癢螨病患兔下丘腦室旁核組織結構及其內5-HT的表達量變化研究

連俊琪，余興邦，王 巍，田宗民，格根塔娜，李 穎，賈長生，王志剛，古小彬，周洪旭，鄧樺林，唐 麗*

(1.內蒙古自治區呼倫貝爾市動物疫病預防控制中心，內蒙古呼倫貝爾 021000；2.四川農業大學動物醫學院，四川成都 611130)

兔癢螨病主要由兔癢螨(Psoroptescuniculi)寄生于家兔的外耳道，導致患病動物發生劇烈的瘙癢、厭食、消瘦等臨床癥狀，且伴有局部炎癥并繼發細菌感染，同時引發機體的免疫反應；病變嚴重時，可蔓延至腦部，引起患兔癲癇，直至死亡[1-2]。下丘腦室旁核(paraventricular nucleus，PVN)是下丘腦重要的核團之一，由靠近外側的一群大細胞和靠近內側的一群小細胞組成，參與機體體溫、攝食、水平衡等重要的生理功能，并在神經免疫內分泌的調控中起整合中心的作用。PVN組織結構的變化必然伴隨著相應生理功能的變化，進而引發一系列臨床癥狀。研究表明，當發生疾病時PVN內神經元電位活動增強，其合成和分泌的催產素(oxytocin，OT)、加壓素(vasopressin，AVP)、促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)、神經肽Y(NPY)、5-羥色胺(5-HT)等物質不同程度參與了攝食調節、炎性疼痛的調控、機體的免疫反應及癲癇的發生與發展[3-7]。5-HT在哺乳動物的腦及神經突觸內含量很高，是重要的神經遞質和免疫調節因子。此外，PVN上也有5-HT受體，其可被5-HT激活，且5-HT纖維末端在PVN區域非常密集，PVN中5-HT受體也可上調CRH等信號系統，參與機體內分泌免疫調節[5，8]。

鑒于PVN及其內5-HT對鎮痛、癲癇、攝食及免疫反應的調控作用，關于PVN及其內5-HT在兔癢螨病的發生與發展中的作用研究未見報道。筆者采用HE染色以及免疫組化(SABC)法，觀察癢螨病患兔下丘腦PVN的組織結構及PVN內5-HT的表達量變化，以期探索下丘腦PVN的組織結構及其內5-HT在兔癢螨病的發生、發展中的作用，為兔癢螨病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及其分組選取4—7月齡健康及患癢螨病的新西蘭兔20只，體重2.5～3.5 kg，適應性飼喂7 d后宰殺。常規管理，自由采食和飲水。

參照癢螨病變評分系統[9]進行評分，選擇耳部病變分別達到不同評分級別(1分、2分、3分組)的患癢螨病新西蘭兔各5只，另選健康兔5只(0分組)。家兔靜脈麻醉后，頸動脈放血處死；取腦組織固定于4%多聚甲醛-0.1%磷酸鹽緩沖固定液，待用。

1.2 試驗方法

1.2.1樣本制作。取下丘腦(矢狀切)用石蠟包埋，連續切片(厚度為4～6 μm)后分別進行常規HE法染色和SABC法染色(一抗5-HT由北京博奧森生物有限公司提供)，最后使用OLYMPS CH2OBIMF200光學顯微鏡觀察。

1.2.2結果判定及數據統計分析。結果判定標準：陽性細胞的胞質出現棕黃色，根據顯色程度分為3級，并結合Image Pro Plus圖像分析系統中的平均積分光密度對結果進行判定：+++表示深棕色，強陽性；++表示中等著色，棕色，陽性；+表示著色淺，淡黃色，弱陽性。

光鏡觀察下丘腦PVN大、小細胞部的組織結構變化，描述病變特征。在10×40光鏡下，使用Image Pro Plus 圖像分析系統，每張切片按統一標準隨機截取10個視野，測定其陽性產物的平均光密度(OD)和積分光密度(IOD)；利用SPSS 20.0統計軟件進行數據統計分析，結果均以平均值±標準差表示；采用t檢驗分析差異顯著性，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 組織病理學變化通過光鏡觀察發現，0分組下丘腦PVN核團清晰，細胞排列有序，神經元纖維突起明顯；外側大細胞部細胞結構完整，胞體較大，核質清晰；內側小細胞部細胞結構完整，胞體較小，核質清晰；神經膠質細胞結構完整，數量較多，胞質著色較深(圖1)。

與0分組相比，患病組(1分、2分、3分組)患兔下丘腦PVN大、小細胞的形態、數量及組織結構等均有不同程度的變化，且損傷程度隨病變評分的增加而增加(雙耳病變分數越高，患兔下丘腦PVN組織結構損傷越嚴重)。1分組：下丘腦PVN核團清晰，細胞排列有序，神經元纖維突起輕微減少，部分大細胞出現固縮；部分小細胞輪廓不清晰；神經膠質細胞結構正常，數量增加，胞質著色較深。2分組：下丘腦PVN核團不清晰，細胞排列混亂，部分大細胞輪廓不清晰，邊緣模糊，部分細胞發生腫脹，胞體呈橢圓形；小細胞數量有減少趨勢，部分胞質消失；神經膠質細胞著色變淺，部分細胞變形、呈多極狀，胞體部分溶解，細胞數量有減少趨勢。3分組：下丘腦PVN核團不清晰，細胞排列紊亂，大細胞部胞體呈不規則形狀，輪廓模糊不清晰，部分細胞核仁崩解消失，胞質染色變淺；小細胞數量減少，分布稀疏，部分胞核不明顯，胞質消失，周邊組織有充血現象；神經膠質細胞胞漿內形成空泡，胞核崩解甚至消失，染色變淺，細胞數量明顯減少(圖1)。

注：A.健康組(0 分)；B.1分組；C.2分組；D.3分組；“→”表示室旁核小細胞部;“△”表示室旁核大細胞部;“▲”表示神經膠質細胞

2.2 癢螨病患兔下丘腦PVN內5-HT的表達量變化免疫組化結果(圖2)顯示，5-HT陽性產物為黃色或棕黃色，健康及患兔下丘腦PVN內均可檢測到5-HT陽性產物分布于神經細胞的細胞質內。與0分組相比，各患病組下丘腦PVN大細胞部內5-HT的表達量極顯著增加(P<0.01)，且1分組和2分組兔下丘腦PVN大、小細胞部內5-HT的表達量隨雙耳病變評分的增加而增加；與2分組相比，3分組下丘腦PVN大、小細胞部內5-HT的表達量減少(表1)。

2.2.1PVN大細胞部內5-HT的表達量變化。與0分組相比，患病組(1分、2分和3分組)下丘腦PVN大細胞部內5-HT的陽性信號增強(++)，平均積分光密度均極顯著升高(P<0.01)，5-HT表達量增加；1分組和2分組的5-HT表達量均隨雙耳病變評分的增加而增加；與2分組相比，3分組5-HT表達量減少(P>0.05)。與1分組相比，2分組和3分組下丘腦PVN大細胞部內5-HT 的平均積分光密度均升高，5-HT表達量增加(表1，圖2)。

2.2.2PVN小細胞部內5-HT的表達量變化。與0分組相比，患病組(1分、2分和3分組)下丘腦PVN小細胞部內5-HT陽性信號減弱，平均積分光密度均升高，5-HT表達量均增加；與0分組相比，2分組和3分組5-HT表達量極顯著增加(P<0.01)；與2分組相比，3分組5-HT表達量極顯著減少(P<0.01)。與1分組相比，2分組和3分組5-HT陽性信號增強(++)，平均積分光密度升高，5-HT表達量極顯著增加(P<0.01)。與2分組相比，3分組下丘腦PVN小細胞部內5-HT的陽性信號強度差異不大，平均積分光密度極顯著降低(P<0.01)，5-HT表達量減少(表1，圖2)。

注：A.健康組(0 分)；B.1分組；C.2分組；D.3分組；棕黃色或褐色表示陽性信號;“▲”表示室旁核小細胞部，“△”表示室旁核大細胞部

3 討論

3.1 癢螨病患兔下丘腦PVN組織結構的變化兔患癢螨病后出現厭食、消瘦、局部發炎及癲癇等臨床癥狀[1-2]，而下丘腦PVN參與調節機體攝食活動、調控癲癇的發生和擴散、調節鎮痛以及影響神經內分泌免疫活動[4-6]，而臨床現象與組織結構的變化密切相關。該試驗結果表明，癢螨病患兔出現上述臨床癥狀，且與健康組相比，患病組患兔PVN大、小細胞組織結構受損程度隨雙耳病變評分的增加而增加。

研究顯示，下丘腦PVN受到損傷后，分泌多種厭食神經肽，包括促甲狀腺激素釋放激素(TRH)、CRH和OT，且OT分泌量與抑制進食的效應呈正相關[10-11]。CRH與UCNS肽在中樞和外周均可引起厭食反應[12]。此外，唐亞杰[4]研究表明PVN通過釋放激素、神經肽和神經遞質等物質控制機體炎癥的過度暴發，并對系統性炎癥起到一定的控制作用。同時，PVN在應激及疼痛調節中發揮重要作用[13]。Eliava等[14]研究表明下丘腦PVN投射到腦干和脊髓的OT神經元誘發的OT釋放可抑制炎性疼痛，并起到鎮痛作用。張玉芹等[15]認為，腦細胞癇樣放電時，可能是通過某種途徑激活了下丘腦PVN小細胞內CRH的分泌，促進促腎上腺皮質激素(ACTH)和糖皮質激素的分泌，從而抑制了細胞的免疫功能。

該試驗結果表明，PVN組織結構受損后，可能導致CRH、OT等激素分泌增加，引起厭食行為的發生；當雙耳病變程度較輕時，PVN部分細胞發生病變，可能引起OT表達量的增加，對蟲咬引起的疼痛以及局部發炎引發的炎性疼痛可起到一定的鎮痛或調節作用，但在雙耳病變程度加重時PVN組織結構受損嚴重，使得PVN的神經內分泌功能失調，可能導致OT分泌量減少，使得中樞神經對鎮痛的調節作用減弱；此外，當雙耳病變程度較輕時，兔下丘腦PVN小細胞內CRH分泌量增加，抑制了細胞免疫功能和癲癇痙攣等神經癥狀；隨著病變程度的加劇，兔下丘腦PVN組織結構受損嚴重，導致細胞功能異常，可能導致CRH分泌量減少，對癲癇痙攣的抑制作用減弱，故患兔出現癲癇等神經癥狀；PVN結構受損導致的細胞免疫功能下降及癲癇的發作可能是導致兔死亡的主要原因，但其具體作用機制還有待進一步的研究。

綜上所述，癢螨病患兔下丘腦PVN大、小細胞部損傷程度隨雙耳病變評分的增加而增加。由此可見，兔癢螨不僅可直接引發兔耳部的病理損傷，而且可引起中樞神經系統的病理損傷，但具體調節機制有待進一步的研究。

3.2 癢螨病患兔下丘腦PVN內5-HT表達量的變化5-HT是下丘腦PVN內最主要的神經遞質，參與跟疾病有關的攝食、癲癇、痛覺、鎮靜等臨床反應以及炎癥引發的免疫反應[5-7]。

研究表明，5-HT作為一種重要的瘙癢介質，廣泛存在于腦中，其可通過5-HT1A、5-HT2A、5-HT3、5-HT7等受體參與癢覺調控[16]。5-HT受體廣泛分布于PVN中[8]，PVN中5-HT1A和5-HT1B受體的激活構成了重要的飽腹感信號[5]，可通過刺激PVN中CB1受體抑制5-HT的釋放，發揮一定的抑制攝食作用。Hasler等[17]研究發現5-HT1A受體與癲癇的發生存在著密切的聯系，且可降低腦內5-HT水平，加劇癲癇的發作。

該試驗結果表明，與健康組(0分組)相比，癢螨病患兔PVN大、小細胞部內5-HT的表達量均增加，且患兔出現上述厭食、消瘦、瘙癢、癲癇等臨床表現。雖然與2分組相比，3分組PVN內5-HT表達量減少，但其PVN大、小細胞內5-HT的表達量均高于健康組，推測其原因在于當感染程度較輕時PVN組織結構的損傷亦較輕，機體尚具備自我修復的功能，且通過提高5-HT的表達量來促進機體的自我修復，但病變程度加重時PVN組織結構受損亦嚴重，直接導致5-HT的表達量下降。

下丘腦PVN內5-HT表達量的增加對癲癇有抑制作用；下丘腦PVN內5-HT表達量的減少對攝食具有促進作用。林毅等[18]研究表明色氨酸是5-HT在體內生物合成的前體物質，膳食中添加色氨酸可增加血液和下丘腦內5-HT的表達量。因此，在癢螨病患兔病變較輕時，建議使用5-HT拮抗劑或減少飼料中5-HT合成前體物質色氨酸的添加量，以輔助治療出現的厭食和消瘦等臨床癥狀；當病變較重時，在飼料中適量添加色氨酸，以緩解兔在感染后期出現的癲癇等神經癥狀，但此建議是否可行還需要進一步驗證。

綜上所述，癢螨病可導致兔下丘腦PVN的組織結構受損、5-HT表達量增加，提示下丘腦亦是癢螨病的靶器官之一；同時，5-HT可能參與了癢螨病的發生與發展。