2型糖尿病小鼠模型的建立

左心真，王蒙蒙，董曉

(青島農業大學生命科學學院，山東青島 266109)

隨著社會經濟的發展和人民生活水平的提高，目前整個社會肥胖問題日益嚴重，糖尿病患病人數逐年遞增。據國際糖尿病聯盟(IDF)最新發布的結果顯示，在全球范圍內糖尿病患者平均增長率為51%，其中中國的糖尿病患者人數最多，約為1.164億人[1]。我國糖尿病患者以2型糖尿病為主，約占患病總人數的90%以上。糖尿病是一種自身葡萄糖代謝紊亂性疾病，現有的治療策略無法阻止該病和相關并發癥的發生。糖尿病主要分為1型和2型兩種類型，區分這兩種糖尿病的關鍵在于有無胰島β細胞抗原的自身抗體，有自身抗體的是1型糖尿病(T1D),且確診時年齡較小，跟遺傳因素有關；無自身抗體的是2型糖尿病(T2D)[2]。T2D的發病機制是胰島功能缺陷和胰島素抵抗兩個方面。所謂胰島素抵抗是胰島素促進葡萄糖攝取和利用的效率下降，機體代償性地分泌過多胰島素產生高胰島素血癥，以維持血糖的穩定。通常來說，2型糖尿病患者需要胰島β細胞分泌更多的胰島素來降低血糖的含量，但是β細胞并不能分泌過多的胰島素，從而出現胰島素分泌不足的現象，導致患者血糖偏高。2型糖尿病會出現頸動脈粥樣硬化性病變、脂代謝異常、脂肪肝等一系列并發癥[3]，因此建立一種類似2型糖尿病患者的小鼠模型并進行相關研究對臨床上治療糖尿病具有重大意義。

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)是一種DNA烷基化試劑(氨基葡萄糖-亞硝基脲)，只對胰腺β細胞有高選擇的毒性作用。STZ通過葡萄糖轉運蛋白2(glucose transport protein type 2，GLUT2)進入胰島β細胞，破壞β細胞的結構，從而減少胰島素釋放，因此STZ是建立糖尿病模型較為常用的試劑。研究表明，高劑量STZ(100～200 mg/kg)并飼喂高熱量飲食可致胰島β細胞發生壞死，嚴重影響胰島功能，導致胰島素分泌不足，進而造成1型糖尿病特征形成；而小劑量STZ對部分胰島β細胞選擇性輕微損傷，可促進β細胞凋亡，能誘導形成T2D模型[4]。高糖高脂飲食與小劑量STZ(40 mg/kg)進行聯合誘導而成的糖尿病模型屬于當前比較理想的模型[5]。

利用高糖高脂飼料并搭配注射低劑量STZ誘導的小鼠動物模型可以準確模擬2型糖尿病患者體內環境，從而為研究2型糖尿病發病機制和臨床治療提供了真實的動物模型[4]。采用此方法完成造模后的小鼠血糖值大于200 mg/dL，存在胰島素抵抗和葡萄糖耐受差的情況，與臨床患者表現十分相似[6]。這一造模方法模擬了2型糖尿病的疾病發生過程，其代謝現象類似于2型糖尿病晚期患者，是目前應用最為廣泛和成熟的造模方法[7]。肝臟是糖代謝的重要器官，肝細胞的葡萄糖攝取、糖原合成等過程都是通過胰島素介導來實現的。朱俊瑤等[8]認為高脂飲食可引起小鼠皮下脂肪細胞形態和功能異常，不僅促進糖異生，還導致胰島素信號通路受阻。2型糖尿病早期胰島素抵抗病理變化的客觀基礎之一在于脂肪組織在肝臟的沉積和肝臟胰島素受體的減少[9]。因此，本試驗建立2型糖尿病小鼠模型并對其脂肪和肝臟組織進行組織切片和蘇木精-伊紅染色 ( hematoxylin-eosin staining，HE染色)試驗，以進一步證明獲得的模型符合2型糖尿病模型要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑儀器

1.1.1 實驗小鼠及飼料

C57 BL/6J小鼠80只，4周齡，雄性，SPF級，平均體質量16～18 g，購買自濟南朋悅實驗動物技術有限公司。高糖高脂飼料購買自江蘇省協同生物工程有限責任公司，配方為：維持基礎料40%+豬油28%+蔗糖10%+全脂奶粉10%+酪蛋白8%+預混料2%+磷酸氫鈣2%，真空包裝并于4 ℃儲存。正常對照組飼喂普通飼料，配方為：玉米粉27%，麩皮19%，大米16%，豆餅16%，魚粉13%，鈣粉3%，骨粉3%，酵母粉2.3%，食鹽0.5%，復合維生素0.1%，微量元素0.1%，于室溫下儲存。

1.1.2 試劑

STZ購買自北京索萊寶(Solarbio)科技有限公司；葡萄糖、檸檬酸、檸檬酸三鈉均購買自國藥集團化學試劑有限公司；胰島素注射液購買自南京新百藥業有限公司；乙醇購買自煙臺三和化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器

血糖儀(愛奧樂科技北京有限公司);切片機(德國Leica RM 2235)；醫用型一次性無菌注射器[碧迪醫療器械(上海)有限公司]；精密天平SI-234[丹佛儀器(北京有限公司)]。

1.2 試驗方法

1.2.1 T2D小鼠模型的建立

對已購買小鼠進行稱重，每3只為一籠分籠飼養于25 ℃恒溫動物房。先用普通飼料飼養1周，使小鼠適應新的環境，消除運輸應激造成的影響。1周后把小鼠隨機分成兩組，一組為2型糖尿病組(T2D)，60只；一組為正常對照組(CHOW)，20只。 T2D組用高糖高脂飼料喂養，CHOW組則用普通飼料喂養，兩組小鼠除飼料喂養條件不同以外其他條件均相同。

小鼠分組后，每周二上午9：00對小鼠體質量和血糖進行測定記錄。小鼠飼養20周后，T2D組小鼠按40 mg/kg劑量(為體重劑量，下同)注射STZ，1 d 1次，連續3 d，處理結束后第3天開始尾靜脈采血檢測小鼠血糖，連續3次檢測血糖水平高于200 mg/dL，即可判定為2型糖尿病小鼠模型建成。

1.2.2 對小鼠進行腹腔注射STZ

(1)當飼喂小鼠20周后，檢測確定T2D組小鼠血糖水平明顯高于CHOW組并趨于穩定，在其血糖水平達到170 mg/dL時，可以對小鼠進行小劑量注射STZ誘導產生2型糖尿病，在注射之前對小鼠禁食12 h。

(2)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制：緩沖液分為A液和B液，須現配現用。A液：準確稱量0.735 g檸檬酸鈉溶解在25 mL無菌超純水中；B液：準確稱量0.525 g檸檬酸溶解在25 mL無菌超純水中。將充分溶解好的A液和B液等體積混勻，再將pH范圍調到4.2～4.5。

(3)STZ溶液配制：避光稱取0.003、0.004、0.005 g STZ分別溶解在1 mL的上述檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，放在冰上，輕輕混勻，配制濃度為3、4、5 mg/mL STZ溶液。

(4)為小鼠注射STZ。稱量小鼠體質量，按照1 g體質量分別注射濃度為3、4、5 mg/mL的STZ溶液0.01 mL，使小鼠STZ分別達到30、40 和50 mg/kg劑量，5 min內完成小鼠腹腔注射。

1.2.3 葡萄糖耐量試驗和胰島素耐受試驗

試驗從下午5：00讓小鼠禁食16 h，根據小鼠的體質量，按照2 g/kg的劑量給小鼠腹腔注射濃度為0.2 g/mL葡萄糖溶液，對小鼠進行葡萄糖耐量試驗，在葡萄糖注射0、15、30、60、90、120 min后測血糖濃度；48 h后再次對小鼠禁食4 h進行胰島素耐受試驗，根據小鼠的體質量，按照0.75 U/kg的劑量腹腔注射胰島素溶液，在注射后0、15、30、60、90、120 min后測血糖濃度。

1.2.4 肝臟和脂肪組織切片及HE染色

為了檢測T2D組小鼠的脂肪泡直徑大小，對兩組小鼠進行組織切片和HE染色 。按照組織固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片的步驟依次進行；之后進行染色，染色前，將組織切片提前放置在60 ℃烘箱中烘片2 h，使石蠟熔化，將切片放入染色架中進行染色；染色完成后，迅速在組織切片上滴一滴中性樹脂，用蓋玻片輕輕封片，避免滑片，放入通風櫥吹干備用[10]。

1.3 數據處理與分析

本試驗采用GraphPad Prism 8.3和Image J軟件進行數據分析和作圖。兩組數據比較均采用t檢驗法；*表示P<0.05水平上差異顯著，**表示P<0.01水平上差異極顯著，***表示P<0.001水平上差異極極顯著。

2 結果分析

2.1 兩組小鼠體表特征的差異

2型糖尿病模型(T2D)的小鼠因飼喂高糖高脂飼料，體質量比正常對照組(CHOW)小鼠增加得快。小鼠飲食高糖高脂飼料20周后，經肉眼觀察，CHOW組小鼠(圖1A)比T2D組小鼠(圖1B)體型小得多，并且前者小鼠毛質光滑順亮，而T2D組小鼠的毛緊貼皮膚有出油現象。

圖1 正常對照組(A)和2型糖尿病誘導組(B) 小鼠在體表特征上的比較

2.2 兩組小鼠體質量、血糖水平的比較

在進行高糖高脂飼料喂養之前，正常對照組和T2D組小鼠體質量、血糖并無顯著性差異，用高糖高脂飼料喂養20周，T2D組小鼠的血糖和體質量均顯著高于CHOW組小鼠(P<0.001)，見表1。

2.3 2型糖尿病小鼠成模率和死亡率的測定

分別用30、40 和50 mg/kg劑量的STZ對T2D組小鼠進行腹腔注射。由圖2可看出，注射30 mg/kg劑量的STZ成模率為75%；注射50 mg/kg劑量的STZ死亡率為65%；注射40 mg/kg劑量的STZ死亡率僅為10%，且成模率也最高，為85%，各組死亡率差異性顯著。

2.4 葡萄糖耐量試驗致兩組小鼠葡萄糖耐量能力比較

葡萄糖耐量試驗通常作為確診糖尿病發生的一個重要依據，其機理是檢測自身對葡萄糖的負荷能力。兩組小鼠同時注射相同劑量葡萄糖溶液后，兩組小鼠血糖都有所上升，在30 min時達到最高，之后就開始降低，CHOW組2 h之內恢復到注射前濃度，而T2D組小鼠在2 h內未能恢復到注射前濃度，葡萄糖耐量降低(圖3A)。通過計算曲線下面積發現，兩組小鼠葡萄糖耐量能力存在顯著差異(圖3B)。

表1 兩組小鼠體質量、血糖水平的比較

圖2 注射不同劑量STZ 對 T2D小鼠成模率(A) 和死亡率(B) 的影響

2.5 胰島素耐受試驗致兩組小鼠胰島素抵抗能力的比較

對兩組小鼠進行胰島素溶液注射后，CHOW組小鼠的血糖濃度在30 min時達到最低值(圖4A)，之后快速恢復，在90 min時基本恢復到注射前血糖水平。T2D組小鼠注射胰島素溶液后，血糖濃度下降的速度明顯慢于CHOW組，在60 min左右達到最低，之后緩慢上升，在2 h之內沒有恢復到初始血糖濃度，表示已經發生胰島素抵抗現象。通過統計曲線上面積發現，兩組小鼠胰島素耐受能力存在顯著差異，符合2型糖尿病模型要求(見圖4B)。

圖3 葡萄糖耐量試驗致兩組小鼠葡萄糖耐量能力的比較

2.6 兩組小鼠脂肪和肝臟組織切片及HE染色結果比較

取兩組小鼠腹股溝脂肪，通過脂肪組織切片和HE染色試驗發現，T2D組小鼠(圖5A)脂肪組織的脂肪泡面積大于CHOW組小鼠(圖5B)，有顯著性差異(圖5C)。取兩組小鼠肝臟，通過肝臟組織切片和HE染色試驗發現，T2D組小鼠(圖5D)肝臟組織的脂肪泡面積大于CHOW組小鼠(圖5E)，并且脂肪泡的數量明顯多于CHOW組小鼠，有顯著性差異(圖5F)。

圖4 胰島素耐受試驗致兩組小鼠胰島素抵抗能力的比較

A：T2D組脂肪組織HE染色；B: CHOW組脂肪組織HE染色；C: 兩組小鼠脂肪組織的脂肪泡直徑統計；D: T2D組肝臟組織HE染色; E: CHOW組肝臟組織HE染色; F: 兩組小鼠肝臟組織的脂肪泡直徑統計

3 討論

2型糖尿病的胰島素抵抗是一種病理狀態，在這種狀態下，胰島素不能對正常的胰島素水平做出適當的反應。胰島素抵抗是胰島素依賴細胞(如脂肪細胞等)對胰島素不適當反應的復雜病理狀態，它是高血壓、血脂異常、糖耐量異常、冠心病、腦血管病等多種慢性病的基礎[11]。長期、過量高脂高糖食物的攝入會損傷胰島細胞，從而出現糖尿病。本研究利用以上原理，通過高糖高脂飼料飲食并與小劑量STZ聯合進行誘導，構建了肥胖相關的2型糖尿病小鼠模型。將小鼠高糖高脂喂養20周后，T2D組小鼠血糖水平明顯高于CHOW組，在血糖值達到170 mg/dL后連續3 d注射40 mg/kg劑量的STZ，使建立的糖尿病模型更接近于人類2型糖尿病患者[12]。有研究報道，使用STZ劑量為30 mg/kg進行誘導，可以成功地建立T2D動物模型[13]；另有研究表明，持續高糖高脂飲食12周能夠誘導大鼠出現糖調節受損、胰島分泌功能減退以及脂代謝紊亂，且高脂聯合注射30 mg/kg劑量的STZ后，糖尿病大鼠的上述受損幅度明顯加大[14]。也有研究采用4周齡SPF級SD大鼠(斯普拉格-杜勒鼠)高糖高脂飼料喂養1個月, 按30 mg/kg劑量一次性腹腔注射STZ，從而建立穩定的具有高血脂和胰島素抵抗特征的2型糖尿病動物模型，但此文章未明確表述2型糖尿病動物模型的成模率和存活率[15]。以上報道與本試驗所用STZ劑量不一致，可能與STZ的注射頻率不一樣，或與實驗動物品系不同等有關。綜上所述，本試驗通過高糖高脂飼料喂養并與注射小劑量STZ(40 mg/kg)聯合進行誘導建立的2型糖尿病小鼠造模方法具有實驗周期短、方法簡便、相對可靠穩定、造模成本低等優點。

本研究中葡萄糖耐量試驗和胰島素耐受試驗結果顯示，T2D組小鼠在注射葡萄糖后血糖迅速上升，達到最高之后緩慢下降，在2 h內未能恢復到注射前濃度，葡萄糖耐量降低；T2D組小鼠注射胰島素溶液后，血糖下降速度較CHOW組慢，在達到最低之后緩慢上升，在2 h之內沒有恢復到注射胰島素溶液前血糖濃度，發生了胰島素抵抗現象，這說明2型糖尿病小鼠模型建立成功[12]。劉麗萍等[16]用高糖飼料喂養SD雄性大鼠6周后，對其進行葡萄糖耐量試驗和胰島素耐受試驗，發現處理組在50 min時血糖濃度最低，90 min 后血糖未能恢復，說明高脂飼料喂養SD大鼠6周后會出現糖耐量、胰島素耐受異常，即具有胰島素抵抗的特征，這和本試驗結果一致。進一步對兩組小鼠脂肪和肝臟進行組織切片及HE染色分析，發現T2D組小鼠的脂肪和肝臟中的脂肪泡面積明顯大于CHOW組小鼠，存在顯著性差異。薛萊等[17]經過高脂飼料聯合多次小劑量STZ誘導小鼠糖尿病模型形成4周后，通過 HE染色發現T2D小鼠肝小葉結構破壞明顯、肝索排列混亂、肝細胞出現大量脂肪空泡，說明2型糖尿病(非酒精性)脂肪肝模型建立成功，這與本試驗結果相符。

綜上所述，4周齡C57BL/6雄性小鼠用高糖高脂飼料喂養20周后，再腹腔注射40 mg/kg體重劑量的STZ，能形成穩定的2型糖尿病模型，并且操作簡單，成模率和存活率達80%以上。本試驗為日后治療和研究2型糖尿病提供了一種建立動物模型的方法。