分研磨。

“抖顯+噴顯”分為兩步:抖顯:用磁性刷吸取研磨好的混合粉末,并將其至于載玻片指印外側,通過抖動使得混合粉末從載玻片一端經過潛指印落向另一端,用磁性刷將多余的粉末吸走,在白色背景下拍照取樣a。噴顯:將HAc-NaAc緩沖液(pH3.2)超聲5 min。取1 mL緩沖液裝入噴霧器中,用噴霧器朝指印a噴顯,噴完即止,4 min后在白色背景下拍照取樣b。其中拍照的手機、參數、距離、拍照時的角度和背景光照,以及噴顯時噴霧器及其高度和角度保持一致。

1.3 原位可視化條件的優化

保證其他條件一致,將TMB與納米Fe3O4分別按質量比10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5和1∶10的比例混合并充分研磨,探究TMB與Fe3O4之間的最優搭配比例;保證其他條件一致,分別將pH3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.8的HAc-NaAc緩沖液超聲5 min,探究原位識別的最優pH值。

1.4 潛指印中H2O2的定性分析

在載玻片上捺印指印,以最優原位識別條件獲得“抖顯+噴顯”指印,并在白色背景下,通過智能手機固定為圖像數據。將所得指印圖像輸入自編代碼,分別計算圖像每個像素點的HSV數據(色相、飽和度、明度),根據色相值對H2O2進行定性,并用拉曼光譜儀對定性結果加以驗證。

1.5 潛指印中H2O2的半定量分析

用手指蘸取不同濃度H2O2溶液(0 mM、5×10-3mM、5×10-2mM、5×10-1mM、5×100mM、5×101mM、5×102mM、5×103mM),在載玻片上捺印指印,獲得相應濃度的“抖顯+噴顯”指印的圖像數據。將其輸入自編代碼,分別計算出變色前/后每張圖像中各個像素點的RGB/灰度值及平均值,進一步計算變色前后圖像數據之間的差值(△值),構建圖像△RGB、△R、△G、△B和△Gray與H2O2濃度數量級之間的映射關系,實現潛指印上H2O2的半定量分析。

1.6 模擬現場應用及比較

在6種不同材質/顏色的客體進行現場模擬,選取手機充電器、快遞盒、紙杯、A4紙、筆記本封面、洗潔精瓶子等生活常見物品作為客體,在這些客體上捺印不同濃度H2O2的潛指印,并進行原位識別,探究本方法的準確性、普適性。同時將本方法和材料與公安民警辦案過程中顯現指印時常用的磁性粉、金粉、銀粉的顯現效果進行進一步的比較。

1.7 潛指印中葡萄糖的識別

將手指視為上下兩部分,下部蘸取葡萄糖粉末,上部保持正常,在載玻片上捺印指印并抖顯。在兩部分滴加等量葡萄糖氧化酶溶液,孵育半小時后拍照固定,隨后用HSV程序進行定性分析。

2 結果與討論

2.1 潛指印上H2O2的原位可視化

圖2展現了原位可視化的原理和效果?！岸讹@+噴顯”后,納米Fe3O4優異的超順磁性使其均勻分布在指印紋線上,同時HAc-NaAc水珠隨機分布在指印紋線周圍,在水分干燥的過程中產生了咖啡環效應[18-19],即“在液體蒸發過程中,由于毛細管從液體中心向外流動,會將懸浮物帶到邊緣,直至幾乎所有的懸浮物都沉淀下來,使得水珠形成環狀”。當水珠里的HAc-NaAc被帶到指印紋線邊緣時,由于分子表面張力,部分HAc-NaAc和水珠會吸附在指印紋線上的Fe3O4@TMB混合粉末表面。此時,TMB逐漸溶解在HAc-NaAc水珠里,同時指印中的油脂會在水珠表面形成一層水油膜,從而減少水分的蒸發,為TMB、H2O2和納米Fe3O4的變色反應提供微小的液體環境,使得變色反應能夠在指印上(固體表面)順利進行,且不會破壞其紋線形態。方程式為:

該過程體現了納米Fe3O4的納米酶催化特性:第一步,H2O2從納米Fe3O4顆粒表面的Fe2+獲得電子形成H2O,Fe2+被氧化為Fe3+;第二步,TMB(白色)失去電子變為oxTMB(藍綠色),Fe3+獲得電子被還原成Fe2+[20]。由圖可知,“抖顯+噴顯”后指紋的整體顏色從灰黑色變為了藍綠色,與變色原理相符。指印圖像中可觀察到多個起點、終點等清晰的指紋二級特征。相較于“抖顯+噴顯”的方法,“抖顯+滴顯”的潛指印圖像呈糊狀,如圖2(b),是由于“抖顯+滴顯”時Fe3O4@TMB混合粉末與指紋乳突紋線屬于物理吸附,二者結合不夠穩定,大顆粒水滴表面張力大于物理吸附力,水滴在擴散的同時也帶著Fe3O4@TMB混合粉末擴散。而“抖顯+噴顯”的方法成功發揮出了納米Fe3O4的雙重特性,并將水滴霧化解決了大顆粒水滴表面張力帶來的破壞,實現了對潛指印上H2O2的原位可視化。

圖2 潛指印H2O2原位可視化原理及效果

2.2 條件的優化

為進一步優化原位可視化的效果,探究了原位可視化時TMB與納米Fe3O4的最優比例搭配,以及最適pH。圖3中a1到a7、b1到b7分別是TMB與Fe3O4質量比為10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5和1∶10的“抖顯+噴顯”之后的指印圖像(溫度、pH、H2O2濃度一致);c1到c7、d1到d7分別是HAc-NaAc緩沖液pH3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.2和5.8的“抖顯+噴顯”之后的指印圖像(溫度、TMB與Fe3O4質量比、H2O2濃度一致)。

圖3 原位可視化不同條件的示意圖

圖3中從a1到a7,由于納米Fe3O4占比越來越多,指印紋線的顏色由淺至深。而b1到b7對應的顏色變化卻并非如此,b1和b2變色前后變色不明顯,原因在于a1和a2中納米Fe3O4的占比低,在變色反應時所提供的催化位點不足;而b6和b7中由于納米Fe3O4的占比過高,變色后藍綠色受黑色的干擾較重;在b3、b4、b5中,b3的效果最好,因此TMB與納米Fe3O4的最優比例為2∶1。

相較于a1到a7,c1到c7的紋線顏色深淺更均勻,但仍然存在一些差異,這是指印捺印時的力度、油脂含量的差異造成的,在可控誤差范圍之內。與HRP酶相似,納米Fe3O4過氧化物酶樣活性也受溶液pH值的影響。當pH在3.2~3.6范圍變化時,納米Fe3O4的催化活性隨pH增大而增強,當pH為3.6時的催化活性最高,此后隨著pH值增大其催化活性降低,因此選取3.6為最佳pH,根據已有文獻報道[21],在H2O2與TMB的反應過程中,羥基自由基(·OH)的產生發揮了重要作用,而pH值的變化會對該過程產生影響。此現象與溶液中TMB、H2O2和納米Fe3O4反應的最適pH值一致[8]。此外,本方法對于不同形成時間的潛指印顯現效果,在前期的工作中已有探究,結果表明潛指印中殘留物會隨時間的解吸、電離和汽化,本方法的最佳顯現時間應控制在5天之內[22]。

2.3 定性分析

HSV顏色空間對顏色的表達相對于RGB和灰度更符合人類觀察色彩的方式。所以用HSV程序來代替肉眼進行定性的判定。此程序是在本課題組之前研究的基礎上[7]作出了進一步的優化。圖4中(a)和(c)中上下兩枚指印分別是變色前/后的指印圖像,二維表格是指印圖像經HSV程序分析后的色相圖,橫坐標代表色相(H),縱坐標表示像素點的個數,其中,為便于計算和表達,我們在程序中將HSV模型的色相(H)的范圍從(0°~360°)[12]調整為(0~1);(b)和(d)是HSV三維散點圖,3個坐標軸分別代表了像素點的色相(H)、飽和度(S)和明度(V),其中小點的顏色直接反映了指印圖像像素點的顏色。

圖4 指印定性分析圖

變色前的指印圖像整體偏黃,如色相圖(a)顯示,該指印圖像像素點的色相范圍分布在(0.1~0.2)區間,超過10×104的像素點集中在0.12,因此(b)中多數的小點存在重疊現象,肉眼觀察到的黃色小點數量較少;變色后的指印圖像出現了oxTMB對應的藍綠色,色相圖(c)中顯示其像素點的色相范圍分布在(0.46~0.52)區間,集中在0.48,但相較于(a)其像素點顏色的分布范圍更窄,因此(d)中的顏色小點的在H軸的分布范圍相較于(b)也更窄。圖(e)中的指印為低濃度H2O2的指印圖像,肉眼難以分辨指印中有藍綠色產生,而從其對應的色相圖和三維散點圖(f)中可直觀地觀察到藍綠色像素點的存在?？梢?利用HSV程序將指印的變色情況進行數據化、量化表達,相較于肉眼更為靈敏、客觀。

為驗證藍綠色是否由oxTMB產生,圖5是對原位可視化前后潛指印中隨機5處紋線進行拉曼檢測的結果。TMB在被氧化前,在1 189、1 332和1 609 cm-1處存在較強的拉曼峰[23],當其被氧化成oxTMB后拉曼強度會有所下降,因此通過比對變色前后的拉曼強度即可驗證。由于本實驗對TMB進行拉曼檢測時所用載體是載玻片,且TMB表面附有Fe3O4,其拉曼峰有不同程度的偏移(變為1 166、1 345和1 603 cm-1)。圖5顯示,顯色后指印(曲線1~5)的拉曼強度都明顯低于顯色前(曲線6~10)的強度,與鐘麗云等人的實驗現象一致[24],因此變色后指印中的藍綠色是由oxTMB產生,所以根據三維散點圖和色相圖中的顏色變化即可實現潛指印中H2O2的定性分析。

圖5 拉曼驗證圖

2.4 半定量分析

潛指印中H2O2半定量分析的原理為:

其中“x”表示指印圖像的RGB/灰度值。不同濃度H2O2的指印的Δx(變化值)不同,因此計算出各濃度梯度的Δx(變化值)即可實現指印中H2O2的半定量分析。

圖6是H2O2的多通道半定量分析圖,內嵌圖為含有不同濃度數量級H2O2的指印圖像。其中,紅色、綠色、藍色、棕橙色、灰色曲線分別代表△R、△G、△B、△RGB、△Gray,橫坐標為H2O2濃度的對數(Log),縱坐標為變化值的大小;指印內嵌圖分為8行5列,每一行代表不同濃度的H2O2(從下至上H2O2濃度分別為0 mM、5×10-3mM、5×10-2mM、5×10-1mM、5×100mM、5×101mM、5×102mM、5×103mM),每一行的5個正方塊代表同一枚指印的5個不同區域(由于指印圖像邊緣沒有指印紋線,會影響定量的準確性,故以五點取樣法,在含有指印紋線的區域隨機選取5個區域,用這5個區域的變色情況代表整枚指印的變色情況)。

圖6 半定量分析圖

圖6中,不同△x(變化值)曲線的形態表明,H2O2濃度的對數與△x(變化值)的大小不成正比,二者關系滿足于Peak Functions函數中Asym2Sig曲線的分布樣式,

其中y0為偏移量;A為振幅;xc為水平方向的中心點;w1,w2,w3為寬度參量,并且w2,w3決定峰值位置[25]。在較低H2O2濃度時(5×10-3mM~5×10-1mM)其催化反應速率緩慢,這是因為納米Fe3O4對H2O2的親和力不強;而在較高H2O2濃度時(5×102mM~5×103mM),由于納米Fe3O4的催化位點不夠,多個H2O2分子對Fe3O4上的單個催化位點產生了競爭,而單一催化位點的競爭導致了催化活性的降低。因此,在較高H2O2濃度時,其催化反應速率也逐步減緩,此現象與研究前期在溶液中利用紫外可見光譜測得的數據相符[23],驗證了半定量的準確性與科學性。

相對于△G和△B曲線,△R、△RGB和△Gray曲線擬合程度更高,是因為TMB與H2O2的產物顏色呈“藍綠色”,與綠色通道(△G)和藍色通道(△B)顏色重合,會影響其準確性。因此在半定量分析時應選擇△R、△RGB和△Gray 3個通道,而當潛指印圖像的背景存在紅色干擾時,應選擇△RGB、△Gray通道;另外,由于△RGB是由△R、△G、△B組合而成,其擬合程度會受△G、△B的影響。因此,綜合各因素,選取△Gray通道進行半定量分析更為準確。圖7(g)為單獨的△Gray通道半定量箱線圖,其中小寫字母(a、b、c、d、e、f、g)表示不同濃度梯度的顯著差異(P＜0.05)。

2.5 模擬現場應用及比較

為檢驗本方法的普適性,在不同材質/不同顏色客體上進行了模擬現場應用,如圖7所示。其中a為洗潔精瓶子(其中H2O2的濃度為5×102mM)、b為紙杯(濃度為5×101mM)、c為快遞盒(濃度為2×101mM)、d為A4紙(濃度為1×100mM)、e為筆記本封面(濃度為2×10-1mM)、f為手機充電器(濃度為2×10-2mM)。

經過原位可視化識別,可觀察到諸多的指印細節,說明“抖顯+噴顯”的方法適用于多種小體積客體上潛指印的顯現。圖7中(a1/a2、b1/b2、c1/c2、d1/d2、e1/e2、f1/f2)分別對應6種客體上“變色前”和“變色后”的指印,其中,3種白色背景的差異最大(b1/b2、d1/d2、f1/f2),黃色背景(a1/a2)、棕色背景(c1/c2)的差異稍小,而紅色背景(e1/e2)的差異最小。如圖7中h與h',變色產生的藍綠色在紅色背景襯托下呈黑色,肉眼難以辨別出有藍綠色的出現,但從所得的定性圖譜中可觀察到藍色像素點的存在,進一步印證了計算機識別相較于肉眼更為靈敏、準確。隨后進一步對3種白色背景下指印中H2O2的進行半定量分析(客體分別為b紙杯、d A4紙、f手機充電器),如圖7中g所示。其中b、d、f的半定量結果與其測得的濃度與實際濃度相符,半定量結果在誤差范圍之內。

圖7 現場應用圖

以載玻片為客體,將本方法和材料與傳統的磁性粉、金粉、銀粉的潛指印顯現效果進行比較。如圖8,a為納米Fe3O4@TMB抖顯的潛指印,b,c和d分別為傳統磁性粉、銀粉、金粉抖顯的潛指印,a',b',c'和d'分別是Fe3O4@TMB、傳統磁性粉、銀粉和金粉“刷顯”的潛指印。a1和a'1分別為a和a'中心花紋處的超景深3D放大圖像。

圖8中通過“抖顯”形成的指印圖像,Fe3O4@TMB的顯現效果(a)最佳,其中脊線與谷線對比明顯,說明Fe3O4@TMB對潛指印紋線具有較高的選擇性。由于傳統的磁性粉(b)、銀粉(c)和金粉(d)對潛指印紋線的選擇性較低,用其抖顯形成的指印圖像較模糊。其中,磁性粉的顯現效果優于銀粉,銀粉優于金粉,這是因為不同顯現材料的顆粒尺寸、形態不同,而顆粒的尺寸和形態則使得該材料對指印紋線的選擇性不同。

圖8 不同材料和方法指紋成像圖

通過“刷顯”形成的指印圖像中,顯現效果銀粉＞Fe3O4@TMB＞磁性粉＞金粉。而相較于抖顯,“刷顯”的效果磁性粉、銀粉、金粉提升了,Fe3O4@TMB反而有所下降,說明傳統顯現材料更適合于“刷顯”,Fe3O4@TMB更適合于“抖顯”。由于Fe3O4@TMB顯現指印紋線后還需進行下一步變色環節,故紋線上粉末越多則越有利于后續的變色反應。將a1和a'1對比可知,Fe3O4@TMB通過抖顯形成的指印相較于刷顯,指印紋線上的粉末更多,更有利于后續的變色反應。

2.6 潛指印中葡萄糖的識別

圖9是對潛指印中葡萄糖檢測的實驗結果。由于葡萄糖與葡萄糖氧化酶反應的最適pH在7左右,而TMB與H2O2反應的最適pH在3~4之間,這使得對潛指印(固體表面)中葡萄糖的識別需要兩次改變pH,較難控制,目前只能以“抖顯+滴顯”的方式進行葡萄糖的可視化識別,無法實現原位可視化識別,但并不影響其的定性分析。

為增加定性效果,圖9(a)中左側指印下部粘附有額外葡萄糖粉末、上部未添加。通過“抖顯+滴顯”后,指印中產生如下偶聯反應,

反應結果如圖9(a)中右側指印所示。其中,指印上半部分未發生肉眼可見的變色,下半部分產生明顯藍綠色。盡管“抖顯+滴顯”不能實現指印中葡萄糖的原位識別,但部分指印細節可以被拍照固定。由于手指下部額外附著有葡萄糖,經“抖顯+滴顯”后,潛指紋上存在明顯的藍綠色,如圖9(c)所示。由于圖9(b)中的指印沒有額外的葡萄糖,潛指紋上半部分未出現明顯藍綠色,但其局部放大圖中存在少量藍綠色像素,這可歸因于捺印指印時附著的汗液中存在極少量的葡萄糖。

圖9 潛指印中葡萄糖識別圖

3 總結與展望

本研究將納米Fe3O4的雙重特性(超順磁性和辣根過氧化物酶樣活性)協同用于潛指印成像,實現了對其二維形態及其中物質信息的同步可視化識別?！岸讹@+噴顯”的方法適用于對多種客體上潛指印的成像,但由于納米Fe3O4對H2O2的親和力較低,檢測限還有待進一步提升。進一步設計HSV、RGB和灰度相關的程序,輔助實現了對潛指印中H2O2的定性與半定量分析。相較于肉眼觀察,HSV定性識別更為靈敏、客觀;用灰度進行半定量更準確,不過目前還無法滿足犯罪現場復雜背景下的定量分析。與傳統顯現方法和材料相比,Fe3O4@TMB對指印紋線的選擇性更高,對潛指印顯現的效果更好;潛指印中葡萄糖的識別需要兩次改變pH,較難控制,目前僅初步實現了定性分析,對其原位識別和定量分析還有待進一步完善。

綜上,合理利用顯現材料的多功能性可挖掘出更多的信息,將顯現方法與計算機技術結合,可更好地將指印信息進行數據化與量化。在下一步的工作中,本團隊將進一步提升納米材料的性能、開發更為普適性的定量方法,擬實現對潛指印中更多的內源性物質和外源性物質的原位識別,從其中挖掘出更多有價值的信息。