CRIP1參與子宮內膜癌細胞增殖、侵襲、遷移及EMT的作用

淳彩璞，崔曉賓，胡建明，賈 薇，呂新玲，李美峰，吳小雙

843000 新疆 阿克蘇，新疆石河子大學醫學院第四附屬醫院病理科1；832000 新疆 石河子，新疆石河子大學醫學院第一附屬醫院病理科2；833200 新疆 奎屯，新疆伊犁州奎屯醫院病理科3

子宮內膜癌(endometrial cancer, EC)為多見于女性生殖系統的惡性腫瘤，處于絕經期前后的女性屬于其高危人群[1]。據報道，2008-2018年EC死亡率每年上升約1.4%[2]。常見的致病因素包括肥胖、雌激素過多、高血壓和糖尿病等[3]。目前，臨床常用的主要治療方法仍是手術[4]。盡管針對晚期EC患者的治療已取得了重大突破和進步，但腫瘤的侵襲性和轉移性仍易導致腫瘤復發，嚴重影響患者預后[5- 6]。因此，探究EC細胞增殖和轉移相關的分子基礎及調控機制可為EC治療提供重要的理論依據。

半胱氨酸豐富蛋白1(cysteine rich protein 1, CRIP1)屬于LIM/雙鋅指蛋白家族，擁有獨特的雙鋅指結構，并由此發揮其在多種疾病中的重要作用[7]。最早發現CRIP1主要在腸道中分布，除腸道外，CRIP1同樣廣泛存在于結腸、肺、脾、胸腺和腦等其他器官中[8-9]。深入研究揭示，CRIP1在鋅離子吸收轉運、維持管腔結構、炎癥免疫應答方面發揮重要作用[10]。近年來，CRIP1 在幾種癌癥中的異常表達引起了越來越多的關注。研究發現，CRIP1在多種惡性腫瘤中充當促癌基因，如卵巢癌[11]、宮頸癌[12]、甲狀腺癌[13]、乳腺癌[14]、肝細胞癌[15]、結直腸癌[16]等。這些結果表明CRIP1可能是惡性腫瘤的潛在治療靶點，尤其是癌癥的侵襲和轉移?，F有研究表明，EC組織中呈現出較高的CRIP1表達，且與患者的不良預后有緊密關聯[17]。因此，我們猜測CRIP1的異常表達可能與EC進展有關并予以探討。

糖酵解是指葡萄糖和糖原分解為丙酮酸并同時生成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的過程[18]。2020年NIE等[19]研究發現，糖酵解激酶磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1，PGK1)通過直接或間接增強糖酵解活性從而推動癌細胞生長。研究表明，EC組織中呈現出較高的PGK1表達，且與不良預后及腫瘤的生長浸潤行為緊密相關[20-21]。但PGK1在EC中的具體作用尚不清楚。因此，本研究重點探討CRIP1對EC細胞惡性行為表型的具體影響并闡明CRIP1與PGK1兩者間的相互關系。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

收集2019年2月至2020年12月于新疆石河子大學醫學院第四附屬醫院(新疆生產建設兵團第一師醫院)行手術治療的20例EC患者的腫瘤組織標本作為腫瘤組，年齡30～65(50.95±6.98)歲，所有患者手術前未進行放療或化療。腫瘤的分期根據國際婦產科聯合會(FIGO)分期系統標準確定。另外選取距離腫瘤>5 cm的癌旁組織標本作為正常組?；颊呒凹覍倬炇鹬橥鈺?，本研究經新疆生產建設兵團第一師醫院倫理委員會批準(2022年5月)。

1.2 材料

人子宮內膜基質細胞系SHT290購自北京科瑞思搏生物科技有限公司；人EC細胞Ishikawa購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司；KLE、RL95-2、HEC-1-A子宮內膜癌細胞均由美國菌種保藏中心(ATCC)提供；RPMI-1640、DMEM、EMEM和McCoy’s 5A培養基均購自美國GIBCO公司；FBS胎牛血清和Trizol提取試劑購自美國生命技術公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購自日本Takara公司；shRNA-CRIP1-1/2重組慢病毒和陰性對照shRNA-NC慢病毒由天根生化科技(北京)有限公司構建；Ov-PGK1和Ov-NC質粒由上海吉瑪公司提供； QuantiTect 逆轉錄試劑盒由德國凱杰生物公司提供；SYBR? Green PCR master mix試劑盒和BCA試劑盒購自美國伯樂公司；實時熒光定量PCR系統購自美國MJ Research公司；CCK-8試劑購自北京全式金生物技術有限公司；EdU和Protein A Agrose購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；基質膠和transwell小室購自美國BD公司；多聚甲醛、結晶紫和RIPA裂解液由美國Sigma公司提供；兔源CRIP1、基質金屬蛋白酶2(MMP2)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、E-鈣粘素(E-cadherin)、N-鈣粘素(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Snai、Slug、PGK1抗體和山羊抗兔IgG-FITC均購自美國Abcam；ECL發光試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Image J軟件購自美國國立衛生研究院；熒光顯微鏡購自德國歐蒙醫學診斷有限公司；倒置顯微鏡購自奧林巴斯；激光共聚焦顯微鏡購自德國徠卡公司；SPSS 22.0軟件購自美國IBM公司。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學分析 利用NCBI在線數據庫，選擇GSE63678數據集(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE63678)分析CRIP1在7例EC腫瘤組織和5例正常組織中的表達；利用Biogrid(https://thebiogrid.org/)預測CRIP1和PGK1兩者間的結合關系。

1.3.2 細胞培養 人子宮內膜基質細胞系SHT290常規培養于RPMI 1640培養基中；人EC細胞KLE，RL95-2均用DMEM培養基進行培養；Ishikawa細胞用EMEM培養基進行培養；而HEC-1-A細胞常規培養于McCoy’s 5A Medium培養基中。所有培養基含有10% FBS，放置在37℃、5%CO2的孵育箱中。

1.3.3 細胞轉染 細胞于6孔板中(5×104/孔)接種培養，當細胞達到60%～70%融合度時，嚴格按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明將shRNA-CRIP1-1/2、shRNA-NC、Ov-PGK1和Ov-NC瞬時轉染至各組細胞中，48 h后轉染完成。

1.3.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測CRIP1和PGK1在子宮內膜癌細胞內表達 首先，加入Trizol試劑對RNA進行分離，并按照QuantiTect 逆轉錄試劑盒說明書進行cDNA合成。以cDNA為模板，加入SYBR? Green PCR master mix試劑盒和7500實時熒光定量PCR系統進行PCR擴增反應。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法進行數據分析。

1.3.5 CCK-8法檢測細胞活性 質粒轉染后，細胞種植于96孔板中進行培養(5×103/孔)，分別于24、48、72 h后，添加體積分數為10%的CCK-8試劑，酶標儀于2 h后在490 nm處檢測光密度值[D(490)]，繪制增殖曲線。

1.3.6 EdU染色檢測細胞增殖 細胞轉染處理同1.3.5，每孔加入20 μmol/L EdU 37℃下孵育2 h。隨后，使用4%多聚甲醛和0.5% Triton X-100分別對細胞進行固定和透化處理。經DAPI染色后，于熒光顯微鏡下檢測EdU陽性細胞。

1.3.7 劃痕實驗檢測細胞遷移 在6孔板中加入處于生長對數期的Ishikawa細胞，細胞達到90%融合度時，使用200 μL無菌槍頭劃一條線，PBS洗滌3次后加入無血清培養基。在倒置顯微鏡下測量0、48 h的傷口寬度，計算細胞遷移數。

1.3.8 Transwell實驗檢測細胞侵襲 將轉染后的Ishikawa細胞接種于含有基質膠的transwell上室內，transwell下室加入500 μL含10% FBS的EMEM培養基。24 h后，表層細胞被棉簽擦去，細胞經多聚甲醛和結晶紫分別固定和染色處理后，于顯微鏡下對細胞進行計數。

1.3.9 免疫印跡法(Western blot)檢測 采用BCA試劑盒對RIPA裂解液提取的蛋白濃度進行檢測。將行10% SDS-PAGE電泳的等量蛋白質轉移至PVDF膜并在5%脫脂牛奶中進行室溫封閉，加入一抗和HPR標記的羊抗兔二抗，分別于4 ℃和室溫下孵育。加入ECL發光試劑盒對蛋白條帶進行顯影，利用Image J軟件記錄灰度值。

1.3.10 免疫熒光(immunofluorescence, IF)檢測Vimentin表達 用4%多聚甲醛和0.2% TritonX-100分別對轉染后的Ishikawa細胞進行固定和透化處理，并用2% BSA進行封閉，4 ℃下與稀釋的兔源Vimentin抗體孵育過夜，并在37 ℃下與山羊抗兔IgG-FITC孵育1 h，50%甘油封片，最后利用激光共聚焦顯微鏡拍照和熒光定量分析。

1.3.11 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP) 常規收集并裂解細胞后，加入2 μg兔抗CRIP1和PGK1單克隆抗體，4 ℃下孵育過夜，加入Protein A Agrose，繼續混合過夜，離心后收集沉淀物，經SDS-PAGE分離后，Western blot對免疫沉淀物進行分析。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 CRIP1在EC腫瘤組織和細胞中表達上調

RT-qPCR和Western blot印跡結果表明，CRIP1的表達在EC腫瘤組織中的表達較癌旁組織增加(P<0.01，圖1A、B)。同樣，生物信息學NCBI數據庫(GSE63678芯片)分析數據顯示，與正常組織相較，EC腫瘤組織中表現出較高的CRIP1表達(P<0.01，圖1C)。此外，與人子宮內膜基質細胞系SHT-290相比，CRIP1在人EC細胞(Ishikawa、KLE、RL95-2和HEC-1-A)中的表達水平明顯增加，且CRIP1在Ishikawa細胞中呈現最高表達水平(P<0.01)，同時CRIP1在RL95-2細胞中的蛋白水平較SHT-290細胞相比無顯著性差異(P>0.05，圖1D、E)，提示CRIP1在EC組織和細胞中廣泛表達。因此，選擇CRIP1相對表達量最高的Ishikawa細胞進行后續實驗。

2.2 敲低CRIP1對EC細胞增殖的影響

為進一步明確CRIP1在EC發展過程中的作用，首先利用shRNA慢病毒對CRIP1基因進行干擾。轉染shRNA-CRIP1-1和shRNA-CRIP1-2后，CRIP1表達水平顯著降低，且CRIP1干擾組-1中呈現較高的干擾效率，因此選擇CRIP1干擾組-1用于后續實驗(P<0.01，圖2A、B)。CCK-8法表明，與干擾對照組比較，CRIP1干擾組-1中細胞在24、48、72 h時活性顯著減弱(P<0.01，圖2C)。EdU染色同樣表明，CRIP1干擾組-1較干擾對照組EdU陽性細胞比例明顯下降(P<0.01，圖2D)。

a: P<0.01，與正常組或SHT290比較

1：空白對照組；2：干擾對照組；3：CRIP1干擾組-1；4：CRIP1干擾組-2；a: P<0.01，與干擾對照組比較

2.3 干擾CRIP1對EC細胞遷移、侵襲及EMT的影響

劃痕實驗證實，CRIP1干擾組-1較干擾對照組劃痕相對愈合率明顯降低，遷移細胞明顯下降(P<0.01，圖3A)。Transwell實驗證明，與干擾對照組相比，CRIP1干擾組-1中侵襲細胞數目顯著降低(P<0.01，圖3B)。Western印跡結果表明，CRIP1干擾組-1較干擾對照組MMP2、MMP9、N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug蛋白水平明顯下降，而E-cadherin蛋白水平明顯增加(P<0.01，圖3C-E)。IF實驗同樣檢測到，與干擾對照組相比，CRIP1干擾組-1中Vimentin表達降低(P<0.01，圖3F)。

2.4 CRIP1與PGK1蛋白在EC細胞中相結合

經Biogrid網站進行生物信息學預測后發現，CRIP1可能與PGK1相結合。與人子宮內膜基質細胞系SHT-290相比，PGK1在人EC細胞(Ishikawa、KLE、RL95-2和HEC-1-A)中的表達水平明顯增加，且在Ishikawa細胞中呈現最高表達水平(P<0.01)(圖4A-B)。Co-IP實驗結果發現，在CRIP1相互作用蛋白復合物中發現CRIP1和PGK1的存在；同時在PGK1相互作用蛋白復合物中也檢測到PGK1和CRIP1的富集，表明CRIP1與PGK1兩者間存在相互作用(圖4C、D)。此外，CRIP1干擾組-1較干擾對照組PGK1蛋白水平顯著降低(P<0.01，圖4E)。

1：空白對照組；2：干擾對照組；3：CRIP1干擾組-1；a: P<0.01，與干擾對照組比較

(圖3E、F續下頁)

1：空白對照組；2：干擾對照組；3：CRIP1干擾組-1；a: P<0.01，與干擾對照組比較

a: P<0.01，與SHT290或干擾對照組比較

2.5 過表達PGK1對CRIP1敲低的EC細胞增殖能力的影響

為了進一步驗證CRIP1是否通過與PGK1蛋白結合從而調控EC發展，我們首先利用Ov-PGK1質粒對Ishikawa細胞進行轉染。PGK1過表達組中PGK1表達水平顯著升高(P<0.01，圖5A、B)。CCK-8和EdU實驗結果顯示，與空白對照組相比，CRIP1沉默導致Ishikawa細胞增殖能力明顯減弱；而與CRIP1干擾組+過表達對照組相比，CRIP1干擾組+PGK1過表達組中細胞增殖能力再次增強(P<0.01，圖5C、D)。

2.6 過表達PGK1對CRIP1敲低的EC細胞遷移、侵襲及EMT能力的影響

與空白對照組相比，CRIP1干擾組中遷移細胞數和侵襲細胞數明顯下降；而CRIP1干擾組+PGK1過表達組較CRIP1干擾組+過表達對照組轉移和侵襲細胞數再次上升(P<0.05，P<0.01，圖6A、B)。此外，與空白對照組相比，CRIP1干擾組中MMP2、MMP9、N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug蛋白水平明顯下降，而E-cadherin蛋白水平明顯增加；而與CRIP1干擾組+過表達對照組相比，CRIP1干擾組+PGK1過表達組中MMP2、MMP9、N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug蛋白水平升高，而E-cadherin蛋白水平下降(P<0.01，圖6C-E)。IF實驗也表明，CRIP1不足導致Vimentin表達下降；而轉染Ov-PGK1過表達質粒后，Vimentin水平再次上升(圖6F)。

a: P<0.01，與過表達對照組或空白對照組比較；b: P<0.01，與CRIP1干擾組+過表達對照組比較

1：空白對照組；2：過表達對照組；3：GRIP1干擾組+過表達對照組；4：GRIP1干擾組+PGK1過表達組；a: P<0.01，與空白對照組比較；b: P<0.05，與CRIP1干擾組+過表達對照組比較

(圖6E、F續下頁)

1：空白對照組；2：過表達對照組；3：GRIP1干擾組+過表達對照組；4：GRIP1干擾組+PGK1過表達組；a: P<0.01，與空白對照組比較；b: P<0.05，與CRIP1干擾組+過表達對照組比較

3 討論

EC是常見的婦科惡性腫瘤，是導致全世界女性癌癥死亡的常見因素[22]。盡管隨著治療手段的不斷進步已有效提高了EC患者的治療效果，但由于EC細胞增殖、遷移和侵襲能力較強，易發生遠處轉移，患者目前的生存率仍令人擔憂[5-6]。當前證據表明，腫瘤侵襲及遠處轉移與EMT事件密切相關[23-24]。此外，多種證據表明，EC的發生與發展是多種基因與通路相互調控的結果[25]。因此，本研究重點探討EC細胞的增殖、遷移、侵襲及EMT能力，從而深入揭露EC的發病機制，并尋找潛在的干預分子靶標。

目前LIM蛋白家族成員CRIP1在腫瘤方面的作用日益成為人們關注的焦點。有研究發現，宮頸癌組織和細胞中CRIP1表達增加，且在細胞遷移、侵襲和EMT中起推動作用[12]；LIU等[26]研究證實，敲低CRIP1可有效抑制卵巢上皮癌細胞遷移、侵襲及EMT。CRIP1表達上調是EC患者不良預后的獨立風險因素[17]。本研究通過RT-qPCR、Western blot及NCBI數據庫分析發現，與正常組織和細胞比較，EC組織和細胞中CRIP1表達升高。功能喪失實驗結果表明，CRIP1丟失可明顯減弱Ishikawa細胞的增殖、遷移和侵襲能力。先前研究發現，蛋白水解酶家族成員MMP2和MMP9在EC發展過程中表達增加[27]。同樣，敲低CRIP1可導致MMP2和MMP9蛋白表達降低。EMT過程中，E-cadherin蛋白表達缺失，而N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug蛋白表達增多[28]。本研究結果表明，CRIP1表達下調后，E-cadherin表達增加，而N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug蛋白表達減少。

對于腫瘤細胞而言，有氧糖酵解是腫瘤細胞為自身提供能量、實現快速遷移和侵襲的主要方式[18, 29]。因此，糖代謝與腫瘤的發生與發展有緊密關聯，是惡性腫瘤的重要特征。甲基化、乙?；确g后修飾行為都可以激活糖酵解相關酶PGK1，促使腫瘤細胞糖代謝的異常，從而影響癌細胞的惡性表型[30]。近年關于PGK1的研究強調了其在EC中的作用：EC組織和細胞中PGK1呈高表達，PGK1與EC進展和EC患者不良預后相關[20-21, 31-32]。此外，有研究報道HOXA9與CRIP家族成員CRIP2互相作用抑制HIF-1α介導的糖酵解從而抑制皮膚鱗癌發生發展[33]。更重要的是，CRIP1可通過與GAL-3蛋白相互作用從而在EC進展中發揮重要作用[17]。然而，CRIP1對糖酵解的作用以及與糖酵解相關酶PGK1間的相互關系仍未可知。本研究通過Biogrid數據庫和Co-IP實驗分別預測并驗證了CRIP1與PGK1在EC細胞中的結合關系。此外，EC細胞中PGK1水平增加，且CRIP1沉默可抑制PGK1蛋白表達，揭示了CRIP1對PGK1的正向調控關系，表明CRIP1可通過與PGK1蛋白結合從而參與EC進展。共轉染CRIP1干擾序列和PGK1過表達質粒至Ishikawa細胞后，拯救實驗結果進一步表明，沉默CRIP1對EC細胞增殖、遷移、侵襲和EMT能力的抑制作用均被PGK1所拯救。以上實驗結果表明，PGK1過表達可實現對CRIP1干擾抑制EC發展的拮抗作用。

綜上所述，EC組織和細胞中CRIP1表達升高，且與EC的發生發展有緊密關聯。敲低CRIP1可減弱EC細胞的增殖、遷移、侵襲及EMT能力，其機制可能通過與PGK1蛋白結合有關。本研究初步明確了CRIP1在EC中的促癌作用，為深入探究CRIP1的作用以及挖掘EC的潛在治療靶點提供了寶貴的實驗依據和理論支持。但本研究仍具有一些缺陷：首先，未涉及CRIP1表達與EC患者生存率、預后等相關性分析；其次，缺乏體內動物實驗以進一步驗證CRIP1在EC發展過程中的作用；最后，近期研究表明CRIP1與Ras、Wnt/β-catenin信號通路的異常激活有關[12, 15]，然而本研究未探討CRIP1相關的信號通路對EC發展的影響。